固态药物组合物的重构方法与流程

本发明涉及一种固态药物组合物的重构方法。

发明背景

某些类型的药物活性成分由于经过消化系统后的改变而不能口服施用，因此这类药物通常为非肠道施用，例如静脉内或皮下施用。在这样的情况下，这些药物活性成分必须以液体形式施用。这对于作为大而复杂分子的抗体和其它的蛋白质以及某些化学实体尤其是这样。然而，抗体和其它大的药物活性成分通常在含水环境中具有较差的稳定性，这会将药物组合物的货架期减少到不可接受的值。

因此，就药物的稳定性、存储和易于航运而言，制备固态药物组合物将更有利，这种固态药物组合物其可在患者服药之前不久采用溶剂进行重构。必须以液体形式施用的固态药物组合物(例如通过注射施用)，将使用可接受的溶剂组合物临时溶解，以制备注射液。药物组合物的固体形态包括粉末、冷冻-干燥(或冻干)组合物、喷雾干燥组合物、喷雾冷冻干燥组合物、真空干燥组合物或超临界流体干燥组合物。

取决于重构方法的复杂性，重构步骤可以由病人、亲属、护士或专业保健人员来执行。通常优选采用的重构方法是相对简单的、可重复的，因此将不需要专业保健人员的存在。在治疗慢性病的情况下尤其如此。

虽然对于一些特定组合物，这样的重构可以是直截了当的且短至几秒钟，而对于其它组合物，则可能需要至多数十分钟进行重构。长时间的重构过程涉及一系列复杂的步骤，通常会导致所述操作较低的顺应性，并最终可导致施用错误剂量，并甚至潜在地影响治疗结果。

如此难以重构和/或需要长时间重构的固体，通常具有对于所述溶剂的润湿性差和/或高的最终粘度的共同特点。其他常见的问题是泡沫、气泡的形成，在重构药物组合物的表面产生冠状气泡膜、凝胶或润湿性不良的聚集体，需要更多的时间和注意力对其进行谨慎的重构操作。

对于包含高浓度大分子的药物组合物尤其如此，所述大分子例如但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、某些重组蛋白或多肽、类固醇激素和一些大的化学实体如抗生素。使用比将其朝着固体形式加工过程中最初取出的溶剂体积更少的溶剂体积进行重构时也是如此，因为这是注射用制剂的习惯做法，以使待施用的体积最小化。

就这一点而言，可以参考Pradip Hiwale等的文章[1]，其描述了影响注射用干粉重构时间的因素，并将它们分类为内在参数和外在参数。

在任何情况下，最常规的手工重构固态药物组合物的方法通常需要以下步骤：从第一容器中取出(retrieve)溶剂，将其注入含有所述固态药物组合物的第二容器中，在第二容器内均质液体，使其没有泡沫和/或干的聚集体，并从第二容器取出(withdraw)重构的药物组合物用于施用。

上述每个步骤本身可能需要若干操作对象，包括针或针头(spike)，以及完成规定的过程。

取决于所应用的操作步骤及药物组合物，重构过程可能导致长的重构时间，出现几乎不被溶剂浸润的被截留的干燥结块或凝胶区，出现被截留的气泡或泡沫，无论上述现象出现在整个体积中还是只限于空气/液体界面处的环，和/或重构时间的大变化，以上每一种现象对于药物组合物的重构都是不可接受的。

为了确保正确重构并减少用户之间药物组合物重构过程出现偏差，药物制造商为用户提供“使用说明”活页以指导他们的重构方法。

在大多数情况下，该方法包括：常见的溶剂转移阶段，和对于均质来说若干交织的搅拌/涡旋(swirl)，和静置步骤以使固体润湿，并观察再水化作用，直到在最终取出溶液前实现完全溶解。可能对“要做”或“不要做”的事项给出建议。

此外，药品制造商可能会建议对用户进行培训，被培训者可能是专业人员或患者或亲属或甚至重构仅限专业人员操作。

对于一些冻干的药物组合物，完整的重构时间可能需要长达30分钟。

US 2011/0155620描述了填充有药物组合物粉末的小瓶中的高真空压力或中真空压力(例如100Pa到6×10⁴Pa)帮助存储期间稳定组合物，有助于重构期间溶剂的抽取，证明容器密闭的完整性，可能加快重构过程，并限制泡沫的产生。

WO 00/07539教导了在将溶剂引入容器之前使容器内压力等于大气压力可以降低发泡；通过这种方式，溶剂能以较小的力和较低的速度进入容器。

然而，尽管有上述技术，可以认为，用于施用的药物组合物的重构仍然是相对于时间以及其他特征一个挑战。因此，本领域仍然在需要进一步改善固态药物组合物的重构过程。

发明简述

本发明的目的是提供一种比本领域已知方法更为简便的固态药物组合物重构方法，该方法能够减少重构时间，使重构方式具有更强的可重复性，并且该方法限制重构后的液体组合物中不溶性固体或凝胶和/或气泡的存在。

