用于增强多糖‑蛋白质缀合物的免疫原性的组合物和方法与流程

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技术领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域，具体地讲，涉及用于增强多糖-蛋白质缀合物的免疫原性的方法和组合物。

背景技术：

多糖与载体蛋白共价缀合可将多糖从半抗原转化为免疫原(例如，在儿童中)，从而增强多糖的免疫原性。基于此类多糖-蛋白质缀合物的疫苗已广泛用于儿童中，用于预防肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Pn)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)(Men)和b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)引发的细菌感染。

各种类型的载体蛋白已经用于制备多糖-蛋白质缀合物，包括破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素无毒突变体CRM197以及Hib的重组表面蛋白D。然而，由于不同载体蛋白具有各异的免疫特性，缀合到不同载体蛋白的相同多糖可在免疫动物中表现出不同程度的免疫原性。因此，使用不同技术制备的载体蛋白可产生具有各种免疫原性特性的多糖-蛋白质缀合物疫苗。

在免疫学中已经明确确定，免疫原进入动物体内后，由抗原递呈细胞(APC)加工成APC内的表位，所述表位被并入到主要组织相容性复合物(MHC)中并在APC的表面上展示，以供T淋巴细胞识别。以下三个因素促成给定表位的免疫原性：(1)产生适当的表位；(2)表达MHC分子以结合到该表位；(3)表达T细胞受体以识别该MHC-表位复合物。缺乏这三个因素中的任何一个都会导致对免疫原的免疫应答不足或丧失。

小鼠实验已表明缺乏适当的MHC-表位复合物是对免疫原的免疫应答丧失的最常见原因。MHC分子表现出高度的多态性。每个表位可能能够与MHC分子的一个或几个等位基因形成复合物，但是表位很少能够与MHC分子的所有等位基因形成复合物。另外，对免疫原的不当加工或T细胞耐受性的缺乏可导致免疫应答丧失。

实验表明，破伤风类毒素的三个表位中的两个(即QYIKANSKFIGITEL(称为P2)表位和FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(称为P30)表位)以及卵清蛋白的ISQAVHAAHAEINEAGR(称为OVAp)表位可结合到多种不同的MHC II类分子(Panina-Bordignono P et al.(1989)“Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells.”Eur.J.Immunol.19:2237-2242(Panina-Bordignono P等人，1989年，“通用免疫原性T细胞表位与人MHC II类模糊结合并且被T细胞模糊识别”，《欧洲免疫学杂志》，第19卷，第2237-2242页))。这些表位可以被T细胞识别，并且表现出广泛的免疫原特性。因此，这些表位被称为通用表位。

通用表位可结合到许多人MHC II类分子同种型和等位基因型。可利用此类通用表位的广泛MHC结合特性来开发能够在群体中的大多数个体中诱导免疫应答的疫苗。

研究表明，P2表位由破伤风类毒素的氨基酸830-844(QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO:1))组成。P30表位由破伤风类毒素的氨基酸947-967(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO:2))组成。OVAp表位由卵清蛋白的氨基酸323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO:3))组成。具有这些表位序列的蛋白质被APC摄入，然后被降解，但表位被保留下来并结合到MHC分子，以在APC的表面上展示并被T细胞识别。这些通用表位可通过相同的机制与多种类型的HLA-DR相互作用。

MHC分子是经加工的免疫原的受体，其主要功能是在胸腺中针对外源性免疫原而诱导免疫耐受和外周免疫应答期间展示来源于免疫原的表位。一方面，如果MHC分子展示大量的某种表位，则预计免疫原的T细胞识别水平增加，但代价是消耗大部分的T细胞储库，从而导致免疫耐受。另一方面，如果MHC分子仅展示少量的某种表位，则T细胞储库得以保存，但只有少量的外源性免疫原可有效递呈来触发外周免疫应答。因此，来自外源性免疫原的有效表位必须使得MHC分子在所展示表位的数目方面达到平衡。有一些免疫原具有少量代表性的表位，这些表位由APC加工后保持高度的序列完整性，并且可触发一定量的T细胞建立免疫记忆，而不会消耗过多的T细胞而导致免疫耐受。具有此类表位的免疫原具有强免疫原性，这种现象解释了为什么破伤风类毒素具有非常强的免疫原性。

大多数目前已知的T细胞表位对非特异性MHC II类单体型具有有限的免疫原性功能。不同个体保存和展示相同免疫原内的不同表位序列以触发其T细胞。大多数表位在具有不同MHC II类单体型的群体中诱导T细胞具有此类遗传限制，这严重阻碍了合成疫苗的开发。可触发具有各异的MHC II类单体型的个体(诸如在小鼠和/或人中)的表位的发现有希望提供激活T细胞的通用策略。通用表位(诸如P2、P30、OVAp等)可并入到天然蛋白质免疫原中。所融合的实体被称为T细胞抗原簇，这种抗原簇在大多数个体中可被MHC II类分子识别。此类T细胞抗原簇可直接用于诱导T细胞，或用于促进B细胞针对弱免疫原产生抗体，从而增强免疫应答。

