本发明提供了包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和抗生素磷霉素(fosfomycin)作为其主要成分的组合物，其用于治疗身体皮肤或膜的伤口、溃疡、疮(sore)、烧伤和其他损伤。因此，其与内科学及外科学、创伤学和烧伤学领域中的皮肤病学和护理领域相关。
背景技术：
伤口愈合
伤口愈合是活体动物的正常特性，并且是涉及多种类型细胞和细胞外基质的动态、互动过程，其速度和效率取决于多种内部及外部因素。可将正常的愈合过程依照包含1)止血、2)炎症、3)增殖和4)重塑的程序化的四个阶段来进行描述。
1)止血是在损害后立刻发生并且通常持续长达数小时的血管应答期。开始时伤口会出血，但血液凝固和血管收缩重建止血，同时凝固的血液为细胞迁移提供临时的细胞外基质。
2)炎症通常开始于受伤时，并且在正常愈合过程中的3-4天内结束。在临床上通过炎症的经典体征和症状(例如热、红、肿和痛)来识别炎症阶段。伤口开始渗出流体(其有助于移除组织碎片)，并且将蛋白酶释放到伤口区域中。白细胞和巨噬细胞开始在病变中聚集以清除碎片：巨噬细胞释放的生长因子刺激成纤维细胞。在该阶段中构建细胞外基质。炎症总是存在，而细菌的进入可从定殖过渡至临床感染以加剧炎性阶段消退的任何延迟。
3)增殖通常在炎性阶段之后继续，并且其特征是成纤维细胞的增殖和迁移以及结缔组织的产生。其在创伤发生之后约4天开始，并且在通常愈合闭合的伤口中持续2-3周。在具有严重组织损伤的开放性伤口中，该阶段可显著延长，在此情况下完全闭合将需要大量结缔组织的产生。在该阶段中，发生新血管形成、上皮形成、伤口收缩和胶原产生。
4)重塑(也称为成熟、慢化(moderation)或结痂阶段)开始于伤口闭合后的2-3周，而其不会在伤口已愈合之前在开放性伤口中开始。在此之后，其通常持续数周、数月或者甚至数年。成熟涉及伤口收缩、覆盖肉芽组织的新上皮组织生长，以及可能的疤痕形成。在该阶段中，肌成纤维细胞从成纤维细胞中形成，并且胶原纤维逐渐成熟并变得相对更加组织化(organized)。
对于伤口的最佳愈合，全部的四个阶段必须以合适的顺序和时间框架发生。伤口的不同部分可以不同速率愈合，所以正常伤口的一些部分(相对于其他部分)可处于愈合的更晚期阶段。
延迟的伤口愈合和慢性或非愈合性伤口和溃疡
许多因素可引起包括延长性愈合失败(非愈合性伤口)在内的异常或缺陷性伤口愈合。此类伤口一般已经无法通过正常的愈合阶段进行，并且经常由于延迟的、不完整的或不协调的愈合过程而进入病理性炎症状态。这些伤口通常受到一种或更多种细菌物种的定殖或感染，这加剧并延长炎症，并促使愈合延迟。
多数慢性伤口是与缺血、糖尿病、静脉淤滞或压迫相关的溃疡。非愈合性伤口影响了工业化世界中超过1％的人口。在美国，其可影响多达六百万人口，其中约85％将是65岁或/和更年长的人。非愈合性伤口导致巨大的卫生保健支出，其在美国的总年度费用估计超过三十亿美元。
随着人口老化以及患糖尿病的个体数量提高，预计患病率将提高。慢性溃疡降低了患者的生活质量与工作能力，并且意味着对卫生保健系统的巨大财政负担。
下肢溃疡(尤其是那些由糖尿病或者静脉性或动脉性缺陷引起的那些)占慢性溃疡相当大的比例。约15％至25％的患有糖尿病的个体在其一生中的某时间点会发生足溃疡(foot ulcer)，并且估计那些患者中12％需要下肢截肢。愈合因糖尿病性神经病而变得复杂，并且对感染的敏感性也大幅提高。静脉性疾病占慢性下肢溃疡的大多数。继发于多种原因的静脉高压(venous hypertension)可损伤血管壁并最终导致皮肤破裂(skin breakdown)。动脉性溃疡不太常见，并且是由循环受损(impaired circulation)引起，所述循环受损可对愈合产生不利影响并导致溃疡。
细菌定殖和感染在慢性溃疡中的作用
在伤口愈合受损的炎症阶段中，细菌总是会通过从定殖和严重定殖到感染的过程污染该溃疡。严重定殖不常与感染的明显体征共存，但可导致愈合失败、肉芽组织低质、伤口脆弱性升高以及渗出提高(Frank C等，2005)。慢性伤口(例如溃疡)的菌群最通常以生物膜表型(biofilm phenotype)存在并且已知其严重损害正常的愈合进程(Smith DM等，2010)。标准治疗包括使用表面抗微生物剂(碘及银制剂)或表面抗生素(单独或多种组合的莫匹罗星、夫西地酸、氨基糖苷类、杆菌肽、多黏菌素B、短杆菌肽类以及甲硝唑)两周左右。其可随后给予相关经口抗生素。涉及慢性皮肤溃疡的细菌种类
慢性皮肤溃疡的定殖与感染中涉及的细菌种类通常包括存在于对侧或周围完整皮肤中的那些，但会表现出某些细菌属的存在有量大幅上升，包括例如在关于糖尿病性溃疡的研究中的棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)和沙雷氏菌属(Serratia)(Gontcharova V等，2010)。厌氧的属也很常见，例如芬格尔德氏菌属(Finegoldia)及嗜胨菌属(Peptoniphilus)。虽然葡萄球菌属(Staphylococcus)以属出现频率并不过高，金黄色葡萄球菌(S.aureus)对慢性伤口的感染必须被严肃对待。在对褥疮性溃疡(decubitus ulcer)的分析中，所鉴定到最常见的细菌属是链球菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、芬格尔德氏菌属、厌氧球菌属(Anaerococcus)、假单胞菌和嗜胨菌属。发现许多功能上等同的致病组(pathogroup)(原本非致病性种的共生菌落，其协同作用以宿主为代价来促进其自身存活)作为慢性伤口致病性生物膜定殖和生存，其被承认为慢性伤口的主要感染性病原体(Smith DM等，2010)。
非愈合性伤口和溃疡的标准治疗
所有非愈合性伤口及溃疡的标准治疗包括坏死组织的清创、感染控制和局部伤口护理。对于非愈合性伤口的每种类别，必须实施专门的治疗模式。例如，对于糖尿病性足溃疡，必须关注机械减负、严格的血糖控制和对患者足部护理的教育。对于静脉性溃疡，其专门措施通常包括机械挤压以及肢体抬高以逆转组织水肿并改善静脉血流。对于由动脉供血不足引起的溃疡着重在重建血流以及使组织灌注的进一步损失最小化。对于压力性溃疡，减负方法或设备是治疗的金标准。
如果溃疡不能以标准疗法得到充分治愈，可需要另外的治疗模式，其经常称为“高级伤口护理治疗”。已经开发出大量且仍在增多的具有不同组成和适应症的高级伤口护理治疗系列。对于这些数量可观的治疗，其疗效、相对效果和不良作用并未良好地确立。因此，尽管伤口愈合治疗领域中已有广泛研究，伤口和溃疡的治疗仍是复杂的任务，特别是在老年人或患病群体中。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是集落刺激因子(CSF)家族的成员，其为刺激造血祖细胞之增殖和成熟以及增强成熟效应细胞之功能活性的糖蛋白。简而言之，在非成熟细胞层面，CSF确保精力库(staminal pool)的自我更新，并激活造血细胞分化的第一阶段。在后续阶段中，当细胞增殖与成熟细胞特性的进行性获得相关，其极大提高了分化细胞的数量。在最终阶段，其刺激成熟细胞的循环和激活。
GM-CSF已展现出在伤口愈合上的积极作用，该作用通过辅助伤口收缩、引发炎性细胞的局部募集、以及诱发角质细胞增殖来实现。GM-CSF还在愈合过程中激活单核吞噬细胞、改善上皮细胞迁移、以及进一步调节细胞因子产生。