为此，本发明提供了一种固态药物组合物的重组方法，包括以下连续步骤：

(i)将固态药物组合物提供于密封的容器中，所述容器内的压力为0.5Pa至1.2×10⁵Pa的初始压力p_i；

(ii)在第一时间点t₀将溶剂引入所述密封容器并在受控时间Δt₁期间维持容器内产生的压力p_r；和

(iii)在第二时间点t₂将容器内的压力增加至高于所述产生的压力p_r的受控压力直到完全重构。

根据实施方案，该方法包括在步骤(ii)和/或步骤(iii)后混合溶剂和药物组合物的步骤。

根据实施方案，所述混合是通过溶剂和药物组合物的流体再循环和/或机械混合进行的。

根据实施方案，所述溶剂和药物组合物的机械混合是通过旋转容器来进行的，而容器相对于垂直位置倾斜。

在步骤(i)之前，容器内的压力可被调节至所述初始压力p_i。

根据实施方案，容器中的初始压力p_i为0.5Pa至5×10⁴Pa。

根据实施方案，步骤(iii)中设定的容器压力p₂为1×10⁴Pa至1.5×10⁶Pa。

根据实施方案，所述固态药物组合物为药物组合物的冻干形式。

可替代地，所述固态药物组合物可以是粉末。

根据实施方案，所述溶剂以指向固态药物组合物的射流形式引入容器。

所述方法可进一步包括一个附加步骤(iv)，其中在完全重构之前，在达到步骤(iii)的受控压力p₂后容器内的压力被进一步增加。

所述方法可进一步包括一个附加步骤(v)，其中在完全重构之前，在达到步骤(iii)的受控压力p₂之后容器经受多个压力循环。

根据实施方案，步骤(i)中容器内的初始压力(p_i)为0至6×10⁴Pa并且步骤(ii)中的受控时间Δt₁为10秒至2分钟。所述方法包括一个在步骤(iii)之后，通过流体再循环和/或机械混合方法混合溶剂和药物组合物的步骤。

附图简要说明

基于附图，本发明的其它特征和优点通过下面的详细描述将变得显而易见，其中：

-图1A至1C示意性地阐述了用于产生实施例1的结果的设置。

-图2A至2D阐述了根据本发明的方法的不同实施方案，其中x轴表示时间，y轴表示包含所述药物组合物的容器内压力。应注意的是，虽然这些图以线段绘出，但压力变化可以非线性的方式发送变化，特别是在重构过程中所涉及的不同压力之间进行转换时。

·图2A阐述了根据本发明的实施方案的重构方法的时间范围的实例。

重构过程被认为开始于时刻t₀，其对应于容器中开始引入溶剂的时间点。

刚刚在引入溶剂之前，容器内的压力为初始压力p_i。

所述压力可以是容器在先前存储期间容器内的压力，被称为存储压力p_s。

可替代地，如图2B所示，存储期间容器内的压力可以是一个不同于p_i的压力p_s(或更大或更小)，并且需在重构过程开始之前很短的时间内将压力设定为p_i。

引入容器中的溶剂会稍微改变压力；由此产生的压力被称为p_r。这种产生的压力并不需要被精确量化；然而，在规定的时间Δt₁期间必须保持该产生的压力p_r。

在规定的时间点t₂(对应于t₀+Δt₁)，此时重构尚未完全，容器内的压力增大到p₂，其大于p_i和p_r。

将容器内的压力保持在压力p₂直到观察到完全重构(时间t_rec)。时间t_rec后，可从容器将重构的组合物取出。

·图2B阐述了根据本发明的另一个实施方案的重构方法的时间范围的实例。

相比于图2A的方法，图2B的方法包括一个在p₂下的规定时间之后和观察到药物组合物完全重构之前，进一步增加容器内的压力至压力p₃的附加步骤。

·图2C阐述了一种重构方法的时间范围的实例，所述方法包括，在施加压力p₂之后和施加压力p₃之前，包含连续压力升高和下降的压力循环。

·图2D阐述了图2C所示时间范围的一种变化形式，其仅包含一次压力由压力p₂下降随后升高至压力p₃的过程。

-图3阐述了作为时间函数的聚乙二醇化抗体(赛妥珠单抗(certolizumab pegol))的片段的冻干制剂用注射用水重构的时间，所述时间是在其期间引入注射用水后在容器中维持产生的压力的时间。

-图4A至4E阐述了，对于容器内不同的初始压力，作为时间函数的聚乙二醇化抗体(赛妥珠单抗)的片段的冻干制剂用注射用水重构的时间，所述时间是在其期间引入注射用水后在容器中维持产生的压力的时间。

-图5阐述了采用以下方法，聚乙二醇化抗体(赛妥珠单抗)的片段的冻干制剂用注射用水进行重构时，其重构时间之间的比较：

(a)按照实施例3描述根据本发明的重构方法；

(b)根据US 2011/0155620所述的，一种重构方法，其中通过溶剂引入和涡旋过程中保持产生的真空直到重构完成的方法；

(c)一种按照包装中提供的使用说明进行重构的方法。

图6A显示了三个重构之前的赛妥珠单抗小瓶。这些小瓶随后将根据图5描述的三种重构方法进行重构：(a)左边小瓶，(b)中间小瓶，(c)右边小瓶。

图6B、6C、6D、6E和6F阐述了小瓶内容物在如图5所述的三种重构过程期间不同时间的外观状态：(a)左边小瓶，(b)中间小瓶，(c)右边小瓶。

发明详述

通过提供一种新的固态药物组合物的重构方法，本发明解决了发明背景部分提出的问题。

如此，在第一实施方案中，本发明涉及一种固态药物组合物的重构方法，包括以下连续步骤：

(i)将固态药物组合物提供于密封的容器中，所述容器内的压力为初始压力p_i；

(ii)在第一时间点t₀将溶剂引入所述密封容器并在受控时间Δt₁期间维持容器内产生的压力p_r；和

(iii)在第二时间点t₂将容器内的压力增加至高于所述产生的压力p_r的受控压力p₂直到完全重构。

如本文所用的术语“重构”或“固态药物组合物的重构”指通过添加溶剂使固态药物组合物转化至液体状态。

本文使用的“重构时间”指的是固态药物组合物与溶剂经过如上所定义的重构所消耗的时间。

如本文所用的药物组合物的术语“固态”是：粉剂，喷雾干燥组合物或冻干(或冷冻干燥)组合物。

如本文所用的“完全重构”是指一种状态，其中容器中的药物组合物的90％，或可替代地95％、96％、97％、98％、99％、99。5％、或者99。9％处于液态。

如本文所用的“容器”是指用于容纳、存储、运输或以其他方式处置药物组合物的物品。广泛用于制药工业的容器类型是小瓶，尽管本领域技术人员能够提供适用于这样的目的的其它装置。