病原菌通常表达用于包被细菌细胞表面的高分子量荚膜多糖(CP)。荚膜多糖对于成人来说是优质的免疫原，可用于制备有效的疫苗。但对于儿童(尤其是2岁以下的幼儿)来说，CP被认为是T细胞非依赖性抗原。实验表明，CP可在野生型和T细胞缺陷型小鼠中诱导CP特异性IgM抗体的产生。然而，CP不能诱导IgM抗体转化为IgG抗体。从人类获得的数据还证明，CP可在成人中诱导保护性抗体的产生，但CP不能在婴幼儿中诱导免疫应答。具体地讲，在用CP抗原对儿童进行反复疫苗接种后，对第二次疫苗接种的应答并未增强，这种疫苗接种所诱导的持续性T细胞记忆也不存在。

免疫学实验已经确定，基于多糖-蛋白质缀合物的疫苗比基于纯多糖的疫苗更有优势，因为所诱导的体液免疫应答与多糖-蛋白质缀合物相关。可将T细胞非依赖性CP抗原共价连接到载体蛋白以获得多糖-蛋白质缀合物。使用这种多糖-蛋白质缀合物来免疫哺乳动物可诱导T细胞以促进B细胞产生CP特异性IgG抗体。因此，多糖-蛋白质缀合物可诱导CP特异性IgM转化为IgG、记忆B细胞分化以及建立长期的T细胞记忆。

基于多糖缀合物的疫苗在预防严重感染(诸如，b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟氏菌)中起到了重要作用。然而，由于具体的多糖和免疫原性载体蛋白的结构的变化性，目前基于多糖-蛋白质缀合物的疫苗在免疫原性方面具有高度的变异性。在某些高风险群体(诸如，儿童、老年人和免疫受损的个体)中，具有弱免疫原性的多糖的蛋白质缀合物通常没有效果，并且其保护作用也相当有限。因此，开发基于具有较强免疫原性的多糖-蛋白质缀合物的疫苗仍然是本领域急需的方面。

本文所公开的所有参考文献、出版物和专利申请特此全文以引用方式并入。

技术实现要素：

本发明提供了用于使用包含通用表位的嵌合载体蛋白来增强多糖抗原的免疫原性的组合物和方法。还提供了基于多糖-嵌合载体蛋白缀合物的免疫原性组合物和疫苗、治疗细菌感染的方法以及制备所述多糖-嵌合载体蛋白缀合物的方法。

在本申请的一个方面，提供了一种包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原共价结合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，通用表位的长度为约8至约20个氨基酸。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，载体蛋白来源于白喉毒素的CRM197的A链。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，通用表位与载体蛋白经由设置在其间的肽接头共价融合。在一些实施例中，肽接头是选自甘氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物或丙氨酸-丝氨酸聚合物的柔性接头。在一些实施例中，肽接头的长度介于1至20个氨基酸残基之间。在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32中任一者的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44中任一者的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56中任一者的氨基酸序列。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，多糖抗原的平均分子量介于约10kDa至约1000kDa之间(诸如，约10kDa至100kDa、100kDa至500kDa或者500kDa至1000kDa中的任一者)。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。

在根据上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，荚膜多糖来源于选自以下血清型的肺炎链球菌：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，荚膜多糖来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)。在一些实施例中，荚膜多糖来源于选自以下血清型的脑膜炎奈瑟氏菌：A、C、Y和W-135。

在本申请的一个方面，提供了包含上述多糖-蛋白质缀合物中任一种或任何组合的免疫原性组合物。在一些实施例中，所述免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物中的至少两种包含彼此不同的载体蛋白。

在根据本文所述的免疫原性组合物中任一种的一些实施例中，免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物中的至少两种包含来源于彼此不同的细菌菌种的多糖抗原。

在根据本文所述的免疫原性组合物中任一种的一些实施例中，免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于相同物种的不同血清型的细菌的多糖抗原。在一些实施例中，免疫原性组合物包含13种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含24种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含4种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖：A、C、Y和W-135。

在根据上述免疫原性组合物中任一种的一些实施例中，免疫原性组合物还包含佐剂。在一些实施例中，所述佐剂是磷酸铝或氢氧化铝。

在本申请的一个方面，提供了一种包含上述免疫原性组合物中任一种和药学上可接受的载体的疫苗。

在本申请的一个方面，提供了一种针对由细菌引起的疾病来免疫个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的上述免疫原性组合物中的任一种或上述疫苗中的任一种，其中所述多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。在一些实施例中，免疫原性组合物或疫苗以至少两种剂量向个体施用。在一些实施例中，疾病是由肺炎链球菌引起的肺炎、耳部感染、鼻窦感染、脑膜炎或菌血症。在一些实施例中，疾病是由b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝织炎、关节炎或耳部感染。在一些实施例中，疾病是由脑膜炎奈瑟氏菌引起的脑膜炎或脑膜炎球菌血症。

在根据上述免疫方法中任一种的一些实施例中，个体对多糖抗原具有不良的免疫应答。

在根据上述免疫方法中任一种的一些实施例中，个体是约2岁以下的儿童、老年人(诸如，约65岁以上的个体)或免疫受损的个体。

在本申请的一个方面，提供了上述免疫原性组合物中的任一种或上述疫苗中的任一种在制备用于治疗或预防由细菌引起的疾病的药物方面的用途，其中多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。