成熟GM-CSF是单体蛋白质，具有127个氨基酸残基，其中有数个潜在糖基化位点。糖基化的可变度导致其分子量范围为14k Da至35kDa。非糖基化和糖基化GM-CSF表现出相似的体外活性(Cebon J等，1990)。GM-CSF的晶体学分析揭示其由四个短α螺旋构成的桶形结构(Diederichs K等，1991)。有两种已知的GM-CSF序列变体。在体内，GM-CSF蛋白的活性形式在细胞外表现为同源二聚体。
GM-CSF通过与其受体结合来实现其生物学活性。GM-CSF受体(GM-CSF-R)表达的最重要位置是在骨髓细胞的细胞表面上，例如I型和II型巨噬细胞、上皮细胞以及内皮细胞，其中淋巴细胞为GM-CSF-R阴性。天然受体由α亚基和β亚基构成。其α亚基赋予配体特异性并以纳摩尔亲和力结合GM-CSF。β亚基也是白介素-3和白介素-5受体复合物的组成部分并且与GM-CSF-R之α亚基及GM-CSF缔合，导致形成具有皮摩尔结合亲和力的复合物(Hayashida K等，1990)。GM-CSF上对受体的结合域已经定位：GM-CSF通过其第一α螺旋内非常受限的区域与其受体的β亚基相互作用(Shanafelt AB等，1991a；b；Lopez AF等，1991)。与α亚基的结合可定位于第三α螺旋(螺旋C，环的起始残基将螺旋C与螺旋D结合)以及GM-CSF的羧基末端尾部(BrownCB等，1994)。
该GM-CSF三聚受体复合物的形成导致复合物信号转导级联的激活，其涉及JAK/STAT家族、She、Ras、Raf、MAP激酶、磷脂酰肌醇-3激酶和NFκB的分子，最终导致c-myc、c-fos以及c-iun的转录。激活主要由受体的β亚基引起(Hayashida K等，1990；Kitamura T等，1991；Sato N等，1993)。共享的β亚基也负责IL-3、IL-5和GM-CSF所发挥的重叠功能(Groot RP等综述，1998)。
除了其在造血细胞生长和分化中的刺激活性，GM-CSF也作为促炎细胞因子发挥作用。GM-CSF激活巨噬细胞(例如I型和II型巨噬细胞类和单核细胞，以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)，导致其他细胞因子和趋化因子和基质降解蛋白酶的释放，以及HLA和细胞黏附分子或CC-趋化因子受体表达升高。这继而导致炎性细胞进入发炎组织的趋化升高。
已知伤口中的巨噬细胞会释放多种生物活性物质，其可作为吸引单核细胞和成纤维细胞二者的化学引诱剂，例如转化生长因子-β(TGF-β)和血小板源性生长因子(PDGF)。激活的巨噬细胞消化失活的胶原和纤维蛋白凝块。凝块的溶解允许伤口愈合第二个阶段中伤口部位肉芽组织的形成。
利用GM-CSF刺激伤口愈合
以上所概述的GM-CSF活性不仅刺激细胞增殖、成熟以及涉及伤口愈合炎症和增生阶段的活性，并且在同一过程中还提升了针对细菌感染的天然防卫机制。表面施用重组人GM-CSF以加速多种类型慢性伤口和溃疡的愈合的用途已被系统性地综述，并且得出其对于深部分厚度烧伤(deep partial-thickness burn)、慢性下肢溃疡和麻风性溃疡的治疗有益的结论，也有一些证据支持其对压迫性溃疡和癌症相关溃疡具有积极效果(Hu X等，2011)。发现在大鼠中对由大肠杆菌(Escherichia coli)感染的实验性伤口表面施用GM-CSF刺激针对感染的天然防御，如与加速的伤口闭合相关的细菌计数降低中所见的那样(Robson M等，1994)。
利用表面抗生素控制慢性伤口和溃疡中的细菌感染
上文已经概述了在慢性伤口和溃疡的标准护理中表面抗微生物剂及抗生素的当前应用。表面抗微生物剂(例如基于碘或银的制剂)可大体上比作防腐剂(antiseptic)：尽管其可能具有强大的杀菌作用，其对于活体细胞也有显著的毒性作用，而这些细胞对于伤口愈合过程至关重要。对于局部杀菌作用与对宿主组织毒性之间的平衡需要重点关注。该平衡就所提到的抗生素来说，对于促进愈合可更加有利，但这些抗生素在所达到的局部浓度也可具有显著的细胞毒性作用。选择能够强效杀菌而对涉及伤口愈合的细胞毒性小或没有毒性的抗生素或抗生素组合是显著有利的。另一种考虑是抗生素应该对已知存在于感染伤口和溃疡的主要细菌种类有活性。另外，如果目前该抗生素对于近年来变得愈加流行的多种多药耐药性菌株有活性，则是巨大优势。最后，若对于该药物具有抗性的细菌在较长时间内无明显增多，也是优势，因此对于将出现的细菌耐药性应有合理的预期。磷霉素
磷霉素是1969年从弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)菌株分离并表征的名称为phosphomycin或phosphonomycin的广谱抗生素的国际非专有名称(Hendlin D等，1969)。其结构确定为(-)(1R，2S)-1，2-环氧丙基膦酸(Christensen BG等，1969)，其系统(IUPAC)命名为[(2R，3S）-3-甲基氧杂环丙烷-2-基]膦酸([(2R，3S)-3-methyloxiran-2-yl]phosphonic acid)，且其式量为138.1Da。磷霉素具有杀菌性，且通过使酶UDP-N-乙酰葡糖胺-3-烯醇式丙酮酸转移酶(也称为MurA)失活来抑制细菌细胞壁生物合成(Brown ED等，1995)。该酶催化肽聚糖生物合成中的关键步骤，即磷酸烯醇式丙酮酸与3’-羟基UDP-N-乙酰葡糖胺连接以形成N-乙酰胞壁酸。磷霉素是磷酸烯醇式丙酮酸类似物，通过烷基化活性位点半胱氨酸残基抑制MurA。该抗生素通过甘油磷酸转运体进入细菌细胞。
考虑到该作用机制，磷霉素杀菌谱广，对需氧的属具有活性，例如葡萄球菌属、链球菌属、奈瑟菌属(Neisseria)、埃希氏菌属、变形杆菌属(Proteus)(吲哚阴性)、沙雷氏菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属和弧菌属，对于吲哚阳性的变形杆菌属、克雷伯氏菌属和埃希氏菌属活性较差。已知其对厌氧的属(消化链球菌属(包括嗜胨菌属、芬格尔达氏菌属和厌氧球菌属)和梭杆菌属)有活性。可以看出其活性谱包含大量在慢性皮肤溃疡的严重定殖与感染中突出的属。
社会上细菌对磷霉素的耐药性流行性较低，并且自从引入磷霉素后，对细菌抗药性流行性的研究显示，其耐药生物的流行性无提高，或仅有适量提高。然而，长期暴露与该抗生素可使得细菌能够通过对缺乏甘油磷酸转运体通路的突变体进行筛选而演化出耐药性。作为替代的耐药性机制涉及可诱导己糖磷酸转运体的丢失(为MurAS中的Cys-Asp突变)，或者获得编码磷霉素灭活酶fosA和fosB(除了单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)染色体fosX之外)的质粒。然而，突变体菌株也可表现为致病性减弱(Karageorgopoulos DE等，2012)。这可以解释为何在体外长时间暴露会出现细菌耐药性，而在体内频率却小得多。在经口或静脉内注射施用磷霉素的对照临床试验中，耐药性菌株的出现整体已达3.0％，在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中达到最高15％。一般而言，磷霉素被看作针对多药耐药生物治疗手段的有价值的补充。在细菌感染的慢性溃疡治疗中，并未出现针对磷霉素产生耐药性的经验。
