使用人乳寡糖增强对病原体的粘膜先天免疫反应和/或检测的方法与流程

本申请要求2014年4月8日提交的第61/976,791号美国临时申请的优先权和任何权益，该申请的内容通过引用整体并入本文中。

公开领域

本公开涉及用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应或个体对病原体的粘膜先天免疫检测的方法。具体地讲，本公开涉及包括人乳寡糖的营养组合物用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应或个体对病原体的粘膜先天免疫检测的用途。

背景

免疫系统在保护个体免受病原体感染中起重要作用。通常，免疫反应的有效性取决于免疫系统检测和响应病原体感染的能力。免疫系统对病原体感染的检测和响应依赖于特定免疫蛋白的表达。

概述

本文公开了用于增强个体中的粘膜先天免疫的方法。这种免疫是通过向个体施用包括人乳寡糖(HMO)的营养组合物来增强。

公开了一种用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的方法。所述方法包括向个体施用营养组合物的步骤。所述营养组合物包括约0.05至约0.5mg/mL 2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、约0.05至约0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的组合。

本公开还提供了用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的营养组合物，其中所述营养组合物包含约0.05至约0.5mg/mL 2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、约0.05至约0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的组合。

本公开还提供了营养组合物用于制造用来增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的药物的用途，其中所述组合物包含约0.05至约0.5mg/mL 2’-FL、约0.05至约0.5mg/mL LNnT或二者的组合。

在另一个方面，公开了一种用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的方法。所述方法包括向个体施用营养组合物的步骤。所述营养组合物包括中性人乳寡糖。

本公开还提供了用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的营养组合物，其中所述营养组合物包含中性人乳寡糖。

本公开还提供了营养组合物用于制造用来增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的药物的用途，其中所述组合物包含中性人乳寡糖。

附图简述

图1(A-D)提供了图表，其示出了在暴露于实施例1中所述的各种治疗的细胞中编码各种粘膜先天免疫受体蛋白和细胞因子IL1B的基因的RNA表达水平的变化。

图2是示出了在暴露于实施例2中所述的各种治疗的细胞中编码粘膜先天免疫防御蛋白MUC2的基因的RNA表达水平的变化的图表。

详述

本公开涉及用于增强个体中的粘膜先天免疫的方法。更明确地说，这种免疫是通过向个体施用包括人乳寡糖(HMO)的营养组合物来增强。

公开了一种用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的方法。所述方法包括向个体施用营养组合物的步骤。所述营养组合物包括约0.05至约0.5mg/mL 2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、约0.05至约0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的组合。

本公开还提供了用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的营养组合物，其中所述营养组合物包含约0.05至约0.5mg/mL 2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、约0.05至约0.5mg/mL乳-N-新四糖(LNnT)或二者的组合。

本公开还提供了营养组合物用于制造用来增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应的药物的用途，其中所述组合物包含约0.05至约0.5mg/mL 2’-FL、约0.05至约0.5mg/mL LNnT或二者的组合。

在另一个方面，公开了一种用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的方法。所述方法包括向个体施用营养组合物的步骤。所述营养组合物包括中性人乳寡糖。

本公开还提供了用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的营养组合物，其中所述营养组合物包含中性人乳寡糖。

本公开还提供了营养组合物用于制造用来增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的药物的用途，其中所述组合物包含中性人乳寡糖。

在本说明书中，涉及方法的内容在适当的时候也适用于组合物，反之亦然。

本公开的适用性的其它范围将从下文提供的详细描述、附图和权利要求变得显而易见。应当理解，详细描述(包括公开的实施方案和附图)在本质上仅仅是示例性的，仅旨在用于说明的目的，并且不旨在限制本发明的范围、其应用或用途。

除非本文另有说明，否则术语“施用”应该被理解为包括：a)向个体提供营养组合物；b)消耗营养组合物的行为；及其组合。

除非本文另有说明，否则如本文所使用的术语“营养组合物”指的是各种形式的营养产品，包括但不限于：液体、固体、粉末、半固体、半液体、营养补充剂以及本领域中已知的任何其它营养食品。应当理解的是，在施用给个体(例如，提供给个体或被其消耗)之前，粉末形式的营养组合物可以在加入水或其它液体后被重构以形成液体营养组合物。如下面所讨论，在本文所公开的某些实施方案中，营养组合物包括下列中的至少一种：蛋白质来源、碳水化合物来源和脂肪来源。本文所公开的营养组合物通常适用于由人口服消耗。