在本申请的一个方面，还提供了一种制备上述多糖-蛋白质缀合物中任一种的方法，所述方法包括将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，所述方法还包括在将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白之前制备多糖抗原。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的嵌合载体蛋白。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:38中任一者的核酸序列。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:50中任一者的核酸序列。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:63中任一者的核酸序列。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)或酵母。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，所述方法还包括在将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白之前制备嵌合载体蛋白。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，多糖抗原通过还原胺化、氰基化缀合或碳二亚胺反应缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通过1-氰-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖抗原。在一些实施例中，多糖抗原通过己二酸二酰肼(ADH)接头缀合到嵌合载体蛋白。

在根据上述制备方法中任一种的一些实施例中，所述方法还包括分离缀合后的嵌合载体蛋白和多糖抗原，以获得多糖-蛋白质缀合物。

还提供了上述多糖-蛋白质缀合物中任一种或上述免疫原性组合物中任一种或上述疫苗中任一种的药物组合物、试剂盒和制品。

根据随后的具体实施方式和所附权利要求书，本发明的这些方面和其他方面以及优点将变得显而易见。应当理解，本文所述的各个实施例的一种、一些或所有特性可组合，以形成本发明的其他实施例。

除非另有定义，否则本文所用的术语按照本领域的常用方法使用。

应当理解，本文所述的本发明的方面和实施例包括“由…组成”和/或“基本由…组成”方面和实施例。

本文提及“约”的值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，关于“约X”的描述包括对“X”的描述。

如本文所使用，提及“非”某个值或参数通常表示并描述“除该值或参数之外”的值或参数。例如，该方法不用于治疗X类型的癌症，意指该方法用于治疗除X类型之外的类型的癌症。

本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。

如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。

具体实施方式

本发明提供了嵌合载体蛋白以及包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物。所述嵌合载体蛋白包含免疫原性载体蛋白和通用表位。还提供了包含多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物和疫苗以及制备所述多糖-蛋白质缀合物的方法。与相同的多糖抗原与不具有通用表位的载体蛋白的相应缀合物相比，本文所述的多糖-蛋白质缀合物的免疫原性增加了至少约3至5倍。所述多糖-蛋白质缀合物可用作向个体(尤其是幼儿、老年人和其他免疫系统功能低下的个体)提供针对细菌感染的保护的疫苗。

因此，在一个方面，提供了包含载体蛋白和通用表位的嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。

在另一方面，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原共价缀合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。

多糖-蛋白质缀合物

本发明在一个方面提供了具有增强的免疫原性的多糖-蛋白质缀合物，所述多糖-蛋白质缀合物包含嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含一个或多个通用表位。

因此，本发明的一个方面提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原缀合(例如，共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，并且其中所述多糖抗原缀合(例如，共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，其中所述载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D，并且其中所述多糖抗原缀合(例如，共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，其中所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的任一者，并且其中所述多糖抗原缀合(例如，共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44以及SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56的氨基酸序列中的任一者，并且其中所述多糖抗原缀合(例如，共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

本文所述的多糖-蛋白质缀合物包含多糖抗原。术语“多糖”是指由大量(如约9个以上)单糖(如重复)单元组成的聚合碳水化合物分子，所述单糖单元通过糖苷键共价连接在一起。通过化学反应或生物化学(如酶消化)反应水解多糖中的糖苷键可产生组分单糖或低聚糖。单糖是简单的糖分子，包括化学式为C_x(H₂O)_y的分子(其中x和y是通常为至少约3且不大于约10的整数)及其经修饰的分子(诸如氨基糖，如半乳糖胺、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺)。低聚糖是含有少量(如约3至约9个)单糖的聚合物。如本文所用，“多糖”、“PS”可指天然存在的全长多糖分子、全长多糖分子的水解产物(包括单糖、低聚糖和多糖物质)的任何组合的混合物、全长多糖分子的任何经化学修饰的或官能化的衍生物或其水解产物，或者以上物质的任何组合。多糖可以是直链或支链的、单一化学物质或相关化学物质(诸如，基本单糖单元相同但重复数不同的分子)的混合物。

术语“多糖抗原”或“PS抗原”是指可触发免疫应答(诸如，PS特异性抗体产生)的多糖(包括来自相同多糖分子的相关多糖物质的混合物)。在一些实施例中，单独的多糖抗原可触发T细胞非依赖性免疫应答或无免疫记忆的免疫应答。在一些实施例中，单独的多糖抗原不会在用PS抗原免疫过的个体(诸如，免疫受损的个体、幼儿或老年人)中触发较强(抗PS抗体滴度较高和/或对PS抗原的抗体亲和力较高)或长效的免疫应答。“较强”、“较高”和“长效”是指足以在个体中提供一定程度的保护作用的水平或量，以预防、改善、减缓或延缓感染和/或一种或多种与由携带PS抗原的介质(诸如细菌)引起的感染相关的症状。在一些实施例中，多糖抗原的平均分子量至少约为10kDa、50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa或更高分子量中的任一者。在一些实施例中，多糖抗原的平均分子量约为10kDa至50kDa、50kDa至100kDa、100kDa至150kDa、150kDa至200kDa、200kDa至250kDa、250kDa至300kDa、300kDa至400kDa、400kDa至500kDa、500kDa至600kDa、600kDa至700kDa、700kDa至800kDa、800kDa至900kDa、900kDa至1000kDa、10kDa至100kDa、10kDa至250kDa、10kDa至500kDa、100kDa至250kDa、100kDa至500kDa、10kDa至750kDa、500kDa至750kDa、500kDa至1000kDa、250kDa至750kDa或者10kDa至1000kDa中的任一者。在一些实施例中，多糖抗原的平均分子量介于约10kDa至约10000kDa之间(诸如，约10kDa至100kDa、100kDa至500kDa或者500kDa至1000kDa中的任一者)。