尽管在人患者中使用磷霉素二钠的静脉内剂量高达0.5g/kg/天，但已证明磷霉素对哺乳动物细胞和器官显著无毒性。此处的限制因素是反荷离子的过载，而非该抗生素的任何毒性效果。事实上，已发现磷霉素具有针对其他抗生素、免疫抑制或化学治疗剂(例如氨基糖苷类、万古霉素、两性霉素B、多黏菌素、环孢素和顺铂)毒性作用的保护作用(GobernadoM，2003)。作为附加效果，其具有有助于吞噬的能力并且充当免疫调变剂。多形核白细胞会积累该药物至其浓度达到细胞外液中的两倍，但并不影响其细胞功能，反而表现出对金黄色葡萄球菌的杀菌作用。其主要不良作用为经口施用磷霉素二钠对胃的刺激、变态反应的迹象(短暂的皮疹(病例中0.3％)和嗜酸性粒细胞增多症(0.2％)的形式)、以及短暂升高的肝酶(病例中0.3％)(Gobernado M，2003)。
磷霉素与其他抗生素组合使用
当其与很多种抗生素(青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类和林可酰胺类)组合时，磷霉素对来自所提及的易感属生物的大量菌株表现出可观的协同作用。虽然早期研究显示，当多种抗生素组合时，在受检菌株中的约70％-100％均展现协同作用，但随后更广泛的研究显示协同率为36％-74％。其余的菌株仅表现出相加作用，并且抑制作用仅见于对单一细菌菌株的一种或两种独立抗生素组合(Gobernado M，2003)。磷霉素与多种独立抗生素表现出协同作用并且确实消除多种其他抗生素之毒性(包括氨基糖苷类的肾毒性和耳毒性)的事实支持磷霉素与其他抗生素组合使用以产生潜在杀菌作用并在更长期治疗中抵消任何磷霉素耐药性的出现。
发明概述
因此，本发明提供了药物组合物，其用于表面治疗表现出延迟愈合或不愈合且受到细菌严重定殖或感染的皮肤和黏膜或者伤口、慢性溃疡和疮，所述组合物主要包括：
1.药物组合物，其含有：
a)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或变体；以及
b)磷霉素，其为其无机或有机盐的形式。
2.根据上述1.所述的药物组合物，其含有一种或更多种另外的抗生素或抗微生物剂。
将GM-CSF与磷霉素或磷霉素与其他抗生素的组合相组合的优势在于：利用GM-CSF的已知作用以促进伤口愈合和针对细菌感染的天然防卫机制，同时还通过磷霉素的杀菌作用更迅速地消除感染细菌而加速伤口愈合，所述磷霉素对粒细胞、巨噬细胞以及GM-CSF通过其发挥治疗作用的其他细胞无毒性作用。该作用是，对于表现出延迟愈合或不愈合的伤口和溃疡，比通过已有治疗或通过单独表面GM-CSF或表面磷霉素(有或没有另外的抗生素)获得更快的愈合速度。
在如下发明详述中，将会给出本发明范围的详述和所用术语的含义，以及实际实施本发明的细节。
发明详述
本发明提供了组合物，其包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或变体、磷霉素(其为其无机或有机盐的形式)，以及在另一实施方案中包含另外的抗生素或抗微生物剂，以及在又一实施方案中包含发现促进伤口愈合的另外的药剂。所述组合物可用于治疗皮肤或黏膜的伤口、溃疡、疮和其他类型损伤，并且旨在以进一步描述的多种方式表面施用。本发明的组合物和方法也存在于一些可用于治疗方法的实施方案中。
GM-CSF制剂
出于实用的目的，本发明中待使用的GM-CSF制剂将不会是纯化的天然人GM-CSF，而是通过重组DNA技术体外制备的人GM-CSF，当然，若前者可用量充足且可能存在的病毒污染问题得以克服，也可使用该制剂。在哺乳动物细胞中进行人重组GM-CSF(hrGM-CSF)的制备已有描述(Wong GG等，1985；Kaushansky K等，1986)。利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行的类似工作已导致非专有名称为瑞拉司亭(regramostim)的hrGM-CSF的产生(Moonen P等，1987首次报道)。Cantrell MA等报道了hrGM-CSF在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达(1985)，导致非专有名称为沙格司亭(sargramostim)的制剂。沙格司亭与内源性人GM-CSF不同之处在于，在其前肽(pro-peptide)上第23位具有亮氨酸残基而非脯氨酸残基，并且与内源性人GM-CSF或瑞拉司亭中任一个相比，其糖基化程度较低(Armitage JO，1998)。Burgess AW等报道了hrGM-CSF在大肠杆菌中的表达(1987)，导致非专有名称为莫拉司亭(molgramostim)的制剂，该制剂无法糖基化。上述三种hrGM-CSF制剂(瑞拉司亭、沙格司亭和莫拉司亭)均可用于本发明，但目前仅可获得后两种。
人GM-CSF的“功能同源物”在本文中定义为多肽，其与人GM-CSF已知且天然存在的序列和序列变体具有至少50％的序列同一性，并且具有该天然存在蛋白质的一种或更多种功能。这些功能包括以下：刺激来自多个谱系(lineage)的造血前体细胞的生长和分化，所述谱系包括粒细胞、巨噬细胞和单核细胞；增强成熟效应细胞的功能活性，所述细胞参与抗原呈递和细胞介导免疫，包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。所述功能还包括与伤口愈合特别相关的那些，例如在愈合过程中促进伤口收缩、导致炎性细胞局部募集、改善中性粒细胞的募集、引起角化细胞增殖、激活单个核吞噬细胞、促进上皮细胞迁移，以及进一步调节细胞因子产生。瑞拉司亭、沙格司亭和莫拉司亭可以说都是天然存在的人GM-CSF的功能同源物。
通过氨基酸序列比对评估的紧密相关的不同物种的GM-CSF同源物之间的演化保守性可用于确定在单个氨基酸残基上的演化压力程度。优选地，在GM-CSF功能保守的物种之间比较GM-CSF序列，所述物种例如但不限于哺乳动物，包括啮齿类、猴类和猿类。在高选择压力下的残基更有可能表现为不可轻易取代的必需氨基酸残基，而非在物种间变换的残基。综上可明显说明，根据本发明，人GM-CSF序列可进行合理数量的修改或替换，而不干预该GM-CSF分子活性。这样的GM-CSF分子在本文中称为人GM-CSF的功能同源物，并且可以是下述天然人GM-CSF的此类变体和片段。
本文中使用的词语“变体”是指与所指蛋白质(index protein)同源的多肽或蛋白质，其在本实例中为天然存在的人GM-CSF，但其与所指蛋白质的区别在于所指蛋白质序列中的一个或更多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。当氨基酸残基替换为具有大体相似性质的不同氨基酸残基时，可认为这些替换为“保守的”，而当氨基酸残基替换为一个不同类型时，则认为是“非保守的”。大体上说，可能会出现的不改变多肽生物学活性的非保守替换较少。
本领域技术人员将知晓如何完成和评估“保守的”氨基酸替换，从而将一个氨基酸残基替换为与前者有一种或更多种共有化学和/或物理学性质的另一个氨基酸残基。保守氨基酸替换影响该蛋白质功能的可能性较小。氨基酸可根据其共有属性分类。保守的氨基酸替换为将某氨基酸预定组中的氨基酸替换为同组中另一个氨基酸，在该组中氨基酸表现相似或基本相似的性质。本文中使用的术语“保守的氨基酸替换”的含义中，可将氨基酸组中的一个氨基酸替换为另一氨基酸，所氨基酸组的特征在于具有：
i)极性侧链(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)