除非本文另有说明，否则术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于：人、驯养家畜(例如，牛、马、猪)或宠物(例如，狗、猫)。在本文所公开的某些实施方案中，个体是人。

除非本文另有说明，否则术语“大体上不含”意指营养组合物含有小于功能量的成分。这个量会根据成分而变化，但以这种成分的重量计，通常小于约1％，包括小于约0.5％，包括小于约0.1％，包括小于约0.01％，包括小于约0.001％，并且还包括0％。

除非本文另有说明，否则如本文所使用的术语“人乳寡糖”或“HMO”是指在人母乳中发现的许多复合碳水化合物(其可以为酸性或中性形式)和其前体。示例性人乳寡糖包括但不限于乳-N-新四糖和2'-岩藻糖基乳糖。示例性人乳寡糖前体包括但不限于岩藻糖。作为人母乳的自然成分，HMO的特性在很大程度上被认为是良性的。术语“人乳寡糖”或“HMO”应该被理解为包括“中性HMO”，例如岩藻糖基化寡糖和N-乙酰化寡糖。

用于本文所公开的方法中的营养组合物可以包含如本文所描述的产品的元素以及本文所描述的或在营养产品应用中另外有用的任何额外的或可选的元素、由其组成或基本上由其组成。例如，如本文所使用，术语“包含”意指组合物或方法包括所列举的特征，但是不排除其它特征，并且术语“由…组成”意指组合物或方法仅包括所列举的特征。

除非本文另有说明，否则所提供的HMO的浓度是在施用给个体的营养组合物中的HMO的浓度。所述浓度是在稀释浓缩液体或将粉末与液体混合以形成适于施用给个体的液体营养组合物后的最终浓度。

如先前所论述，本文公开了用于增强个体中的粘膜先天免疫的方法。在一些实施方案中，粘膜先天免疫增强涉及增强下列中的一者或二者：个体对病原体的粘膜先天免疫反应和个体对病原体的粘膜先天免疫检测。该增强是通过向个体施用包括一种或多种HMO的营养组合物而实现，如本文中进一步详细描述。

通常，包括在用于本文所公开的方法中的营养组合物中的HMO可以包括本领域中已知的多种HMO中的任一个。此类HMO包括在人母乳中发现的寡糖。在某些实施方案中，适用于在所公开的方法中使用的营养组合物的HMO包括任何中性HMO，包括HMO前体。中性HMO和前体的具体非限制性实例包括：D-葡萄糖(Glc)；D-半乳糖(Gal)；L-岩藻糖(Fuc)；乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-六糖、对-乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-新六糖；岩藻糖基寡糖(即，乳-N-岩藻五糖I；乳-N-岩藻五糖II；2'-岩藻糖基乳糖；3'-岩藻糖基乳糖；乳-N-岩藻五糖III；乳-N-二岩藻六糖I；和乳二岩藻四糖)。这些HMO更全面地描述于美国专利申请公开第2009/0098240号中，该申请在此通过引用整体并入本文中。在某些实施方案中，用于在所公开的方法中使用的营养组合物中的HMO包括以下HMO中的至少一种：乳-N-新四糖(LNnT)和2'-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。

在某些实施方案中，营养组合物可以包括或不包括本文所公开的任何HMO或HMO的组合。在具体实施方案中，当营养组合物包括LNnT或2'-FL时，营养组合物大体上不含其它HMO。在其它实施方案中，营养组合物包括LNnT和2'-FL二者。另外，在具体实施方案中，营养组合物大体上不含除LNnT或2'-FL以外的任何HMO。换句话说，在这样的实施方案中，营养组合物可以：(1)含有LNnT，但大体上不含所有其它HMO；(2)含有2'-FL，但大体上不含所有其它HMO；或(3)可以含有LNnT和2'-FL，但大体上不含所有其它HMO。