在一些实施例中，多糖抗原是荚膜多糖。本文所用的“荚膜多糖”或“CP”是指由细菌菌种或另一种微生物(诸如，真菌或藻类)产生的包裹细菌或微生物表面的多糖分子。每种细菌或微生物物种可包括亚种，每种亚种可产生具有独特化学结构和/或组成(诸如，单糖和/或单糖之间的键合)且可触发特异性免疫应答的CP。在本公开中，“多糖”或“PS”可用来指“荚膜多糖”或“CP”，但本文所述的多糖或多糖衍生物(诸如，多糖-蛋白质缀合物)不限于荚膜多糖或其CP衍生物。在一些实施例中，多糖抗原包含来源于荚膜多糖的重复单糖单元或低聚糖单元。在一些实施例中，多糖抗原包含经化学修饰的CP或其片段(诸如，重复单糖单元或低聚糖单元)。

在一些实施例中，多糖抗原是来源于病原菌的荚膜多糖。本发明设想的病原菌包括但不限于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)和脑膜炎奈瑟氏菌(Men)，包括所有亚种、血清型、类、组、菌株以及它们的变种。例如，已经鉴定了90种以上的血清型的肺炎链球菌和至少12种血清型的脑膜炎奈瑟氏菌，每种血清型与独特的荚膜多糖相关。在一些实施例中，多糖抗原是来源于选自以下血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，多糖抗原是来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)的荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原是来源于选自以下血清型的脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖：A、C、Y和W-135。在一些实施例中，多糖-蛋白质缀合物包含一种以上(诸如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种中的至少任一者)的不同多糖抗原，诸如相同细菌菌种的不同血清型的多糖抗原。

多糖抗原可共价缀合或连接到嵌合载体蛋白的任何氨基酸残基。在一些实施例中，多糖抗原共价连接到氨基(诸如，赖氨酸的侧链)或巯基(诸如，半胱氨酸残基的侧链)。在一些实施例中，将柔性有机接头设置在多糖抗原和嵌合载体蛋白之间。在一些实施例中，嵌合载体蛋白的一个或多个残基(诸如，1、2、3、4、5个或更多个中的任一者)共价连接到多糖抗原分子。多糖抗原(即总多糖抗原分子)与嵌合载体蛋白的相对比(重量之比)对于实现所需免疫原性功效可能是重要的。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比约为0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.2、1.4、1.5、1.75、2或更大中的任一者。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比约为0.2至0.5、0.5至0.8、0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1、1.1至1.2、0.6至1.0、1.0至1.2、1.2至1.5、1.5至2、1.0至1.4、0.8至1.2、0.6至1.5、0.2至1.0或1.0至2.0中的任一者。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至1.0。在一些实施例中，多糖-蛋白质缀合物中多糖抗原的重量百分比约为10％、20％、30％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、70％、80％或更多中的任一者。在一些实施例中，多糖-蛋白质缀合物中多糖抗原的重量百分比约为10％至30％、30％至40％、40％至44％、44％至46％、46％至48％、48％至50％、50％至52％、52％至54％、54％至60％、60％至80％、44％至49％、49％至54％或44％至54％中的任一者。在一些实施例中，多糖-蛋白质缀合物中嵌合载体蛋白的重量百分比约为10％、20％、30％、40％、42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、70％、80％或更多中的任一者。在一些实施例中，多糖-蛋白质缀合物中嵌合载体蛋白的重量百分比约为10％至30％、30％至40％、40％至46％、46％至48％、48％至50％、50％至52％、52％至54％、54％至56％、56％至60％、60％至80％、46％至51％、51％至56％或46％至56％中的任一者。

本文所述的多糖-蛋白质缀合物可包括单一种类的多糖-蛋白质缀合物分子或相关多糖-蛋白质缀合物分子物质的混合物，其中所述相关PS-蛋白缀合物物质包含相同的嵌合载体蛋白和来源于相同来源(诸如，相同的细菌菌种、相同的荚膜多糖等)的PS抗原，但是在不同的多糖-蛋白质缀合物分子之间，所述PS抗原的确切化学结构(包括每个PS抗原分子中的长度、重复单元的化学性质、重复单元的数目等)、嵌合载体蛋白中的键合位置和/或嵌合载体蛋白上PS抗原分子的数目可不同。因此，上述多糖-蛋白质缀合物的性质可指PS-蛋白缀合物分子的平均值。

嵌合载体蛋白

本文所述的多糖-蛋白质缀合物包含嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位。

本申请还提供了嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白可缀合到抗原(诸如多糖抗原)以形成具有增强的免疫原性的抗原-蛋白缀合物。