ii)非极性侧链(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
iii)脂肪族侧链(Gly、Ala Val、Leu和Ile)
iv)环状侧链(Phe、Tyr、Trp、His和Pro)
v)芳族侧链(Phe、Tyr和Trp)
vi)酸性侧链(Asp和Glu)
vii)碱性侧链(Lys、Arg和His)
viii)酰胺侧链(Asn和Gln)
ix)羟基侧链(Ser和Thr)
x)含硫侧链(Cys和Met)
xi)属于单氨基二羧酸或单氨基单羧-单酰胺基酸的氨基酸(Asp、Glu、Asn和Gln)。
本发明范围中的功能同源物为多肽，其表现出与天然存在形式的人GM-CSF具有至少50％的序列同一性，例如至少60％的序列同一性，例如至少70％的序列同一性，例如至少75％的序列同一性，例如与天然存在形式的人GM-CSF至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
序列同一性可使用许多公知的算法并应用许多不同的空位罚分来计算。任何序列比对算法(例如但不限于FASTA、BLAST或GETSEQ)可用于搜索同源物以及计算序列同一性。此外，在适当情况下，任何公知的替代矩阵(例如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩阵)可与搜索算法一起应用。例如，PSSM(位置特异性得分矩阵(position specific scoring matrix))可通过PSI-BLAST程序进行应用。此外，进行序列比对时可使用一系列空位开放和延伸罚分。例如，可以在BLAST算法中使用范围为5-12的空位开放罚分和范围为1-2的空位延伸罚分。
因此，根据该发明，在其相同序列变体或片段内，或在其不同序列变体或片段之中，其变体或片段可包含至少一个替换，例如彼此独立引入的多个替换。
上述简述清楚地说明，其相同变体或片段可包含来自多于一个上文中所定义的保守氨基酸分组的多于一个保守氨基酸替换。
除了二十种标准氨基酸和两种特殊氨基酸外(硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸)，还有大量的“非标准氨基酸”，其在体内不并入蛋白质。非标准氨基酸的实例包括含硫牛磺酸以及神经递质GABA和多巴胺。其他实例为羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸和脱氢丙氨酸。其他非标准氨基酸有鸟氨酸和瓜氨酸。
非标准氨基酸通常通过对标准氨基酸进行修饰形成。例如，牛磺酸可通过半胱氨酸脱羧形成，而多巴胺由酪氨酸合成，并且羟脯氨酸通过对脯氨酸进行翻译后修饰得到(通常在胶原中)。非天然氨基酸的实例列于例如37C.F.R.section 1.822(b)(4)中，其均通过引用并入。
本文中所描述的标准和非标准氨基酸残基二者均可以是“D”或“L”异构体形式。
可以预期根据本发明的功能等价物可包含任何氨基酸(包括非标准氨基酸)。在一些优选的实施方案中，功能等价物仅包含标准氨基酸。
标准和/或非标准氨基酸可通过肽键或通过非肽键连接。如本领域中所已知的，术语肽还包括由化学或酶催化反应引入的翻译后修饰。如果期望的话，这样的翻译后修饰可在分开前引入。本文中所特指的氨基酸将优先为L-立体异构体形式。氨基酸类似物可用于替换20种天然氨基酸。已知数种此类类似物，包括氟苯丙氨酸、正亮氨酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、S-氨乙基半胱氨酸、4-甲基色氨酸等。
在本发明的一个实施方案中，所述GM-CSF变体包含能够延长活性成分半衰期的缀合物，例如白蛋白或脂肪酸。
适合的变体与人GM-CSF天然存在形式的预定序列具有至少60％的同一性，优选至少70％，并且因此，变体优选具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
功能同源物还可包含在人蛋白质中通常不存在的化学修饰，例如泛素化、标记(例如用放射性核素、多种酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或通过插入(或通过化学合成替换)氨基酸(例如鸟氨酸)。
除了本文中所描述的肽基化合物外，也可配制空间结构相似的化合物以模拟肽结构的关键部分，并且此类化合物还可以相同方式用于本发明的多肽。这可通过本领域技术人员已知的建模和化学设计技术来实现。例如，可以使用酯化和其他烷基化来修饰例如二精氨酸肽骨架的氨基末端(N-端)以模仿四肽结构。可以理解，所有此类空间相似结构都落入本发明的范围内。
本发明还涵盖N-端烷基化且C-端酯化的肽。功能等价物还包含以相同分子形成的糖基化的和共价或聚集的缀合物，包括二聚体或无关的化学部分。通过本领域中已知的方式，此类功能等价物通过将官能团与见于包含N-端和C-端中任一个或两者的片段中的基团相连接制备。
所述“其片段”可指给定氨基酸序列的任何部分。片段连在一起可以包含全长蛋白质中的多于一个部分。适合的片段可以是缺失或添加突变体。添加至少一个氨基酸可以是添加优选地2至250个氨基酸，例如10至20个氨基酸，例如20至30个氨基酸，例如40至50个氨基酸。片段可包含来自所述蛋白质的小区域或这些区域的组合。缺失和/或添加可以彼此独立地是在序列中和/或在序列末端的缺失和/或添加。
缺失突变适当地包含至少长度为20或40个连续氨基酸且更优选至少80或100个连续氨基酸。因此，这样的片段可以是取自人GM-CSF序列中的较短序列，其含有至少20个连续氨基酸，例如至少30个连续氨基酸，例如至少40个连续氨基酸，例如至少50个连续氨基酸，例如至少60个连续氨基酸，例如至少70个连续氨基酸，例如至少80个连续氨基酸，例如至少90个连续氨基酸，例如至少95个连续氨基酸，例如至少100个连续氨基酸，例如至少105个氨基酸，例如至少110个连续氨基酸，例如至少115个连续氨基酸，例如至少120个连续氨基酸，其中所述缺失突变体优选地具有与人GM-CSF天然存在形式至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
优选地，GM-CSF的功能同源物包含至多500，更优选至多400，甚至更优选至多300，然而更优选至多200，例如至多175，例如至多160，如至多150个氨基酸，例如至多144个氨基酸。
有两种人GM-CSF的已知变体：变体1中的T115I替换以及变体2中的I117T替换。因此，本发明的一个实施方案中，GM-CSF的功能同源物包含与人GM-CSF NO：1或任何剪接变体具有高度序列同一性的序列。
例如，在美国专利No.5,229,496、5,393,870和5,391,485中描述了GM-CSF的类似物。该类似物也是本发明中所包含的功能等价物。
在一个实施方案中，根据本发明以同聚体或异聚体的形式使用GM-CSF。GM-CSF的同聚体或异聚体形式可包含一个或更多个GM-CSF单体或如上文中所定义的GM-CSF的功能同源物。同聚体和异聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体和十聚体。
在一个实施方案中，使用了GM-CSF的同源二聚体、三聚体或四聚体。
人(Homo sapiens)GM-CSF前体(包含信号肽)形式的氨基酸序列为：
MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE.