在一些实施方案中，HMO是以在营养组合物中的HMO的总量(即，存在的所有HMO)(mg总HMO/mL施用的营养组合物)为至少约0.001mg/mL存在于营养组合物中，包括至少约0.01mg/mL，包括约0.001mg/mL至约20mg/mL，包括约0.01mg/mL至约20mg/mL，包括约0.001mg/mL至约10mg/mL，包括约0.01mg/mL至约10mg/mL，包括约0.001mg/mL至约5mg/mL，包括约0.01mg/mL至约5mg/mL，包括约0.001mg/mL至约1mg/mL，包括约0.001mg/mL至约0.23mg/mL，包括约0.01mg/mL至约0.23mg/mL总HMO含于营养组合物中。通常，营养组合物中的总HMO的量将取决于所存在的一种或多种特定HMO以及营养组合物中的其它组分的量。

在2’-FL存在于营养组合物中并且该营养组合物被用于增强对病原体的粘膜先天免疫检测的方法中的一些实施方案中，2’-FL是以约0.001mg/mL至约2.5mg/mL，包括约0.01mg/mL至约2.5mg/mL的量存在。在一些实施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL的浓度存在于营养组合物中，包括小于0.5mg/mL，包括约0.05至约0.5mg/mL，且包括约0.05至约0.25mg/mL。

在2’-FL存在于营养组合物中并且该营养组合物被用于增强对病原体的粘膜先天免疫反应的方法中的其它实施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL，包括小于0.5mg/mL，包括约0.05至约0.5mg/mL，且包括约0.05至约0.25mg/mL的浓度存在。

在LNnT存在于营养组合物中的一些实施方案中，LNnT是以约0.001mg/mL至小于约0.2mg/mL，包括约0.01mg/mL至小于约0.2mg/mL，以及大于约0.32mg/mL，包括约2mg/mL的量存在。在一些实施方案中，LNnT是以小于1mg/mL，包括小于0.5mg/mL，包括约0.05至约0.5mg/mL，且包括约0.25mg/mL至约0.5mg/mL的浓度存在于营养组合物中。

在一些实施方案中，营养组合物可以含有任何本文所公开的HMO的任何组合。这些HMO可以以个别HMO浓度的任何组合或本文所公开的总HMO浓度存在。因此，在一些实施方案中，营养组合物包括LNnT和2'-FL二者，它们各自具有小于1mg/mL的浓度。在具体的实施方案中，营养组合物包括LNnT和2'-FL，它们各自具有约0.05至约0.5mg/mL的浓度。

在某些实施方案中，HMO是合成的，例如，通过微生物发酵、酶处理、化学合成或其组合而产生。

申请人已意外地发现，特定HMO(例如，LNnT和2'-FL)可以用于增强个体中的粘膜先天免疫。出乎意料的是，这些HMO可以用于增强下列中的一个或多个：个体对病原体的粘膜先天免疫反应以及对病原体的粘膜先天免疫检测。申请人已经鉴定了方法，其包括施用含有一种或多种HMO(包括上述的那些HMO)的营养组合物来增强个体的粘膜先天免疫。

在一些实施方案中，个体对病原体的粘膜先天免疫反应是通过施用包括LNnT和2'-FL中的一个或两个的营养组合物来增强。在这些实施方案的某些中，如果存在，2'-FL是以约0.05至约0.5mg/mL的浓度存在，且如果存在，LNnT是以约0.05至约0.5mg/mL的浓度存在。

不受理论的束缚，据信本文所公开的方法(即，施用包含上述HMO的营养组合物)通过增加免疫蛋白的表达来增强个体中对病原体的粘膜先天免疫反应。在一些实施方案中，向个体施用营养组合物通过增加以下物质的表达来增强个体对病原体的粘膜先天免疫反应：一种或多种粘膜先天免疫受体、一种或多种细胞因子、一种或多种粘膜先天免疫防御蛋白或其组合。在特定实施方案中，表达中增加的粘膜先天免疫受体是Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)和趋化因子受体2(CCR2)中的一种或多种。在特定实施方案中，细胞因子白介素-1β(IL1B)的表达增加。在特别具体的实施方案中，粘膜先天免疫防御蛋白是粘蛋白2(MUC2)。不受理论的束缚，据信粘膜先天免疫受体和细胞因子的表达增加可以通过增强先天防御和/或改善粘膜免疫功能来增强对病原体的粘膜先天免疫反应。这些受体的表达增加被认为导致具有抗微生物活性的粘膜先天免疫防御蛋白(包括MUC2)的表达增加，这导致增强的抗微生物反应。