在一个方面，提供了用于增强多糖抗原的免疫应答的嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位与载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。

在一些实施例中，提供了用于增强多糖抗原的免疫应答的嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位与载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。

在一些实施例中，提供了用于增强多糖抗原的免疫应答的嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，并且其中所述载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位与载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。

在一些实施例中，提供了用于增强多糖抗原的免疫应答的嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，其中所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。在一些实施例中，通用表位与载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。

如本文所用，嵌合载体蛋白包含融合分子，即通过融合至少两种并非天然来源于相同多肽分子或蛋白质的组分多肽分子或氨基酸序列而制得的氨基酸聚合物。本文设想的嵌合载体蛋白可具有单条氨基酸长链(例如，长度为至少30个氨基酸)，或可具有多条氨基酸长链，所述多条氨基酸长链可具有相同序列或不同序列。嵌合载体蛋白的一条或多条链可能能够折叠成单个结构实体。嵌合载体蛋白中一条或多条链中的至少一者包含融合分子，其中至少两个组分多肽分子可通过肽键、涉及侧链基团的键合(诸如二硫键)和/或由有机接头(诸如没有显著空间位阻的接头)介导的键合来彼此共价连接。在一些实施例中，接头可设置在嵌合蛋白内的两个相邻组分多肽分子或氨基酸序列之间，从而连接所述相邻组分多肽分子或氨基酸序列。本文所用的“接头”可指通过肽键接合或连接嵌合蛋白内的两个组分氨基酸序列或多肽分子的短肽(诸如，包含1至30个氨基酸)。在一些实施例中，接头不影响或不显著影响组分多肽分子的折叠、构象和/或生物活性。嵌合蛋白可通过重组DNA技术产生、通过化学合成产生或通过共价接合(诸如经由化学反应)至少两个多肽分子产生，所述至少两个多肽分子可来源于天然来源或通过重组DNA技术或化学合成制备。本文提及的嵌合蛋白还可包括已经天然修饰或通过干预修饰(诸如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰)的一种或多种氨基酸聚合物。这一术语还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。术语“嵌合载体蛋白”和“嵌合蛋白”在本文中可互换使用。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位。如本文所用，“载体蛋白”是指可提供抗原表位以供T细胞(诸如辅助T细胞)识别并且可缀合到无关抗原(诸如多糖抗原)以增强该无关抗原的免疫原性的天然存在的蛋白质或其衍生物(诸如突变蛋白质、经化学修饰或天然修饰的蛋白质等)。许多载体蛋白是本领域已知的，包括但不限于白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)、白喉类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D以及它们的片段、突变体和其他变种。例如，交叉反应物质(CRM，诸如CRM197)是从白喉棒杆菌(Cornebacterium diphtheria)C7(β197)培养物中分离出的白喉毒素的变体，其具有低细胞毒性或无细胞毒性，但保留白喉毒素的免疫原性质。CRM或其经基因修饰版本(诸如CRM197)中的任一者可以是本发明的嵌合蛋白中合适的载体蛋白。之前就已将CRM197的A链用作多糖-蛋白质缀合物疫苗中的载体蛋白(参见中国专利申请公开No.CN103495161A，其以引用方式并入本文)。CRM197的A链及其衍生物(诸如片段、突变体或经修饰的变体，包括具有SEQ ID NO:4的CRM197A)中的任一者可用作本申请的嵌合载体蛋白中的载体蛋白。氨基酸残基21处的组氨酸被甘氨酸置换的白喉毒素的无毒突变体及其衍生物(诸如片段、突变体或经修饰的变体，包括具有SEQ ID NO:6的CRM197A)中的任一者也可用于本发明的嵌合载体蛋白中。另外，可触发T细胞应答而不诱导细胞毒性的细菌或病毒蛋白(包括表面蛋白、衣壳蛋白等)及其衍生物(诸如片段、突变体或经修饰的变体)可用作本发明中的载体蛋白。例如，轮状病毒衣壳蛋白VP8或其衍生物(诸如片段、突变体或经修饰的变体，包括具有SEQ ID NO:5的片段CoreVP8)中的任一者可用作本发明的嵌合载体蛋白中的载体蛋白。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，载体蛋白来源于白喉毒素的CRM197的A链。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，载体蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中，载体蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，载体蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