对应的成熟蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)为：
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE
根据本发明的人GM-CSF天然存在形式的功能同源物市售可得，例如沙格司亭(Immunex，Seattle，WA，USA)。
GM-CSF的重组生产
GM-CSF或者其功能性变体或同源物可以以多种方式生产，例如从例如人或动物血清中分离或从细胞(例如原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞)中或无细胞系统中表达分离。
本发明的一个实施方案中，GM-CSF通过宿主细胞重组生产。因此，在本发明的一方面中，GM-CSF由宿主细胞生产，所述细胞包含编码GM-CSF的第一核酸序列，其与能够指导在所述宿主细胞中表达的第二核酸序列可操作地相关联。因此，所述第二核酸序列可包含启动子或甚至由其组成，所述启动子将指导在所述细胞中表达目的蛋白质。技术人员将能够容易地确定用于给定宿主细胞中的可用的第二核酸序列。
生产重组GM-CSF的方法大体上包括如下步骤：
-提供宿主细胞
-制备基因表达构建体，所述构建体包含编码GM-CSF的第一核酸序列，其与能够指导在所述宿主细胞中表达所述蛋白质的第二核酸序列可操作地相连接
-用所述构建体转化所述宿主细胞
-培养所述宿主细胞，从而获得GM-CSF的表达。
如此生产的重组GM-CSF可通过任何常规方法分离，例如下文中描述的任何蛋白质分离方法。技术人员将能够确定用于纯化GM-CSF的合适蛋白分离步骤。
在本发明的一个实施方案中，重组生产的GM-CSF由宿主细胞分泌。当分泌GM-CSF时，生产目标重组蛋白的方法可包括以下步骤：
-提供宿主细胞
-制备基因表达构建体，所述构建体包含编码GM-CSF的第一核酸序列，其与能够指导在所述宿主细胞中表达所述蛋白质的第二核酸序列可操作地相连接
-用所述构建体转化所述宿主细胞
-培养宿主细胞，从而获得GM-CSF的表达以及GM-CSF向培养基中的分泌
-从而获得含有GM-CSF的培养基。
因此，在本发明的该实施方案中，包含GM-CSF和核酸的组合物可以是所述培养基或者由所述培养基制备的组合物。
在本发明的另一实施方案中，所述组合物为由动物、其部分或细胞制备的提取物或此类提取物的分离的级分。
在本发明的一个实施方案中，GM-CSF在体外于宿主细胞中重组生产，并从细胞裂解液、细胞提取物或从组织培养上清液中分离。在一个更优选的实施方案中，GM-CSF由宿主细胞生产，所述细胞以使其表达相关GM-CSF的方式修饰。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，转化所述宿主细胞以生产和分泌相关GM-CSF。
根据本发明的药物组合物可包含GM-CSF或者其功能性变体或同源物，其浓度为1μg/mL至10mg/mL，更优选5μg/mL至500μg/mL，并且甚至更优选10μg/mL至200μg/mL。
磷霉素制剂
落入本发明范围内的磷霉素制剂为化合物及化合物的盐，其包含如下结构：(-)(1R，2S)-1，2-环氧丙基膦酸，系统名为[(2R，3S)-3-甲基氧杂环丙烷-2-基]膦酸，式量为138.1Da。尽管用此结构的游离酸形式作为用于计算磷霉素有效量和浓度的基础，但游离酸不稳定而用于临床用途的抗生素作为无机或有机盐存在。本发明范围内磷霉素盐的无机反离子的非限制性实例为钠、钙、钾、锂、铵、镁。本发明范围内磷霉素盐有机反离子的非限制性实例为氨丁三醇(trometamol)(也称为缓血酸胺(tromethamine)或tris，系统名为2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇)、苯乙胺，以及大量其他生物相容性有机胺。本发明范围内目前使用的磷霉素的主要形式为：
i)磷霉素二钠，式量182.0Da，5％溶液pH为9.0-10.5。该盐易溶于水，对胃有刺激性，且主要用于静脉内注射。
ii)一水合磷霉素钙，式量194.1Da，0.4％溶液pH为8.1-9.6。该盐微溶于水，但对胃刺激性较小，且用于经口治疗。其生物利用度可低至12％(Bergan T，1990)。
iii)磷霉素氨丁三醇，式量259.2Da，5％溶液pH为3.5-5.5。该盐易溶于水，经口给予时耐受良好，且尤其用于下泌尿道感染的单剂量经口治疗，表现出约40％的生物利用度。
通常对于这些制剂，其作为干粉在25℃下至少3年是稳定的，但在水溶液中，表现出pH依赖性不稳定性，在25℃下，在pH 3下在10小时内、在pH 6.5下在2月内以及在pH 9.75下在2年内，丢失10％的磷霉素活性。在配制具有合适保质期的用于表面施用的水性组合物时必须考虑低pH下降低的稳定性。
与其他抗微生物剂组合
本发明的组合物还可含有一种或更多种另外的抗微生物剂以增强其对重要病原体(如金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌)的杀菌作用，阻止任何延长治疗中产生耐药性的菌株过度生长，或扩大抗微生物谱以包括非细菌病原体(包括但不限于真菌)。该组合物中可包含的抗微生物剂的非限制性实例为：夫西地酸或夫西地酸钠、青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、万古霉素、林可霉素、克林霉素、氟喹诺酮类、莫匹罗星、杆菌肽、多黏菌素B、短杆菌肽类、甲硝唑、克霉唑、酮康唑和制霉菌素。特别适合包含于其中的药剂表现与磷霉素的协同杀菌作用，其非限制性实例为：青霉素、氨苄西林、羧苄西林、甲氧西林、苯唑西林、美洛西林、哌拉西林、氨曲南、亚胺培南、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢孟多、头孢西丁、头孢美唑、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢磺啶、头孢他啶、头孢吡肟、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、林可霉素、克林霉素、替考拉宁、达托霉素、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、司帕沙星。某些抗生素与磷霉素在水溶液中不相容，例如氨苄西林、美坦西林、头孢噻啶、头孢噻吩、链霉素、庆大霉素、卡那霉素，该特征可使其不适用于本发明范围内的水性组合物。
在一个实施方案中，所述另外的抗生素或抗微生物剂选自：阿贝卡星、氨曲南、头孢西丁、头孢哌酮、头孢氨苄、克林霉素、氟氯西林、美罗培南、甲硝唑、美洛西林或万古霉素。选择克林霉素或美罗培南或甲硝唑特别地旨在用于治疗怀疑或通过合适的细菌培养已知受到厌氧菌(包括拟杆菌属(Bacteroides)物种)感染的伤口。
在另一实施方案中，所述另外的抗生素至少为氨曲南和阿贝卡星的组合。其特别地旨在用于治疗怀疑或通过合适的细菌培养已知受到铜绿假单胞菌感染的伤口。
所有以上化合物均为技术人员所知，基于待治疗的感染性生物身份的试验数据，技术人员无需过度负担就可从化合物列表中选择用哪种化合物与GM-CSF和磷霉素组合治疗。
药物组合物的其他成分
维生素A和抗氧化剂还可对愈合过程中的组织具有刺激作用。在本发明的一个实施方案中，本文中所限定的组合物还包含维生素A和/或抗氧化剂，其非限制性实例为：维生素E(以α-生育酚的形式)、泛醌、艾地苯醌、类胡萝卜素(例如番茄红素)、抗坏血酸或抗坏血酸盐/酯、以及烟酰胺。
剂量
本发明的药物组合物的“有效量”意为这样的剂量，当将其施用于有此需要的对象时，获得具有有利生物学作用的浓度，即通过治疗、阻止或减轻刺激或病变(例如身体皮肤、黏膜或结缔组织的伤口、溃疡和其他病变)。这样的有效量可由患者的主治医师或兽医确定，并且本领域普通技术人员可容易地确定。影响治疗有效量的因素将包括以下：
i)所使用治疗剂的特定活性
ii)病变类型(机械性或热性，全厚度或部分厚度烧伤，等)
iii)病变尺寸
iv)病变深度(若为全厚度烧伤)
v)感染的存在和感染的类型
vi)受伤后所经过的时间
vii)其他疾病状态的存在
viii)患者的年龄、身体状况和营养状态
患者可能正在接受的其他药物治疗将影响施用治疗剂的治疗有效量的确定。
虽然全身性治疗中药物组合物成分的有效量及剂量根据体重或体表面积确定，而假如活性成分的全身性吸收并不会导致患者接受不利的过高剂量，在以该组合物对伤口和溃疡的表面施用时，可根据所治疗的伤口或溃疡面积更加恰当地表示有效量和剂量，例如以平方厘米表示。
GM-CSF或者其功能性变体或同源物对伤口或溃疡表面施用的有效量可以是1微克(μg)至100μg/平方厘米/天，例如2μg至80μg/平方厘米/天，且尤其是5μg至50μg/平方厘米/天。有效量根据人GM-CSF的全功能同源物(例如莫拉司亭)所给用量表示，且根据所用同源物的功能活性进行调整。
在实践中，本发明的药物组合物包含GM-CSF或者其片段或变体，其浓度为1μg/mL(或μg/g)至10mg/mL(或mg/g)，例如5μg/mL(或μg/g)至500μg/mL(或μg/g)，或例如10μg/mL(或μg/g)至200μg/mL(或μg/g)。
适合的磷霉素盐对伤口或溃疡表面施用的有效量可以是10mg至1000μg/平方厘米/天，例如20μg至800μg/平方厘米/天，且尤其是50μg至500μg/平方厘米/天。根据所用制剂中磷霉素游离酸含量表示有效量。
在实践中，本发明的药物组合物包含磷霉素盐，其基于磷霉素游离酸的浓度为100μg/mL(或μg/g)至30mg/mL(或mg/g)，例如250μg/mL(或μg/g)至10mg/mL(或mg/g)。
表面施用的另外的抗微生物剂的有效量是本领域中已知的，且可添加至本发明的药物组合物中，调整其用量以使得当达到GM-CSF和磷霉素的有效量时，也达到所述另外的抗微生物药的有效量。在实践中，这意味着例如夫西地酸将以与磷霉素相近的量添加至组合物，而例如妥布霉素将以磷霉素量的1％至10％的量添加。
优选地，以每日有效剂量一日施用一次，但也可将其分为一日二次、一日三次、一日四次、一日五次或一日六次的剂量。