在一些实施方案中，个体对病原体的粘膜先天免疫检测是通过施用包括中性HMO的营养组合物来增强。中性HMO可以是任何中性HMO，包括上文所列举的任何中性HMO。在特别具体的实施方案中，用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的中性HMO是2’-FL。在2’-FL是中性HMO的那些实施方案中，2’-FL可以以本文所公开的任何浓度存在于营养组合物中。在特定的实施方案中，2’-FL是以小于1mg/mL的浓度存在于营养组合物中。在另一个特别具体的实施方案中，用于增强个体对病原体的粘膜先天免疫检测的中性HMO是LNnT。在LNnT是中性HMO的那些实施方案中，LNnT可以以本文所公开的任何浓度存在于营养组合物中。在特定的实施方案中，LNnT是以小于1mg/mL的浓度存在于营养组合物中。

不受理论的束缚，据信本文所公开的方法(即，施用包含上述HMO的营养组合物)通过增加免疫蛋白的表达来增强个体中对病原体的粘膜先天免疫检测。在一些实施方案中，向个体施用营养组合物通过增加一种或多种粘膜先天免疫受体的表达和/或通过增加一种或多种细胞因子的表达来增强个体的粘膜先天免疫检测。在特定实施方案中，粘膜先天免疫受体是TLR3、TLR4和CCR2中的一个或多个。在特定实施方案中，细胞因子是IL1B。不受理论的束缚，据信这些受体和/或IL1B的表达增加通过增加个体对病原体的免疫监视来增强对病原体的粘膜先天免疫检测。

在一些实施方案中，本文所公开的方法涉及施用具有HMO的选定组合的营养组合物。HMO的组合可以是本文所公开的或本领域中另外已知的HMO的任何组合，只要该组合能有效增加粘膜先天免疫。在一些实施方案中，所述方法涉及施用含有2’-FL和LNnT中的一种而非两种的营养组合物。在其它实施方案中，所述方法涉及施用大体上不含除2’-FL或LNnT以外的任何HMO的营养组合物。

在一些实施方案中，所述方法涉及施用营养组合物，其包括浓度各自低于约0.5mg/mL的LNnT和/或2’-FL。在一些实施方案中，所述方法涉及施用含有约0.05至约0.25mg/mL 2’-FL和/或约0.25mg/mL至约0.5mg/mL LNnT的营养组合物。

在一些实施方案中，本文所公开的方法涉及施用包括下列中的至少一种的营养组合物：蛋白质来源、碳水化合物来源和脂肪来源。应当理解的是，蛋白质来源包括一种或多于一种蛋白质来源，碳水化合物来源包括一种或多于一种碳水化合物来源，并且脂肪来源包括一种或多于一种脂肪来源。另外，某些来源可以提供一种以上的常量营养物(例如，脂肪和蛋白质)。

在其中营养组合物包括蛋白质来源的那些实施方案中，所述蛋白质来源可以包括但不限于下列中的一个或多个：乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、酸性酪蛋白、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、酪蛋白酸钾、酪蛋白水解物、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、乳蛋白水解物、脱脂奶粉、浓缩脱脂乳、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、大豆蛋白水解物、豌豆蛋白浓缩物、豌豆蛋白分离物、豌豆蛋白水解物、胶原蛋白、马铃薯蛋白、大米蛋白、真菌蛋白、由微生物表达的蛋白质及其组合。