如本文所用，“通用表位”是指长度不超过约30个氨基酸的氨基酸聚合物，其包含可被MHC I类分子和/或MHC II类分子结合和递呈并且被T细胞受体识别的表位。当本文所述的通用表位被并入为嵌合蛋白的一部分时，该通用表位可具有以下性质：(1)当暴露于抗原递呈细胞(APC)并被其摄入时，通用表位的至少表位部分的完整性被保留，即APC不裂解或降解嵌合蛋白内通用表位的表位部分；以及(2)与不具有通用表位的嵌合蛋白的载体蛋白部分相比，所述表位可增强针对嵌合蛋白中载体蛋白的免疫应答。本领域已知的多种技术可用于测量免疫应答，包括但不限于测定抗体滴度的ELISA测测法。通用表位可在多种嵌合蛋白构建体中(诸如当融合到不同蛋白序列时)、在一种或多种APC细胞类型中和/或在来自不同个体(包括具有MHC分子的不同多态性等位基因的个体)的APC中表现出上述性质。通用表位的氨基酸序列可来源于天然存在的蛋白质或多肽、可以是人工设计的或可以是通过对随机肽文库进行筛选而鉴定的。通用表位可来源于天然来源、可通过重组DNA技术产生或可通过化学合成产生。本文设想的通用表位可包括直链或支链肽、具有经修饰的氨基酸的肽和/或夹杂有非氨基酸的肽。例如，通用表位可涵盖已经天然修饰或通过干预修饰(诸如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰)的氨基酸聚合物。这一术语还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2、3、4、5个或更多个通用表位中的至少任一者。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含单一类型的具有相同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2、3、4、5个或更多个拷贝中任一者的通用表位。在一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2或3种类型的通用表位中的至少任一者，其中每种类型的通用表位均具有独特的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2、3、4或5个拷贝中任一者的相同通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的每种类型的通用表位。在一些实施例中，通用表位包含约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸中的任一者。在一些实施例中，通用表位的长度为约8至约20个氨基酸(诸如，约为8至10、10至12、12至14、14至16、16至18、18至20、8至12、12至15、10至15或15至20个氨基酸中的任一者)。在一些实施例中，通用表位来源于破伤风类毒素、卵清蛋白或其他天然存在的免疫原性蛋白质(例如，参见Panina-Bordignono P et al.(1989)“Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells.”Eur.J.Immunol.19:2237-2242(Panina-Bordignono P等人，1989年，“通用免疫原性T细胞表位与人MHC II类模糊结合并且被T细胞模糊识别”，《欧洲免疫学杂志》，第19卷，第2237-2242页)，该文献以引用方式并入本文)。在一些实施例中，通用表位结合到由不同多态性等位基因编码的多种(诸如，2、3、4、5、10、20、30、40、50种或更多种中的至少任一者)MHC II类分子。在一些实施例中，通用表位选自P2(SEQ ID NO:1)、P30(SEQ ID NO:2)和OVAp(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

通用表位可融合到载体蛋白中不影响或不显著影响载体蛋白的折叠、构象和/或免疫原性的任何位置。在一些实施例中，通用表位共价融合到载体蛋白的N端或C端。在一些实施例中，第一通用表位共价融合到载体蛋白的N端，第二通用表位共价融合到载体蛋白的C端，其中第一通用表位和第二通用表位可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。在一些实施例中，通用表位插在载体蛋白的内部位置内，诸如载体蛋白的柔性环区内。在一些实施例中，第一通用表位融合到第二通用表位以提供融合通用表位，并且所述融合通用表位共价融合到载体蛋白的N端、C端或内部位置，其中第一通用表位和第二通用表位可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，并且第一通用表位或第二通用表位可以是至少两个通用表位序列以它们之间的接头或不以它们之间的接头彼此融合的融合通用表位。

例如，在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2或3个拷贝中任一者的融合到载体蛋白的N端的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1、2或3个拷贝中任一者的融合到载体蛋白的C端的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的C端。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的通用表位，所述通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的C端。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的第一通用表位，其中载体蛋白的C端融合到第二通用表位，并且其中第一通用表位和第二通用表位具有相同的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:1的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:2的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:3的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:1的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:2的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:3的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:1的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:2的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端的包含SEQ ID NO:3的通用表位，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的所述通用表位。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的第一通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到第二通用表位，并且其中第一通用表位和第二通用表位具有不同的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:4的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:5的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:1并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、1或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:1的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:2并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、3或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:3的第二通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的第一通用表位，所述第一通用表位包含SEQ ID NO:3并融合到包含SEQ ID NO:6的载体蛋白的N端，其中所述载体蛋白的C端还融合到至少1个拷贝(诸如，1、2或3个拷贝中任一者)的包含SEQ ID NO:2的第二通用表位。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含共价融合到一个或两个拷贝的第二通用表位的一个或两个拷贝的第一通用表位，其中第一通用表位和第二通用表位具有不同的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含共价融合到一个或两个拷贝的第二通用表位的一个或两个拷贝的第一通用表位，其中第一通用表位和第二通用表位具有不同的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到嵌合载体蛋白的C端的融合通用表位，其中所述融合通用表位包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，并且其中所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的C端的第一通用表位，其中所述载体蛋白的N端融合到融合通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的第一通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到融合通用表位。所述融合通用表包含至少两个具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列的通用表位。例如，融合通用表可包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。

在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:4，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:5，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:3。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合到载体蛋白的N端的融合通用表位，其中所述载体蛋白的C端融合到通用表位，其中所述融合通用表包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述载体蛋白包含SEQ ID NO:6，并且所述通用表位包含SEQ ID NO:1。

上述嵌合载体蛋白中的任一者可包含或可不包含相邻通用表位之间和/或每个通用表位与载体蛋白之间的附加序列。在一些实施例中，通用表位(包括融合通用表位)与第二通用表位(包括融合通用表位)或载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。在一些实施例中，通用表位直接融合到载体蛋白，而不具有设置在其间的肽接头。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含融合通用表位，所述融合通用表位包含以设置在其间的肽接头连接的第一通用表位和第二通用表位，其中第一通用表位和第二通用表位可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。可容易地选择合适的接头，其可为任何合适的长度，诸如约1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸中的任一者，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或者7个氨基酸至8个氨基酸，并且可为约1、2、3、4、5、6或7个氨基酸中的任一者。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGSG)n(SEQ ID NO:7)、(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸聚合物和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对未结构化的，因此可能能够充当组分之间的中性系链。示例性柔性接头包括但不限于GGSG、GSGSG(SEQ ID NO:7)、GGGGSGGGGSGGGGS、GGGGSG、GGSGG、GSGGG、GGGSG、GSSSG等等。在一些实施例中，肽接头的长度介于约1至20个氨基酸残基之间。在一些实施例中，肽接头包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