只要病变未愈合，给药持续时间将通常为1天至约4个月，例如1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天，或1周至2周、2周至3周、3周至4周，或1个月至2个月、2个月至3个月、3个月至4个月。
将巨噬细胞用GM-CSF体外孵育后，从静息巨噬细胞转化为完全免疫活性的树突细胞需约10天。在一个实施方案中，某剂量下给药持续时间的长度足以完成所述转化，因此该持续时间可以是7天至14天，例如8天至12天，例如8天，或9天，或10天，或11天，或12天。
给药方案可以在施用以及不施用(暂停治疗)本发明药物组合物的阶段之间交替。在该给药方案中，暂停治疗阶段可持续5天至10天，例如5天，或6天，或7天，或8天，或9天，或例如10天或更久，例如1至4个月。
给药方案的实例可包括用根据本发明的药物组合物治疗10天并暂停治疗7天的循环。若将其替换为使用不含抗生素的制剂的替换疗法，治疗暂停可延长至2周或3周或更久，最长为6周。这是为了阻止个体伤口中耐抗生素生物的产生。
可通过重复给药方案来加速静息巨噬细胞向树突细胞的转变。因此，为了获得有效的治疗，给药方案可重复一次、两次、三次、四次、五次或更多次。
在一个实施方案中，给药方案重复了如一次、两次、三次或更多次，例如在有需要之对象的剩余寿命中重复。
在另一实施方案中，患者接受如下给药方案的治疗：以根据本发明的药物组合物治疗10天，随后所述治疗暂停7-20天，且随后重复此给药方案2次至3次或更多次。
制剂
本发明的药物组合物可以是散剂(powder)、喷洒粉末喷雾剂(dusting powder spray)、糊剂(paste)、软膏剂(ointment)、洗剂(lotion)、凝胶剂(gel)、乳膏剂(cream)、油膏剂(salve)、乳剂(emulsion)、混悬剂(suspension)、溶液剂(solution)、喷雾剂(spray)、海绵(sponge)、条带(strip)、硬膏剂(plaster)、垫(pad)、敷料(dressing)的形式，或配制在造口术板(ostomy plate)中。组合物活性成分可作为微粉化粉末的形式混悬于非水性介质中或溶解于水性介质中。
喷洒粉末为优选制剂，因为所述组合物的活性成分彼此相容，并且以干粉形式在室温下表现出长期稳定性。所述制剂可含有粉末添加剂，如硬脂酸淀粉酯、纤维素、乳糖、氧化锌、二氧化硅、碳酸镁、滑石粉或黏土。
包含烃类凝胶而不含水性组分的软膏剂也为优选的剂型，因为微粉化形式的磷霉素不会受到在亚碱性pH水平下在水存在下的水解作用降解，且将具有适当长的保质期。软膏剂可通过添加粉末(例如淀粉、氧化锌、滑石粉或二氧化钛)而制成糊剂。
实例2给出软膏剂的组合物以提供在单次日施用中GM-CSF和磷霉素的有效剂量。
实例3给出软膏剂的组合物以提供在单次日施用中GM-CSF和磷霉素与克林霉素的有效剂量，以对厌氧菌有强效并且也对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)有效。
实例4给出软膏剂的组合物以提供在单次日施用中GM-CSF和磷霉素与阿贝卡星和氨曲南的有效剂量，以对铜绿假单胞菌有强效。
也可使用水性介质，例如凝胶剂、乳膏剂、洗剂、溶液剂和混悬剂，但将需要将pH调整为pH 7至pH 10的值，优选为至少pH 8，以确保磷霉素组分的合理的稳定性以及因此确保适合的制剂保质期。水性介质的pH可通过低浓度的合适生物相容性缓冲成分调节，非限制性实例为氨丁三醇、碳酸钠和碳酸氢钠，以及磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。也可添加张力调节剂，例如氯化钠、氯化钾或氯化钙。
根据本发明的组合物可配制成用于改善活性成分穿过黏膜屏障或表皮时的穿透和效力。改善黏膜屏障穿透可通过能够黏附于黏膜、表皮或伤口表面的制剂获得。这是所提出的软膏剂型的固有特性，但也可添加改善穿透的特殊物质，其非限制性实例为丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、1-癸基二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、二乙基苯甲酰胺、豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate)、棕榈酸异丙酯和油酸的酯。
根据本发明的制剂可包含可药用载体和赋形剂，包括微球、脂质体、胶束、微胶囊、纳米颗粒等。例如，GM-CSF组分可配制成具有外侧脂肪层和水相核心(GM-CSF组分溶于其中)的脂质体。此类制剂的脂质层克服表皮或黏膜的穿透屏障。
传统脂质体通常由磷脂(中性或带负电荷)和/或胆固醇构成。脂质体为基于围绕水性隔室(compartment)的脂质双层的囊泡状结构。其物理化学性质(例如尺寸、脂质组成、表面电荷和数量以及磷脂双层流动性)可以不同。用于形成脂质体的最常用的脂质为：1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DMPA)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DPPA)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DOPA)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DMPG)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DPPG)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DOPG)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-丝氨酸](钠盐)(DMPS)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-丝氨酸](钠盐)(DPPS)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-丝氨酸](钠盐)(DOPS)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(戊二酰)(钠盐)和1，1’，2，2’-四豆蔻酰心磷脂(铵盐)。优选由DPPC与其他脂类或脂质体调节剂组合构成的制剂，例如与胆固醇和/或磷脂酰胆碱组合。
生产脂质体的可用方法为将亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)与脂质体外表面共价连接。一些优选的脂类为：1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)(DOTAP)。
适用于脂质体的可能脂类由例如Avanti，Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL，USA提供。此外，脂质体悬液可包含脂质保护剂，其可保护脂质免受储存中的自由基和脂质过氧化损害。优选亲脂性自由基淬灭剂，例如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂，例如铁草胺(ferrioxamine)。
数种方法可用于制备脂质体，如例如以下中所述：Szoka F等(1980)、美国专利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028，其均通过引用并入本文。另一种方法生产不均一尺寸的多层囊泡。在该法中，形成囊泡的脂质溶于适当有机溶剂或溶剂系统，并在真空或惰性气体中干燥，以形成薄脂质膜。如果期望的话，该膜可重新溶解于适当溶剂(例如叔丁醇)中，并随后冻干以形成更均匀的脂质混合物，所述混合物为更易于水合的粉末样形式。以目标药物和目标组分的水溶液覆盖该膜，并允许水合，此过程通常在搅拌下经过15-60分钟的时间。可通过在更剧烈搅拌条件下使脂质水合或通过添加增溶去垢剂(如脱氧胆酸盐/酯(deoxycholate))使所得多层囊泡的尺寸分布向较小尺寸转变。
为确保该皮肤病制剂组分的充足保质期(尤其是磷霉素，其在生理pH的水性介质中不稳定)，并且同时为患者提供在施用部位的刺激性尚可接受的制剂，本发明的一个实施方案包括提供药盒(kit)中的作为待在临用前混合之独立部分的活性成分。所述药盒还可包含介质，在对伤口表面施用前，可将组分在该介质中混合。除了所述其他成分之外，所述介质可含有缓冲剂，例如上述那些，以确保当所有成分混合后，该制剂的pH适合于皮肤使用。
适应症
本发明提供了药物组合物，其用于治疗身体皮肤、黏膜或结缔组织的伤口、溃疡、疮、烧伤或其他病变，所述病变可以是急性或慢性。这样的病变可由广谱事件引起和/或可与其他疾病相关。待治疗病变包括与以下有关的那些：割伤、撕裂、擦伤、水泡、血肿、刺伤、穿透、枪击、电击、辐照、化学、创伤、挤压、咬伤、烧伤、冻伤、手术、原发癌或转移、良性肿瘤、痤疮、感染(例如细菌感染，其可与真菌或病毒或寄生虫感染组合)、血液循环减弱相关病变(例如与静脉或动脉供血不足相关的下肢溃疡和足溃疡)、褥疮性溃疡、压疮或褥疮，以及与糖尿病相关的病变。
当伤口无法按照适当适时的愈合过程来实现所治疗组织的正常持续且稳定的解剖学和功能完整性时出现慢性伤口(目前通常称为“非愈合性伤口”)、或病变、伤口或溃疡。大体上说，若皮肤病变在三个月时间内无法取得愈合的实质性进展或已经稳定处于部分愈合状态长于三个月，则可归类为慢性或“非愈合性”伤口。该一般定义并不全面适用，因为患者的年龄和健康状况以及患者所遭受的其他因素(例如疾病或障碍，例如循环障碍)可显著延长正常的愈合过程。在这样的情况下，皮肤病变六个月后不愈合则可归类为“非愈合性”伤口。
“非愈合性”伤口或慢性皮肤病变若涉及表皮和至少部分真皮的局灶性丧失则为溃疡性。慢性溃疡性皮肤病变常伴有除正常愈合过程失败之外的其他症状。典型的伴随迹象和症状包括以下一种或更多种：疼痛、渗出、难闻气味、表皮脱落(excoriation)、伤口蔓延(wound spreading)、组织坏死、刺激性和角化过度(hyperkeratosis)。此类症状可致使患者极度虚弱和尴尬，并可能严重损害患者的生活质量。在严重的情况下，其可能导致截肢或甚至引起死亡。