如本文所用的术语“溶剂”是指将溶解溶质得到溶液的物质。合适的溶剂包括，例如注射用水(WFI)，它被广泛地用作重构药物组合物的溶剂。然而，溶剂可包含通常用于注射液的合适的缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐、组氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或乳酸盐缓冲剂。在其他情况下，缓冲剂可能没有必要，并且盐水溶液或者例如5％的葡萄糖溶液、生理盐水和抑菌水也是本领域中常用的溶剂。

通常来说，含有固态药物组合物的容器处于紧闭状态，以在存储或装运期间保持所述药物组合物无菌。例如，小瓶通常由隔膜关闭并由压接件密封。在本发明的一个实施方案中，用于重构所述药物组合物的溶剂通过刺穿隔膜的针或针头注入。可替代地，也可以采用基本上不影响容器内压力的任何其他引入溶剂的方式，诸如小瓶适配器和/或组合注射器适配器，包括旋塞阀或合适的阀门，或本领域技术人员公知的其他技术手段。

根据具体实施方案，初始压力p_i为0.5Pa至1.2×10⁵Pa，或者p_i为5×10³Pa至1×10⁵Pa、1×10⁴Pa至8×10⁴Pa、2×10⁴Pa至7×10⁴Pa、3×10⁴Pa至6×10⁴Pa或4×10⁴Pa至5×10⁴Pa。例如，如果所述固态组合物是冻干组合物，它可通过冻干获得，容器内的压力可以已鉴于冻干组合物的贮存被设置为给定的压力。这个压力可能足以启动本发明的方法。因此，在本发明的具体实施方案中，p_i包括0.5Pa至2×10⁴Pa，可替代地0.5Pa至1×10⁴Pa、10Pa至1×10⁴Pa、100Pa至1×10⁴Pa、100Pa至1×10³Pa、100Pa至5×10³Pa或2×10³Pa至1×10⁴Pa或5×10³Pa至1×10⁴Pa。在其他情况下，容器可以设定为更高或更低的压力，因此在另一个实施方案中p_i是3×10⁴Pa至6×10⁴Pa，或者4×10⁴Pa至5.5×10⁴Pa，或4.75×10⁴Pa至5.5×10⁴Pa。

可替代地，在容器存储过程中容器内的压力p_s可以与重构方法的第一步所需要的初始压力p_i不同。因此，在本发明的另一实施方案中，在开始重构过程之前容器内的压力被设定初始压力p_i。容器内的压力可以通过例如向容器内吸出或注射一定量的空气进行设置。

本发明并不限于低于大气压(即大约1×10⁵Pa)的初始压力p_i，而也可以被应用于封闭在容器中的固态药物组合物，其中初始压力是大气压或高于1×10⁵Pa。

作为向容器引入一定体积溶剂的结果，容器内的压力可能会稍微有所变化。特别是，由于气体体积减小，产生的压力p_r趋向于随着p_i一起增加，并且所述溶剂本身潜在释放的气体自身可能会进一步使产生的压力随着p_i一同增加。

在规定时间Δt₁期间将容器内压力维持在所述产生的压力p_r。

这在需更在引入溶剂的过程中保持容器的密封。

根据具体实施方案，所述溶剂以指向固态药物组合物的射流形式引入。

如本文所用的术语“射流”指的是液体由小的开口挤出快速液流，所述开口可以是针的开口或针头的开口。

根据另一个实施例，所述溶剂以指向容器壁的射流形式引入。

取决于每种药物组合物，在引入溶剂后的规定时间Δt₁期间压力维持在所述产生的压力p_r。

在本发明特定实施方案中，Δt₁为1秒至2分钟、或2秒至1.5分钟、或1秒至1分钟、或1秒至50秒、或15至45秒，可选地20至40秒、或20至30秒。

存在最佳时间Δt₁，其取决于药物组合物，其允许抽取溶剂进入仍然干燥的固体部分和/或减少由于相对压力增加而被截留的空气包括气泡的体积。

因此在本发明具体实施方案中，步骤(ii)中的受控时间Δt₁被确定为对应于代表作为时间Δt₁的函数的总重构时间t_rec的曲线的最小的值，在Δt₁期间容器内压力从引入溶剂开始维持在所述产生的压力。

根据本发明所述的重构方法的一个优点是，与本领域已知的重构方法相反，本发明重构后的药物组合物表面上很少或几乎没有冠状气泡。这些气泡和/或泡沫的减少导致容器中有效组成的回收率增加，因此需要就给定的回收量/剂量目标(retrieval/dose objective)，降低生产容器中的固态的药物组合物的起始量。

该时间Δt₁之后，容器内压力增大到压力p₂，其比上文描述的产生的压力p_r更大。

例如，如果引入溶剂后容器内的压力p_r低于大气压时，则压力p₂可设置为大气压。

在本发明的具体实施方案中p₂至少为1.5×p_i。

例如，如果初始压力p_i大致稍稍低于大气压如0.98×10⁵Pa并且p₂为1.5×10⁵Pa，略微超过注射器可获得的压力，则大多数患者的情况是p₂超过1.5×p_i(即假设当地大气压约1×10⁵Pa)。可替代地，如果初始压力p_i是0.3×10⁵Pa并且p₂为大气压，则大多数患者的情况是p₂超过3×p_i(即假设当地大气压约1×10⁵Pa)。在另一实例中，如果初始压力p_i为100Pa并且p₂是大气压，则大多数患者的情况是p₂大约为1000×p_i(即假设当地大气压约1×10⁵Pa)。在又一实例中，如果初始压力p_i为10Pa，这在普通的冷冻干燥药物容器中很容易实现，并且p₂是大气压，则大多数患者的情况是p₂容易约为1×10⁴×p_i(即假设当地大气压约1×10⁵Pa)。