上述载体蛋白中的任一者可与上述一个或多个拷贝(诸如，1、2、3或更多个拷贝)的通用表位中的任一者或任何组合进行组合，并且任选与上述接头中的任一者进行组合以提供本申请的嵌合载体蛋白。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含载体蛋白和一个或多个选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的通用表位。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含载体蛋白，所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的任一者。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含载体蛋白以及一个或多个通用表位，所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的任一者，所述一个或多个通用表位选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56中任一者的氨基酸序列。

在先前部分中描述的多糖-蛋白质缀合物可包含上文在该部分中描述的嵌合载体蛋白中的任一者，以及与之组合的在先前部分中描述的多糖抗原中的任一者。多糖抗原中的任一者和嵌合载体蛋白中的任一者还可用于以下部分中描述的制备方法中。

制备方法

本发明还提供了用于制备本文所述的嵌合载体蛋白和多糖-蛋白质缀合物中任一者的方法。

在本发明的一个方面，提供了一种制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，所述方法还包括在将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白之前制备多糖抗原。在一些实施例中，所述方法还包括在将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白之前制备嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。在一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。

在一些实施例中，提供了一种制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括制备多糖抗原并将所述多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。在一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。

在一些实施例中，提供了一种制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括制备嵌合载体蛋白并将多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。在一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。

在一些实施例中，提供了一种制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括制备多糖抗原、制备嵌合载体蛋白并将所述多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。在一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。

在一些实施例中，提供了一种制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括：

i)培养包含多糖抗原的细菌；

ii)从培养物中回收多糖抗原；

iii)在允许表达嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞；

iv)从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白；以及

v)将所述多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白。

在本申请的一个方面，提供了一种制备嵌合载体蛋白的方法，所述方法包括：在允许表达嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:38中任一者的核酸序列。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:50中任一者的核酸序列。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:63中任一者的核酸序列。

本发明设想使用本领域已知的众多方法中的任一种来将多糖缀合或共价连接到蛋白质，例如参见Hermanson,Greg T.“Bioconjugate techniques.”Academic press,2013(Hermanson、Greg T.，《生物偶联技术》，学术出版社，2013年)，该文献以引用方式并入本文。例如，通常采用三种方法来将多糖缀合到蛋白质，包括：1)还原胺化，其中反应组分之一上的醛基或酮基与另一组分上的氨基或酰肼基反应，然后利用还原剂将所形成的C═N双键还原成C—N单键；2)氰基化缀合，其中利用溴化氰(CNBr)或利用1-氰-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖以向羟基中引入氰酸酯基，所述氰酸酯基在添加蛋白质组分后与氨基或酰肼基形成共价键；以及3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺(诸如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或EDC)活化缀合反应组分之一上的羧基，被活化的羧基与另一组分上的氨基或酰肼基反应。这些反应还常常用于在缀合反应之前活化缀合物的组分。在一些实施例中，多糖抗原通过还原胺化、氰基化缀合或碳二亚胺反应缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通过1-氰-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖抗原。在一些实施例中，多糖抗原通过己二酸二酰肼(ADH)接头缀合到嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通过本领域已知的方法(诸如色谱、电泳、超滤、渗析等)中的任一种进一步纯化合成的多糖-蛋白质缀合物。可使用本领域已知的方法(诸如色谱、质谱等)表征和定量分析所述多糖-蛋白质缀合物。在一些实施例中，所述多糖-蛋白质缀合物的纯度约为大于70％、80％、90％、95％、99％或更高中的任一者。

多糖抗原可通过本领域已知的任何方法制备，包括但不限于化学合成以及从天然来源分离，诸如从细菌培养物中分离。在一些实施例中，多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含多糖抗原的细菌，并从培养物回收多糖抗原。在一些实施例中，从细菌培养物中裂解细菌的可溶性级分中提取多糖抗原。在一些实施例中，进一步纯化所提取的多糖抗原，例如通过分别去除核酸和蛋白质。在一些实施例中，进一步处理(诸如以生物化学或化学方式水解、裂解或消化)所提取的且任选经纯化的多糖抗原，以获得具有适当分子量范围和/或中值分子量的多糖抗原。可采用另外的纯化步骤(诸如色谱、渗析、超滤、电泳、示差沉淀等)来制备多糖抗原。所制备的多糖抗原可使用本领域已知的各种方法(诸如质谱、FTIR、比色测定法、电泳等)来表征，以便定量分析和/或确认多糖抗原的化学、物理和/或结构性质。在一些实施例中，进一步活化和/或氧化多糖抗原，以获得可容易地缀合到嵌合载体蛋白的多糖抗原衍生物。在一些实施例中，多糖抗原衍生物具有醛基，所述醛基可诸如经由有机接头共价连接到嵌合载体蛋白中的氨基酸残基。