恶性或恶化前慢性溃疡性皮肤病变的出现可与原发性皮肤癌相关联，或与局部肿瘤或远处肿瘤向皮肤转移有关。其可以是消耗性或非消耗性。例如，其形态可以是空腔、皮肤表面开放性区域、皮肤结节或从皮肤表面延伸的结节性生长。
本发明的药物组合物可用于治疗上述所有非愈合性伤口或慢性溃疡性皮肤病变，并因此减轻或阻止伴随此类病变的一种或更多种症状。
实施方案
1.药物组合物，其包含：
a.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或变体；以及
b.磷霉素，其为其无机或有机盐的形式。
2.根据实施方案1所述的药物组合物，其含有一种或更多种另外的抗生素或抗微生物剂。
3.根据实施方案2所述的组合物，其中所述一种或更多种另外的抗生素或抗微生物剂选自：夫西地酸、青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、万古霉素、林可霉素、克林霉素、氟喹诺酮类、莫匹罗星、杆菌肽、多黏菌素B、短杆菌肽类、甲硝唑、克霉唑、酮康唑和制霉菌素。
4.根据实施方案2或实施方案3所述的组合物，其中所述一种或更多种另外的抗生素或抗微生物剂选自：青霉素、氨苄西林、羧苄西林、甲氧西林、苯唑西林、氟氯西林、美洛西林、哌拉西林、氨曲南、亚胺培南、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢孟多、头孢西丁、头孢美唑、头孢噻肟、头孢唑林、头孢哌酮、头孢磺啶、头孢他定、头孢吡肟、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、林可霉素、克林霉素、替考拉宁、达托霉素、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、司帕沙星、头孢曲松、阿贝卡星或万古霉素。
5.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述伤口或病变受到葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)或假单胞菌(例如铜绿假单胞菌)感染。
6.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物不在水溶液中，并且其中所述另外的抗生素或抗微生物剂为以下任一种：氨苄西林、美坦西林、头孢噻啶、头孢噻吩、链霉素、庆大霉素或卡那霉素。
7.前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含以下一种或更多种：维生素A、抗氧化剂，例如以下一种或更多种：维生素E(以α-生育酚的形式)、泛醌、艾地苯醌、类胡萝卜素(例如番茄红素)、抗坏血酸或抗坏血酸盐/酯或烟酰胺。
8.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗、减轻病变或加速其愈合：所述病变例如皮肤、黏膜或所述病变下方结缔组织中任一者的伤口、溃疡、疮或烧伤。
9.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述病变为慢性。
10.根据实施方案1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述病变为急性。
11.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述病变与细菌、真菌、病毒或寄生虫的定殖或感染相关。
12.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述病变受到来自以下任一属细菌的感染：葡萄球菌属、链球菌属、奈瑟菌属、埃希氏菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、以及弧菌属、变形杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属、消化链球菌属(包括嗜胨菌属、芬格尔德氏菌属和厌氧球菌属)和梭杆菌属。
13.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述活性组分作为待在临用前混合之独立部分在药盒中提供。
14.根据实施方案13所述的药盒，其中所述药盒还包含介质，可在对伤口表面施用前将所述组分在所述介质中混合。
15.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述病变与糖尿病相关。
16.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述病变与减弱的血液循环相关，所述减弱的血液循环例如静脉性下肢溃疡、静脉性足溃疡、动脉性下肢溃疡、动脉性足溃疡和褥疮性溃疡。
17.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其配制成用于作为散剂、糊剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏剂、油膏剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、喷雾剂、海绵、条带、硬膏剂、垫、敷料表面施用，或配制在造口术板中。
18.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中GM-CSF和磷霉素用于表面施用，并且所述另外的抗微生物药物用于非表面施用。
19.根据实施方案1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述GM-CSF处于脂质体或胶束或微胶囊或纳米颗粒制剂中。
20.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述GM-CSF变体与SEQ ID NO：1或2具有至少70％的同一性。
21.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述GM-CSF片段包含SEQ ID NO：1或2中任一个的至少50个连续氨基酸残基。
22.根据实施方案21所述的药物组合物，其中所述片段在重叠范围内与SEQ ID NO：1或2具有至少70％的同一性。
23.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其包含浓度为1μg/mL至10mg/mL的GM-CSF或者其片段或变体。
24.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其包含浓度为5μg/mL至500μg/mL的GM-CSF或者其片段或变体。
25.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其包含浓度为10μg/mL至200μg/mL的GM-CSF或者其片段或变体。
26.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其包含以磷霉素游离酸计浓度为100μg/mL至10mg/mL的磷霉素盐。
27.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其包含以磷霉素游离酸计浓度为250μg/mL至1mg/mL的磷霉素盐。
28.根据实施方案17和18所述的药物组合物，其中所述磷霉素盐为磷霉素二钠或磷霉素钙或磷霉素氨丁三醇，所述磷霉素氨丁三醇还称为磷霉素缓血酸胺。
29.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其还包含一种或更多种另外的抗生素或抗微生物剂。
30.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其还包含维生素A和/或抗氧化剂。
31.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物，其中所述GM-CSF变体包含能够延长所述GM-CSF之半衰期的缀合物。
32.根据前一实施方案所述的药物组合物，其中能够延长所述GM-CSF变体之半衰期的缀合物为白蛋白或脂肪酸。
33.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其还可用于治疗方法。
实施例
以下非限制性实施例进一步举例说明本发明。
实施例1：序列
SEQ ID NO：1-人GM-CSF前体
＞sp|P04 141|CSF2_人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
OS＝人
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
SEQ ID NO：2-成熟人GM-CSF
＞sp|P04141|18-144
A|PARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
实施例2：用于治疗皮肤伤口、溃疡、疮或烧伤的软膏剂
该组合物可尤其适用于不表现出严重细菌感染临床体征的由静脉功能不全导致的下肢溃疡。
实施例3：用于治疗皮肤伤口、溃疡、疮或烧伤的软膏剂，其含有除磷霉素之外的其他抗生素
该组合物可尤其适用于治疗其中怀疑或通过厌氧菌培养证实受到厌氧菌感染的伤口和溃疡。其也可适用于通过培养证实受到对克林霉素敏感的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的伤口。
实施例4：用于治疗皮肤伤口、溃疡、疮或烧伤的软膏剂，其除磷霉素之外还含有另外两种抗生素
该组合物可尤其适用于治疗其中怀疑或通过细菌培养证实受到铜绿假单胞菌感染的伤口和溃疡。
参考文献
Armitage JO(1998)Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Blood 92：4491-4508.