在其中营养组合物包括碳水化合物来源的那些实施方案中，所述碳水化合物来源可以包括但不限于下列中的一个或多个：麦芽糊精；水解或改性淀粉或玉米淀粉；葡萄糖聚合物；玉米糖浆；玉米糖浆固体；大米来源的碳水化合物；高果糖玉米糖浆；蜂蜜；糖醇，诸如麦芽糖醇、赤藓糖醇、山梨糖醇、甘油；蔗糖；葡萄糖；果糖；乳糖；异麦芽酮糖、舒可曼(sucromalt)、普鲁兰(pullulan)、马铃薯淀粉和其它缓慢消化的碳水化合物；寡糖，诸如寡聚果糖或寡聚半乳糖；膳食纤维，包括但不限于燕麦纤维、菊粉、聚右旋糖、大豆纤维、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、瓜耳胶、结冷胶、刺槐豆胶、魔芋粉、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐胶、阿拉伯胶、壳聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、黄原胶、藻酸盐、果胶、低和高甲氧基果胶、谷类β-葡聚糖、角叉菜胶和洋车前子、水溶性膳食纤维如耐消化性麦芽糊精、抗性改性食物淀粉、其它抗性淀粉；水果或蔬菜来源的可溶性和不溶性纤维；及其组合。

在其中营养组合物包括脂肪来源的那些实施方案中，所述脂肪来源可以包括但不限于下列中的一个或多个：椰子油、分馏椰子油、大豆油、玉米油、橄榄油、红花油、高油酸红花油、中链甘油三酯油、高γ-亚麻酸红花油、向日葵油、高油酸向日葵油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、菜籽油、海洋油、藻类油、棉籽油、互酯化油、转酯化油、甘油单酯、甘油二酯、游离脂肪酸及其组合。营养组合物还可以包括本文所描述的蛋白质、碳水化合物和脂肪来源的任何组合。

通常，本文所公开的方法涉及以允许增强对病原体的粘膜先天免疫反应和/或增强对病原体的粘膜先天免疫检测的任何方式施用营养组合物。

在一些实施方案中，本文所公开的方法涉及将营养组合物口服施用给个体。如本文所定义，口服施用包括其中营养组合物通过个体的食道的任何施用方式。例如，口服施用通常是指口服食用，但还可以包括鼻胃插管，其中将一根管子从个体的鼻部移动到胃部以施用组合物。特别合适的口服制剂包括营养饮料、粉末、棒状物、凝胶或撒在食物上或溶解在水中的囊袋(sachet)。

一般，在本文所公开的方法中使用的营养组合物可以是能够有效地提供给个体以增强个体的粘膜先天免疫的任何形式。在具体的实施方案中，营养组合物为以下形式中的一种或多种：液体和粉状膳食补充剂、液体和粉状人乳强化剂、液体和粉状早产婴儿配方、液体和粉状婴儿配方、液体和粉状要素和半要素配方、液体和粉状儿科配方、液体和粉状幼儿配方、液体和粉状较大婴儿配方以及液体、粉状和固体成人营养配方。

在其它实施方案中，所述方法涉及向个体局部施用HMO(例如，2’-FL、LNnT或两者)。局部施用涉及将包括HMO的组合物施加到其中将发生充分吸收的部位(例如，粘膜表面如鼻腔、肺腔、阴道腔、眼或皮肤)。局部施用的常见形式包括但不限于：滴剂、喷雾剂、乳膏、软膏、洗剂、糊剂、凝胶剂、气雾剂和沐浴油。

在本文所公开的方法中施用的营养组合物通常可以通过本领域中已知的方法来制备。此类方法公开于多个专利申请公开和专利中，包括美国专利公开2012/0172307A1、美国专利6,365,218、美国专利6,306,908和美国专利公开2003/0118703A1，它们各自通过引用并入本文中以用于参考此类方法的公开内容。