这个增加的压力p₂将被维持直到所述固态药物组合物实现完全重构。

重构的组合物可以随后立即使用或于适当的条件下存储较短时间。

任选地，在本发明的另一个实施方案中，重构方法包括一个混合溶剂和药物组合物的附加步骤。

所述混合可以促进溶剂与药物组合物的重构，也可能会导致额外的气泡破裂。因此该附加步骤可导致重构时间的进一步减少和/或顶上泡沫环的减少和/或气泡的减少。

在本发明的一个具体实施方案中，所述混合可以通过溶剂和药物组合物的流体再循环来进行。这种流体再循环通过抽吸和排放容器内的混合物使流体位移。当混合物的粘度低时这种混合方式是有效的，例如低于150厘泊，低于100厘泊，低于90厘泊，低于80、70或60厘泊，优选低于50厘泊和/或固态物质不会堵塞流体再循环系统。

然而，当混合物的粘度高，或当固态干聚集体使这种流体再循环难以实现时，所述混合可以通过机械混合有效进行，这样混合物将由于重力、容器内引入异物的加速或运动的作用，在容器内被移动和剪切。因此，在本发明的另一替代实施方案中，在溶剂中混合药物组合物的步骤是通过机械混合进行的。

例如，相对于垂直位置以一定的倾斜角度旋转容器，或对容器进行涡旋，这些方法属于机械混合方法。旋转可以是连续的或不连续的。

在本发明的进一步的实施方案中，混合溶剂和药物组合物的步骤可以组合采用流体再循环和机械混合两种方式，所述组合可以任何顺序同时和/或分开进行。

在具体实施方案中，这样的混合步骤可以在容器中引入溶剂之后，在容器内的压力提高到p₂之前进行。可替代地，混合步骤可以在容器内的压力已经被增加到p₂之后进行。在另一个具体实施方案中，混合步骤可以压力提高到p₂之前和之后进行。

如本领域技术人员所理解的，根据本发明所述方法的步骤可以手动操作，或者也可在自动装置或系统的帮助下进行。

在又一实施方案中，根据本发明的任何实施方案的所述方法包括在规定的p₂时间之后和药物组合物的完全重构之前，进一步增加容器内的压力至p₃的附加步骤。

在一个实施方案中，如果p_i和p_r低于大气压，即1×10⁵Pa时，并且p₂为大气压，则p₃可以是1.5×10⁵Pa至1.5×10⁶Pa。

在本发明的一个具体实施方案中p₃至少为1.5×p₂。

在本发明的又一实施方案中，根据本发明的任何实施方案的所述方法，包括在升高至压力p₂后和升高至压力p₃之前应用包含连续压力增加和减少的压力循环的附加步骤。这种附加的压力循环可除去大部分剩余的气泡和和/或泡沫。

在本发明的一个附加的实施方案中，这些压力循环步骤与混合步骤同时和/或交替应用。事实上，压力变化和混合步骤有利于气泡的聚结和去除。

为了进一步帮助理解根据本发明所述方法的不同实施方案，本申请已经包括图2A至2D。如本领域技术人员应理解的，其它时间范围也是可能的，条件是在规定的时间Δt₁期间保持由引入溶剂产生的压力，然后增加瓶内压力。

在本发明的具体实施方案中，待重构的固态药物组合物是冻干组合物。

在另一个实施方案中，所述固态药物组合物包含生物部分例如重组蛋白、抗体或类固醇激素。在进一步的具体实施方案中，所述生物部分包括单克隆抗体、多克隆抗体或其抗原结合片段。

如本文所用的术语“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。如本文所用术语“抗体”包括但不限于通过本领域中已知重组技术产生的重组抗体。“抗体”包括任何物种的抗体，特别是哺乳动物物种；如任何同种型的人抗体，包括IgA1、IgA2、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE和IgM以及它们的改性变体，非人类灵长类动物的抗体，例如来自黑猩猩、狒狒、恒河猴或猕猴；啮齿动物抗体，例如来自小鼠、大鼠或兔；羊或马抗体；以及骆驼科动物抗体(例如来自骆驼或美洲驼，如Nanobodies^TM)及其衍生物；或鸟类物种如鸡抗体，或鱼类物种如鲨鱼抗体。术语“抗体”还指“嵌合”抗体，其中至少一个重链和/或轻链抗体序列的第一部分来自第一物种，并且重链和/或轻链抗体序列的第二部分来自第二物种。本申请适用的嵌合抗体包括“灵长类”抗体，包括来自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，如狒狒，恒河猴或猕猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。“人源化”抗体是含有来自非人类的抗体序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被替换为来自非人类物种(供体抗体)高变区[或互补决定区(CDR)]的残基，非人类物种诸如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类，具有所需特异性、亲和力和活性。在大多数情况下，CDR以外的人(受体)抗体残基，即框架区(FR)残基，被额外地由相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中均不存在的残基。这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。人源化降低了非人类抗体在人体内的免疫原性，从而有利于抗体在治疗人类疾病中的应用。人源化抗体及其若干不同的制备技术在本领域中是公知的。术语“抗体”还指人抗体，其可以作为人源化抗体的替代品。例如，有可能生产转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫方面能够在无内源性鼠抗体生成的情况下，产生完整的人抗体库(repertoire)。例如，已有报道描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失，导致内源性抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转入人种系免疫球蛋白基因阵列，将导致携带人类种系免疫球蛋白基因的转基因动物针对特定抗原产生具有免疫特异性的人抗体。用于生产这种转基因动物的技术和用于从这些转基因动物中分离和生产人抗体的技术，在本领域中是公知的。可替代地，在转基因动物例如小鼠中，只有编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因被替换为相应的人类可变免疫球蛋白基因序列。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。通过这种方式，抗体效应子在转基因小鼠的免疫系统中依然发挥作用，并且因此B细胞的发育基本上保持不变，这可能会导致体内抗原性攻击后改良的抗体反应。一旦编码特定目标抗体的基因从所述转基因动物中分离出来，其编码恒定区的基因可替换为人恒定区基因，以获得完全的人抗体。用于体外获得人抗体/抗体片段的其它方法基于展示技术，如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中所使用的重组DNA文库，要么至少部分产生自人工产生，或来自供体免疫球蛋白可变(V)结构域基因库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术在本领域中是公知的。人抗体也可以由分离的人B细胞产生，这些细胞离体采用目标抗原进行免疫反应，并随后融合以产生杂交瘤，然后可以筛选杂交瘤获得最佳的人抗体。如本文所用的术语“抗体”，也指非糖基化的抗体。