Brown CB，Pihl CE，Kaushansky K.(1994)Mapping of human granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor domains interacting with the human granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-receptor alpha-subunit.Eur J Biochem225：873-880.
Brown ED，Vivas El，Walsh CT，Kolter R(1995)MurA(MurZ)，the enzyme that catalyzes the first committed step in peptidoglycan biosynthesis，is essential in Escherichia coli.J Bacteriol 177：4194-4197.
Burgess AW，Begley CG，Johnson GR，Lopez AF，Williamson DJ，Mermod JJ，Simpson RJ，Schmitz A，DeLamarter JF(1987)Purification and properties of bacterially synthesized human granulocyte-macrophage colony stimulating factor.Blood 69：43-51.
Cantrell MA，Anderson D，Cerretti DP，Price V，McKereghan K，Tushinski RJ，Mochizuki DY，Larsen A，Grabstein K，Gillis S，et al(1985)Cloning，sequence，and expression of a human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.Proc Natl Acad Sci USA 82：6250-6254.
Cebon J，Nicola N，Ward M，Gardner l，Dempsey P，Layton J，Dührsen U，Burgess AW，Nice E，Morstyn G(1990)Gran ulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes.The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity.J Biol Chem 265：4483-4491.
Christensen BG，Leanza WJ，Beattie TR，Patchett AA，Arison BH，Ormond RE，Kuehl FA Jr，Albers-Schonberg G，Jardetzky O(1969)Phosphonomycin：structure and synthesis.Science 166：123-125.
Diederichs K，Jacques S，Boone T，Karplus PA(1991)Low-resolution structure of recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor.J Mol Biol 221：55-60.
Frank C，Bayoumil，Westendorp C(2005)Approach to infected skin ulcers.Can Fam Physician 51：1352-1359.
Gobernado M(2003)Fosfomycin.Rev Esp Quimioter 16：15-40.
Gontcharova V，Youn E，Sun Y，Wolcott RD，Dowd SE(2010)A comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin.Open Microbiol J 4：8-19.
de Groot RP，Coffer PJ，Koenderman L(1998)Regulation of proliferation，differentiation and survival by the IL-3/IL-5/GM-CSF receptor family.Cell Signal 10：619-628.
Hayashida K，Kitamura T，Gorman DM，Arai K，Yokota T，Miyajima A(1990)Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)：reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor.Proc Natl Acad Sci USA 87：9655-9659.
Hendlin D，Stapley EO，Jackson M，Wallick H，Miller AK，Wolf FJ，Miller TW，Chaiet L，Kahan FM，Foltz EL，Woodruff HB，Mata JM，Hernandez S，Mochales S(1969)Phosphonomycin，a new antibiotic produced by strains of streptomyces.Science 166：122-123.
Hu X，Sun H，Han C，Wang X，Yu W(2011)Topically applied rhGM-CSF for the wound healing：a systematic review.Burns 37：729-741.
Karageorgopoulos DE，Wang R，Yu XH，Falagas ME(2012)Fosfomycin：evaluation of the published evidence on the emergence of antimicrobial resistance in Grem-negative pathogens.J Antimicrob Chemother 67：255-268.
Kaushansky K，O′Hara PJ，Berkner K，Segal GM，Hagen FS，Adamson JW(1986)Genomic cloning，characterization，and multilineage growth-promoting activity of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Proc Natl Acad Sci USA 83：3101-3105.
Kitamura T，Hayashida K，Sakamaki K，Yokota T，Arai K，Miyajima A.Reconstitution offunctional receptors for human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)：evidence that the protein encoded by the AIC2B cDNA is a subunit of the murine GM-CSF receptor.Proc Natl Acad Sci USA 88：5082-5086.
Lopez AF，Vadas MA，Woodcock JM，Milton SE，Lewis A，Elliott MJ，Gillis D，lreland R，Olwell E，Park LS.(1991)Interleukin-5，interleukin-3，and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor cross-compete for binding to cell surface receptors on human eosinophils.J Biol Chem 266：24741-24747.
Moonen P，Mermod JJ，Ernst JF，Hirschi M，DeLamarter JF(1987)Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells.Proc Natl Acad Sci USA 84：4428-4431.
Robson M，Kucukcelebi A，Carp SS，Hayward PG，Hui PS，Cowan WT，Ko F，Cooper DM(1994)Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on wound contraction.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 3 Suppl 2：S41-S46.
Sato N，Sakamaki K，Terada N，Arai K，Miyajima A(1993)Signal transduction by the high-affinity GM-CSF receptor：two distinct cytoplasmic regions of the common beta subunit responsible for different signaling.EMBO J 12：4181-4189.
Shanafelt AB，Miyajima A，Kitamura T，Kastelein RA(1991a)The amino-terminal helix of GM-CSF and IL-5 governs high affinity binding to their receptors.EMBO J 10：4105-4112.
Shanafelt AB，Johnson KE，Kastelein RA(1991b)Identification of critical amino acid residues in human and mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and their involvement in species specificity.J Biol Chem 266：13804-13810.
Smith DM，Snow DE，Rees E，Zischkau AM，Hanson JD，Wolcott RD，Sun Y，White J，Kumar S，Dowd SE(2010)Evaluation of the bacterial diversity of pressure ulcers using bTEFAP pyrosequencing.BMC Med Genomics 3：41.
Szoka F Jr，Papahadjopoulos D(1980)Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles(liposomes).Annu Rev Biophys Bioeng 9：467-508.
Wong GG，Witek JS，Temple PA，Wilkens KM，Leary AC，Luxenberg DP，Jones SS，Brown EL，Kay RM，Orr EC，et al(1985)Human GM-CSF：molecular cloning of the complementary DNA and purification of the natural and recombinant proteins.Science 228：810-815.