例如，在一种合适的制造方法中，制备至少三种不同的浆料，包括脂肪包蛋白质(PIF)浆料、碳水化合物-矿物质(CHO-MIN)浆料和水包蛋白质(PIW)浆料。PIF浆料是通过加热和混合油(例如，菜籽油、玉米油等)以及然后在持续加热和搅动下添加乳化剂(例如，卵磷脂)、脂溶性维生素和总蛋白质的一部分(例如，乳蛋白浓缩物)而形成。CHO-MIN浆料是通过在加热搅动下将矿物质(例如，柠檬酸钾、磷酸氢二钾、柠檬酸钠等)、痕量和超痕量矿物质(TM/UTM预混物)、增稠剂或悬浮剂(例如微晶纤维素(avicel)、结冷胶、角叉菜胶)加入水中而形成。所得的CHO-MIN浆料保持继续加热和搅动10分钟，然后添加其它矿物质(例如，氯化钾、碳酸镁、碘化钾等)和/或碳水化合物(例如，HMO、寡聚果糖、蔗糖、玉米糖浆等)。然后通过加热混合和搅拌剩余的蛋白质(如果有的话)形成PIW浆料。然后通过加热搅拌将所得浆料混合在一起并将pH调节至6.6-7.0，之后对该组合物进行高温短时(HTST)加工，在此期间该组合物经热处理、乳化和均质化，且然后冷却。添加水溶性维生素和抗坏血酸，必要时将pH调节至所需范围，添加香料，并加水以达到所需的总固体水平。然后无菌包装所述组合物以形成无菌包装的营养乳液。该乳液然后可以进一步被稀释，经热处理，并包装形成即食或浓缩液体，或者它可以经热处理并且随后被加工和包装成可复水粉末，例如喷雾干燥的、干混的、团聚的。

在一些实施方案中，本文所公开的方法是针对对病原体感染具有特定倾向或易感性的个体或可能已经表现出感染症状的个体。此类个体可以被认定为“需要”治疗。在具体的实施方案中，“需要”治疗的个体具有下列中的一个或多个：肠道感染、炎性肠病、肠易激综合征、坏死性小肠结肠炎、结肠炎、肠梗阻、慢性应激、其它胃肠道疾病、抗生素疗法、放射疗法、化学疗法、手术、其它治疗或疗法；和脱水。

具有增强的粘膜先天免疫的个体可以通过本领域中已知的任何方法来鉴定。在一些实施方案中，个体对病原体的粘膜先天免疫反应的增强是由通过个体具有先天免疫受体、选择细胞因子和先天免疫防御蛋白中的一种或多种的增加表达来鉴定。先天免疫受体是TLR3、TLR4和CCR2中的一个或多个。IL1B是选择细胞因子的实例。先天免疫防御蛋白优选是MUC2。

在一些实施方案中，个体对病原体的粘膜先天免疫检测的增强是由通过个体具有先天免疫受体和选择细胞因子中的一种或多种的增加表达来鉴定。如上所讨论，先天免疫受体是TLR3、TLR4和CCR2中的一个或多个。IL1B是选择细胞因子的实例。

在一些实施方案中，个体对病原体的粘膜先天免疫检测、对病原体的粘膜先天免疫反应或两者的增强是通过在将本文所公开的营养组合物施用给模型生物体之后在该模型生物体中测量先天免疫受体、选择细胞因子和先天免疫防御蛋白中的一种或多种的表达变化来鉴定。模型生物体可以是用于测量这些性质的任何已知的模型生物体。在一些实施方案中，模型生物体是猪，并且具体地说是小猪。

实施例

以下实施例说明本文所公开的方法的具体和示例性实施方案、特征或二者。虽然这些实施例描述了本文所述的特定HMO的使用，但是应该认识到，下文所述的方案可以用于测试任何HMO和由其制成的营养组合物增强个体中的粘膜先天免疫的能力。这些实施例只是为了说明的目的而提供并且不应被视为对本公开的限制。