如本文所用的术语“抗体”也指抗体片段。如本领域中所知的，抗体片段包含至少一个重链或轻链免疫球蛋白结构域并结合抗原。根据本发明的抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂以及Fv和scFv片段；以及双抗体；三抗体；四抗体；微型抗体；结构域抗体(dAbs)，如sdAbs、VHH和VNAR片段；由抗体片段或抗体形成的单链抗体；双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv或Fab-Fv-Fv构建物。如上所定义的抗体片段在本领域中是已知的。

在本发明的某些实施方案中，抗体是这样的抗体，其由官能团部分的共价附接而修饰，如水溶性聚合物，如聚(乙二醇)、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)或聚(脯氨酸)——所有这些官能团已知均能够使抗体相对于未修饰的蛋白，在静脉注射后进入血液中具有更长的半衰期。

在一些实施方案中，本发明的抗体是连接到官能团部分的，如聚(乙二醇)(PEG)部分的抗体。在一个具体的实施方案中，所述抗体是抗体片段，并且PEG分子可以通过任何可用的氨基酸侧链或位于抗体片段末端的氨基酸官能团，例如任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基进行附接。这些氨基酸可以在抗体片段中天然存在，或者可以使用重组DNA方法(例如参见US 5219996；US 5667425；WO 98/25971)将其加入工程化入片段。在另外的实施方案中，本发明的Fab片段是通过向其重链的C-末端添加一个或更多个氨基酸进行修饰，以附接官能团部分。优选地，所述附加的氨基酸形成了一个含有一个或多个半胱氨酸残基的改性铰链区，所述官能基团可以附接此区域。可采用多个位点附接两个或多个PEG分子。

在本发明的某些方面，PEG分子通过位于本发明所述抗体片段的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。每个附接到经修饰的抗体片段的PEG分子可以共价连接到位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。所述共价键一般是一个二硫键，或特别情况下是硫-碳键。其中巯基被用作活化官能部分的附接点，合适的官能部分例如硫醇选择性衍生物(如马来酰亚胺)和半胱氨酸衍生物也可使用。在如上所述的PEG修饰抗体片段的制备方面，活化PEG可以用作起始原料。活化PEG可以含有巯基反应基团如一个α-卤代羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺、例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物。在某些实施方案中，抗体缀合物可包含两个具有两个马来酰亚胺分子的PEG分子。起始原料可以购买获得，或者可采用常规化学方法利用可商购的原料制备。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺和M-PEG-SPA。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是修饰的PEG化Fab片段，即根据一定方法例如EP 0948544中公开的方法，与PEG(聚(乙二醇))共价附接。在一个实例中PEG被连接到铰链区中的半胱氨酸。在另一实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接到改性铰链区中单个硫醇基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可被共价连接至马来酰亚胺基团，并且每个赖氨酸残基上的胺基均可附着分子量约20000道尔顿的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此附接到Fab片段的PEG的总分子量可以达到大约40000道尔顿。

在另一个实施方案中，官能部分是PEG，并采用WO 98/25971和WO 04/721 16中描述的方法进行附接，由此赖氨酰-马来酰亚胺基团在重链的C-末端附接至半胱氨酸残基，并且赖氨酰残基的每个氨基均已共价连接至分子量约20000道尔顿的甲氧基聚(乙二醇)残基。因此附接到抗体的PEG的总分子量大约是40000道尔顿。

在另一个实施方案中，官能部分是PEG，并采用WO 98/25971和WO 04/72116中描述的方法附接至F(ab)2片段，由此赖氨酰-马来酰亚胺基团在Fab重链的C-末端附接至半胱氨酸残基，并且赖氨酰残基的每个氨基均已共价连接至分子量约20,000道尔顿的甲氧基聚(乙二醇)残基。因此附接到F(ab)2抗体的PEG的总分子量大约是40000道尔顿。

在本发明的某些实施方案中，本发明的抗体是Fab′抗体片段，其可以是完全人抗体或人源化抗体，并且是PEG化的，无论是重链、轻链或两者皆有。在其他实施方案中，所述抗体片段可以是完全人抗体片段的或人源化抗体片段，并且对一条或两条重链、或对一条或两条轻链、或对重链和轻链二者进行PEG化。

因此，在某些实施方案中，抗体是PEG连接的抗体(例如，PEG连接的人抗体)，其中PEG被连接至半胱氨酸或赖氨酸残基。在某些实施方案中，PEG化的抗体具有至少24kD的流体动力学直径。在其他实施方案中，PEG的流体动力学直径范围是20至60kD(含)。在进一步的实施方案中，所述PEG连接的抗体具有至少200kD的流体动力学直径。在本发明的将抗体连接至PEG部分的实施方案中，聚乙二醇化的抗体相对于缺少PEG部分的抗体在体内具有增加的半衰期。

术语“聚乙二醇化”、“聚乙二醇”或“PEG”包括聚亚烷基二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶联剂或以偶联或活化部分(如以巯基、三氟甲磺酸酯、三氟乙基磺酸酯、氮丙碇、环氧乙烷，或者优选以马来酰亚胺基团，例如PEG-马来酰亚胺)衍生。其他合适的聚亚烷基二醇化合物包括但不限于，马来酰亚胺基单甲氧基PEG、活化的PEG聚丙二醇，其它带电荷的或中性聚合物包括以下类型：葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸，或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物，以及生物素和其它亲和试剂衍生物。

其它可能提高本发明所述抗体的体内完整性和长效性的有用官能部分包括多肽。例如，本发明的抗体或抗体片段可以采用包括人血清白蛋白(HSA)多肽进行修饰。相比于非缀合的抗体或抗原结合片段，这样的抗体缀合物可表现出增加的稳定性和增加的血清半衰期。例如，在某些实施方案中，缀合至HSA的抗体相对于非缀合抗体可以表现增加的体内半衰期。HSA缀合抗体的半衰期(tα-或tβ-半衰期)可以增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。例如，tα-半衰期可以是0.25分钟至12小时的范围内，而tβ-半衰期可以是12-48小时内。tα-或tβ-半衰期优选至少3天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天、至少1个月以上。

在本发明的一些实施方案中，本发明所述抗体是通过用可检测标记物进行标记来以官能部分修饰的抗体，例如放射性同位素、酶、染料或生物素、或其它亲和试剂。

在本发明的一些实施方案中，本发明所述抗体是通过缀合至治疗剂来以官能部分修饰的抗体，例如放射性同位素或放射性核素(例如，111铟或90钇)，毒素部分(例如，破伤风类毒素或蓖麻毒素)，类毒素或化疗剂(US 6307026)。

在本发明的一些实施方案中，本发明所述抗体是通过缀合至成像剂修饰的抗体。成像剂可以包括例如标记部分(例如，生物素、荧光部分、放射性部分、组氨酸或myc标签或其他肽标签)，以便于分离或检测。

用于修饰或缀合本发明所述抗体的官能部分的进一步的实例，可以包括血清毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatin)、多拉司他汀(dolastatin)、埃博霉素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、类美登素(maytansinoid)、海绵抑制素(spongistatin)、根霉素(rhizoxin)、软海绵素(halichondrin)、杆孢菌素(roridin)、哈米特林(hemiasterlin)、紫杉醇、细胞松弛素(cytochalasin)B、短杆菌肽(gramicidin)D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌二酮、米托蒽醌、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

有用的偶联官能部分包括但不限于抗叶酸(例如，氨基蝶呤和甲氨蝶呤)，抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴(5-fluorouracil decarbazine))，烷化剂(例如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)、刺孢霉素或多卡米星、CC-1065、enedieyenes、新制癌菌素)，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。

其它官能部分可包括螯合的放射性核素，如131碘、111铟和90钇、镥177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188、211砹；或药物，例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷类和苏拉明。

其它官能部分包括蛋白、肽和酶。适用的酶包括但不限于蛋白酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。目标蛋白、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白，毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、类美登素(例如但不限于DM1)，蛋白例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化剂，血栓形成剂或抗血管生成剂，例如血管抑素或内皮抑素、血管生成素、白树毒素、海兔毒素、小沟结合剂、双-ido-苯酚芥子气，或生物应答修饰物如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子。

其它官能部分可以包括例如在诊断方面有用的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子放射断层摄影)、和非放射性顺磁金属离子。可以缀合至抗体用于诊断的金属离子一般参见US4741900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括萤光素酶、荧光素、水母蛋白；以及合适的放射性核素包括125碘、131碘、111铟和99锝。

如下描述的实验结果将显示，根据本发明的重构方法相比于本领域中已知的其它方法显著更加快。

实际上，在特定实施例中，根据本发明所的重构方法仅需大约10分钟或更少的重构时间，而其他已知方法需要超过20分钟的重构时间。

实验结果

实施例1

图1A-1C例证了本发明的具体实施方案，其中固态药物组合物被包含在用隔膜11和金属压接件10密封的小瓶1中。在这种情况下，如图1A所示，溶剂随后使用具有附接针头20的注射器2引入瓶中，其中针头20穿过隔膜11，容器1处于直立位置。

在上文图1A所示实施例中，所述溶剂也可以通过合适的射流方式进行注射，具体通过以下方式实现，将含有溶剂的注射器的针头深插入隔膜，直到靠近固体的位置，对溶剂施以高压使其通过针头高速转移入容器内。之后可以观察到，在溶剂注入过程中润湿的固体呈环状固体或破碎的固体。

在此实施例中，初始压力p_i和溶剂注射后产生的压力p_r均低于大气压。在本实施例中，溶剂注射后，针头和注射器保持在小瓶中，以避免任何泄漏和外界空气进入并维持产生的压力p_r。因此如图1B所示，将容器内压力p₂设定至大气压可以简单地通过采用连通大气压的中空针头3刺穿容器1的隔膜来完成。

在图1C中，根据本发明实施方案之一的方法包括对溶剂与固态药物组合物进行机械混合的附加步骤。在这种情况下，容器1倾斜至约45°，并沿其纵向轴线旋转。该角度有助于在低剪切力下混合该混合物，并且有助于容器壁上附着的干燥固体形式上湿溶液的浸出，从而回收更多的干燥固体形式，并因此提高总回收率。