实施例1：HMO增加粘膜先天免疫受体和选择细胞因子的表达

在此研究中，暴露于2’-FL或LNnT的细胞在体外暴露分析中单独表现出增加的粘膜先天免疫受体的表达。

通过将LS174T人结直肠癌细胞(其为人肠道杯状细胞的模型)暴露于HMO(2’-FL或LNnT)中的任一个来测试HMO增加粘膜先天免疫受体和细胞因子的表达的能力。LS174T细胞是从美国模式培养物保藏中心(ATCC)获得。LS174T细胞维持在补充有10％Fetalplex、1.5g/L Na₂CO₃、10ml/L青霉素G-链霉素溶液的37℃5％CO₂下的最低必需培养基中。将细胞以0.2x 10⁵个细胞/ml/孔接种在24孔板上，并使其附着24-30小时。通过将冻干的HMO再悬浮于细胞培养级水中至10％溶液并过滤灭菌，然后在培养基中稀释到适当的水平来制备含有各HMO的溶液。使用相同的程序制备不含碳水化合物的溶液(即，仅有新鲜培养基，对照)。在制备含HMO的溶液之后，用1X HBSS冲洗LS174T细胞培养物，然后在0.5ml单独的新鲜培养基(对照)或含有0.1mg/mL或1mg/mL 2’-FL(2FL)、LNnT(LNnT)、岩藻糖(FUCOSE)或乳糖(LAC)的新鲜培养基中孵育48小时。在孵育结束时用1ml TRIzol收获细胞以获得RNA样品。

通过来自这些细胞的RNA样品的定量逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定粘膜先天免疫受体蛋白TLR3、TLR4、CCR2和细胞因子IL1B的基因的RNA表达水平。所述受体蛋白和细胞因子的基因的RNA表达水平的倍数变化(倍数诱导)基于GUSB转录物表达的变化进行归一化。记录的倍数变化是平均值+/-3SEM。在倍数表达方面具有统计显著差异的治疗(P<0.05)用不同的字母在条形柱上记录。

如图1A-1D中所示，暴露于浓度为1mg/mL的2’-FL的细胞相对于对照表现出所述四种基因中每一种的RNA表达的统计显著性倍数变化。暴露于浓度为0.1mg/mL的2’-FL的细胞相对于对照表现出TLR3、TLR4和CCR2的RNA表达的统计显著性倍数变化。出乎意料的是，这些基因响应于0.1mg/mL 2’-FL治疗比响应于1mg/mL2’-FL治疗具有更大的表达增加。特别出乎意料的是以下结果：在所测试的HMO中，只有2’-FL在0.1mg/mL的较低水平下显示出多于一种基因(更具体地说，三种基因)的表达增加。

图1A-1D中还示出了将细胞暴露于1mg/mL LNnT相对于对照产生所有四种基因的显著的表达变化。CCR2表达在0.1mg/mL的LNnT浓度下也显著提高。

实施例2：HMO增加粘膜先天免疫防御蛋白的表达

在此研究中，暴露于2’-FL的细胞在体外暴露分析中单独表现出增加的粘膜先天免疫防御蛋白MUC2的表达。

如实施例1中所述进行实验，除了qRT-PCR分析的目标是测量编码MUC2的基因的RNA表达以外。如图2中所示，暴露于0.1mg/mL 2’-FL的细胞表现出显著增加的MUC2基因表达。

除非本文另有说明，否则所有子实施方案和任选的实施方案是本文所述的所有实施方案的相应的子实施方案和任选的实施方案。虽然本申请已通过其实施方案的描述加以说明，且虽然已相当详细地描述了这些实施方案，但申请人无意将随附权利要求的范围约束或以任何方式限制于这样的细节。本领域技术人员将容易了解其它优点和修改。因此，本申请在更广泛的方面并不限于所示出和描述的具体细节、代表性组合物或制剂和说明性实施例。因此，在不脱离本文中申请人的一般公开内容的精神或范围的情况下可以违背此类细节。

就在本说明书或权利要求中使用术语“包括(includes/including)”而言，其旨在以类似于术语“包含”在被用在权利要求中作为连接词时所解释的方式具有包含性。此外，就采用术语“或”(例如A或B)而言，旨在意指“A或B或两者”。当申请人意图指示“仅A或B而非两者”时，将采用术语“仅A或B而非两者”。因此，在本文中使用术语“或”是包含性而非排它性使用。另外，就在本说明书或权利要求中使用术语“在...中”或“到...中”而言，其旨在另外意指“在...上”或“到...上”。此外，就在本说明书或权利要求中使用术语“连接”而言，其旨在不仅意指“直接连接”，而且还意指“间接连接”，诸如经由另外一个或多个组件连接。

如在本发明的说明和随附权利要求书中所使用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”意图也包括复数形式。