实施例2

在该特定情况下，本发明的方法被用于重构冻干赛妥珠单抗，一种聚乙二醇化的抗体片段(Fab′)。

当进行以下方法时，重构时间缩短到约10分钟：

-提供200毫克冻干形式的赛妥珠单抗，可从药品制造商获得，其存储小瓶的压力大约600Pa；

-将来自具有20号针头的注射器的注射用水，以对准冻干饼的中心的射流快速注入直立位置的小瓶，而没有释放产生的部分真空压力；

-将小瓶以直立位置静置；

-从小瓶开始引入WFI后20至30秒后释放小瓶内的压力至大气压力；

-将小瓶以直立位置静置直到完全重构。

如本文所用的术语“饼”是指容器中由冻干处理获得的固体。

实施例3

在该特定情况下，本发明的方法被用于重构冻干赛妥珠单抗，一种聚乙二醇化的抗体片段(Fab′)。

当进行以下方法时，重构时间缩短到平均为8分钟甚至低至6分钟：

-提供200毫克冻干形式的赛妥珠单抗，可从药品制造商获得，其存储小瓶的压力大约600Pa；

-将来自具有1英寸的20号针头的注射器的1mL注射用水(WFI)，以对准冻干饼的中心的射流快速注入直立位置的小瓶，而没有释放产生的部分真空压力；

-将小瓶以直立位置静置；

-从小瓶开始引入注射用水后20至30秒后释放小瓶内的压力至大气压力；

-将小瓶以直立位置静置20秒；

-将小瓶倾斜45°以1～2转/秒的速度旋转直到完全重构。

当无需放大、通过小瓶目视观察监测时，一旦药物组合物完全透明至乳白色或淡黄色，并且基本不存在固体或润湿不佳现象或者不含凝胶部分或悬浮体中的微粒，则认为药物组合物完成重构。

对于当前的赛妥珠单抗重构实施例，一旦将WFI加入到小瓶中，在压力提高到大气压水平之前使用不同的时间Δt₁，以按照如下所述方法确定最佳时间Δt₁。因此，时间Δt₁＝0对应于溶剂刚刚引入后真空的释放。申请人已经注意到，在这种情况下重构时间与在溶剂引入之前真空被释放(参见实施例4)基本相同，但在后一种情况下在重构过程结束时仍留有较多稳定气泡，导致重构质量更低。

图3显示了最佳时间Δt₁的确定方法，在Δt₁期间必须保持由引入溶剂产生的压力p_r，以最小化赛妥珠单抗的重构时间t_rec。

由图3可以证实，重构时间作为时间Δt₁的函数以U形曲线发生变化。

此U形曲线的最低点定义了最佳时间Δt₁。虽然这里没有清楚地显示，但是Δt₁受不同混合方案的影响较小。然而，可以确定的是，可以在时间Δt₁后增加压力而不是严格在最佳时间点增加压力，这不会对重构时间产生显著恶劣影响，其中Δt₁为该最佳的时间的80～120％。

实施例4

在该特定情况下，本发明的方法被用于重构冻干赛妥珠单抗，一种聚乙二醇化的抗体片段(Fab′)。

进行以下方法：

-提供200毫克冻干形式的赛妥珠单抗，可从药品制造商获得，其存储小瓶的压力为不同的初始压力水平；

-将来自具有1英寸的20号针头的注射器的1mL注射用水(WFI)，以对准冻干饼的中心的射流快速注入直立位置的小瓶，而没有释放产生的部分真空压力；将WFI引入到小瓶后立即测量时间基准t＝0；

-一旦将WFI加入到小瓶中，在压力提高到大气压水平之前使用不同的时间Δt₁，以按照如下所述方法确定最佳时间Δt₁；

-以45°角轻轻旋转小瓶1分钟(手动旋转约30转)，使WFI与固体饼完全接触；

-将小瓶以静止直立位置静置于工作表面上，直到从t＝0时间开始已经过去2分钟；

-拿起小瓶并再次以45°角轻轻旋转小瓶1分钟(手动旋转约30转)，确保WFI与固体物料接触；

-将小瓶以静止直立位置静置于工作表面上，直到从t＝0时间开始已经过去4分钟；

-拿起小瓶并再次以45°角轻轻旋转小瓶1分钟(手动旋转约30转)，确保WFI与固体物料接触；缓慢颠倒小瓶两次(例如上下颠倒并来回两次)；

-将小瓶以静止直立位置静置于工作表面上；

-当自t＝0时间开始已经过去10分钟时，拿起小瓶并再次以45°角轻轻旋转小瓶约1分钟(手动旋转约30转)，确保WFI与固体物料接触；缓慢颠倒小瓶两次(例如上下颠倒并来回两次)；

-将小瓶以静止直立位置静置于工作表面上；

-观察小瓶以确定是否已经实现完全重构。

当无需放大、通过小瓶目视观察监测时，一旦药物组合物完全透明至乳白色或淡黄色，并且基本不存在固体或润湿不佳现象或者不含凝胶部分或悬浮体中的微粒，则认为药物组合物完成重构。组合物实现完全重构的时间标记为t_rec。

如果在t＝15分钟时仍未实现完全重构，拿起小瓶并以45°角轻轻旋转小瓶1分钟(手动旋转约30转)，确保WFI与固体物料接触；并缓慢颠倒小瓶两次(例如上下颠倒并来回两次)；将小瓶以静止直立位置静置于工作表面上，并观察以确定完全重构的时间。如果需要的话，进一步每5分钟进行旋转和倒置操作，直到实现完全重构。

图4A至4E显示了最佳时间Δt₁的确定方法，在Δt₁期间必须保持由引入溶剂产生的压力p_r，以最小化赛妥珠单抗的重构时间t_rec，其中小瓶的初始压力分别为：3.5Pa、650Pa、10000Pa、25000Pa、50000Pa。

由图4A至4E可以证实，对于初始压力低于25000Pa，重构时间作为时间Δt₁的函数以U形曲线发生变化。还可以观察到，随着小瓶初始压力的增加，U形曲线变得更加平坦，并且重构时间t_rec增加。然而，在此实施例中，与图3不同，图4A至4E中Δt₁＝0绘制的数据点对应于所述小瓶正好在溶剂引入之前先被平衡至大气压的情况。

图5显示了采用以下方法重构冻干赛妥珠单抗产生的重构时间t_rec：

(a)根据本发明的一个实施方案，如以上实施例3中所述的重构方法，

(b)本领域已知的重构方法，其中所述小瓶初始压力被设定为约600Pa，并且容器内的压力在溶剂注射后没有任何增加，直到完全重构。为此，针和注射器被保持在小瓶中以避免完全重构之前的任何泄漏，和

(c)根据赛妥珠单抗生产商当前提供的使用说明的重构方法，其中在溶剂以对着容器壁的方式加入并且因为针头在涡旋操作前拔出而部分失去初始低压时获得产生的压力下进行重构。

为了进一步澄清起见，该冻干药物组合物的包装中提供的活页包含以下说明，其操作需采用“合适的无菌技术”与运输包装提供的组件(装有无菌注射用水的小瓶，USP(1ml)，一次性使用的塑料注射器，20号重构针)配合执行：

-用新开封的20号针以1mL无菌注射用水(WFI)重构小瓶中的冻干无菌WFI应指向瓶壁而不是直接指向

-在不摇动的情况下轻轻涡旋的小瓶约一分钟，确保所有粉末接触到无菌WFI。涡旋应尽可能轻柔，以避免产生泡沫；

-只要观察到末溶解的颗粒则继续每5分钟进行一次涡旋。完全重构时间可能需要长达30分钟。最终的重构溶液应该透明至乳白色、无色至淡黄色液体，并且基本不存在颗粒。

所述活页规定，冻干粉应该由专业保健人士进行制备。

通过比较图5中的重构时间可以清楚地发现，根据本发明所述的重构方法(a)提供最短的重构时间。

另外，方法(a)中重构时间的变异性被显著降低。

图6A-6F显示了本实施例中使用的三个小瓶在不同重构过程的不同时间的目视外观，其中左边小瓶按照如上所述的方法(a)制备，中间小瓶按照如上所述的方法(b)制备并且右边小瓶按照如上所述的方法(c)制备。

观察到有效的湿润作用时，容器内混合物的水平线迅速变得较低，而其在刚刚引入溶剂后是高的(则混合物的体积应考虑为固体的体积和溶剂的体积之和)。事实上，水平线的下降表明固体已被溶剂润湿，溶剂填充了固体颗粒之间的空隙。所得到的溶液也可能迅速地呈乳状或泡状凝胶，而不是在溶剂中大块干饼。

图6A的图像比例已经相对于图6B、6C、6D、6E、6F进行过调整，以便查看整个小瓶。

图6A显示了刚刚引入溶剂之前的三个小瓶(t₀)。

在所有三种情况下，小瓶的内容物均为不透明白色。

图6B显示了从引入溶剂后1分钟时的三个小瓶(t₀+1min)。

在小瓶(a)(根据本发明的方法)的情况下，瓶内压力在Δt₁＝30s时释放。

在此阶段的末期，小瓶(a)相比小瓶(b)和(c)在目视外观方面具有显著差异。在小瓶(a)中，溶液已经具有半透明的外观，没有泡沫，而在小瓶(b)和(c)中观察到了大量的泡沫。在小瓶中(b)和(c)中，除了泡沫，可以看到很大一部分原始冻干饼仍保持未润湿状态。

图6C显示了从引入溶剂后4分钟时的三个小瓶(t₀+4min)。

小瓶(a)中的溶液基本上是透明的并且总体均质，仅在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上有少量中等和大的气泡。重构被认为基本完成。

在小瓶(b)和(c)中，溶液主要是半透明的，在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上有大量气泡，并且存在大部分的润湿不良的聚集体。

图6D显示了从引入溶剂后10分钟时的三个小瓶(t₀+10min)。

小瓶(a)中的溶液总体透明均质，仅在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上有少量气泡。重构被认为在T₀+8分钟时完成，此时停止对小瓶进行操作，如旋转或涡旋。该时间点的图像没有包括在附图中。

在小瓶(b)和(c)中，溶液主要是透明的，但半透明聚集体悬浮于溶液中；此外，在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上仍有大量气泡。瓶(c)仍然仍然显示被认为是泡沫环。

图6E显示了从引入溶剂后20分钟时的三个小瓶(t₀+20min)。

小瓶(a)中的溶液类似于图6D中溶剂引入后10分钟时的溶液。

在小瓶(b)中，溶液主要是透明的，但仍可见半透明聚集体(比图6D更小)悬浮在溶液中，并且在小瓶底部也可观察到凝胶。

在小瓶(c)中，溶液主要是透明的，但在小瓶底部可以看到半透明聚集体；此外，在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上仍有大量小气泡，这些小气泡由泡沫环演变而来。放大后可以观察到溶液的主体也含有一些在小瓶底部的小气泡和凝胶。

图6F显示了从引入溶剂后25分钟时的三个小瓶(t₀+25min)。

小瓶(a)的溶液看上去类似于图6E。

在小瓶(b)中，溶液主要是透明的，但在小瓶底部仍可见小的半透明聚集体。

在小瓶(c)中，溶液主要是透明的，但在小瓶底部仍可见小的半透明聚集体。此外，在与所述小瓶壁相接触的溶液表面上仍有大量小气泡。

有趣的是，还可注意到的是，在(a)至(c)的所有方法中，引入容器中的溶剂体积均小于冻干过程中从液态药物组合物中取出的溶剂体积。

参考文献

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