嵌合载体蛋白可通过本领域已知的任何方法制备，包括但不限于化学合成、重组DNA技术和蛋白质表达，以及通过本领域已知的化学或生物化学方法将通用表位缀合到载体蛋白，其中通用表位和/或载体蛋白可通过化学合成或重组DNA技术以及蛋白质表达来制备。常用的重组DNA技术、细胞转化、蛋白质表达和纯化技术以及与蛋白质的制备或表征相关的其他技术在例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(Sambrook等人，《分子克隆实验指南(第3版)》，2001年，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港)中有所描述，该文献以引用方式并入本文。在一些实施例中，嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。适于表达嵌合载体蛋白的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞。在一些实施例中，宿主细胞是大肠杆菌或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，宿主细胞经基因工程改造的，以增强蛋白质表达。本领域的技术人员可基于蛋白质表达体系的性质(包括嵌合载体蛋白的宿主细胞、大小、收率、溶解性和其他物理性质等)来选择和优化蛋白质表达的适当参数，诸如温度、培养基、温育时间、诱导时间等。在一些实施例中，宿主细胞不具有蛋白糖基化途径。在一些实施例中，载体为质粒。在一些实施例中，载体包含编码嵌合载体蛋白的经优化的核酸序列(例如，基于宿主细胞的天然密码子频率和/或利用添加的调控序列)，其中经优化的核酸序列可高效转录和/或翻译。在一些实施例中，载体包含选自SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:38中任一者的核酸序列。在一些实施方案中，载体包含选自SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:50中任一者的核酸序列。在一些实施方案中，载体包含选自SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:63中任一者的核酸序列。在一些实施例中，从培养物的可溶性级分中分离所表达的嵌合载体蛋白。在一些实施例中，从细菌培养物的包涵体中分离所表达的嵌合载体蛋白。在一些实施例中，使所表达的嵌合蛋白重新折叠。在一些实施例中，使用本领域已知的任何方法(诸如色谱和渗析)进一步纯化所表达的嵌合蛋白。在一些实施例中，嵌合载体蛋白的纯度约为大于70％、80％、90％、95％、99％或更高中的任一者。

本文所述的用于制备嵌合载体蛋白、用于制备多糖抗原以及用于将多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白的任何步骤和参数旨在可以彼此组合，以用于制备多糖-蛋白质缀合物，就如同单独描述每个组合那样。本文还提供了通过本文所述的制备方法中的任一种所制备的嵌合载体蛋白和多糖-蛋白质缀合物。

免疫原性组合物

本发明的一个方面提供了包含上述多糖-蛋白质缀合物的任一者或任何组合的组合物(包括免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)。

因此，在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一者包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原共价缀合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2。

在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一者包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列，并且其中所述多糖抗原共价缀合到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2。

在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一者包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原缀合(例如共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一者包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，其中所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的任一者，并且其中所述多糖抗原缀合(例如共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一者包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，其中所述嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44以及SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56的氨基酸序列中的任一者(包括基本由所述序列组成或由所述序列组成)，并且其中所述多糖抗原缀合(例如共价缀合)到所述嵌合载体蛋白。在一些实施例中，多糖抗原来源于荚膜多糖。在一些实施例中，多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，多糖抗原与嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2(诸如，约0.8至0.9、0.9至1.0、1.0至1.1或者1.1至1.2中的任一者)。

在一些实施例中，免疫原性组合物由一种多糖-蛋白质缀合物组成。在一些实施例中，免疫原性组合物包含多种(诸如，约为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24种或更多种中的任一者)多糖-蛋白质缀合物。所述多种多糖-蛋白质缀合物包括不同类型的多糖-蛋白质缀合物，诸如具有不同嵌合载体蛋白的PS-蛋白缀合物、具有来源于不同血清型的相同细菌菌种的PS-蛋白缀合物、具有来源于不同细菌菌种的PS的PS-蛋白缀合物、具有不同的PS与嵌合载体蛋白之比的PS-蛋白缀合物，或者它们的任何组合。在一些实施例中，不同多糖-蛋白质缀合物之间没有可实质上削减每种多糖-蛋白质缀合物的期望功效的相互作用。在一些实施例中，免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物中的至少两种是不同的。例如，多糖-蛋白质缀合物中的至少两种可在以下方面不同：嵌合载体蛋白、嵌合载体蛋白中通用表位的类型或类型组合、嵌合载体蛋白中通用表位的拷贝、嵌合载体蛋白中的接头、嵌合载体蛋白内通用表位的位置(即N端、C端或这两者)或它们的任何组合。在一些实施例中，免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，所述多糖-蛋白质缀合物包含来源于至少两种不同细菌菌种(包括不同血清型)的多糖抗原。在一些实施例中，所述至少两种不同细菌菌种选自b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于相同物种的不同血清型的细菌的多糖抗原。在一些实施例中，免疫原性组合物包含一种或多种(诸如，约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24种中的任一者)多糖-蛋白质缀合物，其中多糖抗原(诸如荚膜多糖抗原)来源于选自以下血清型的肺炎链球菌：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含一种或多种(诸如，约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种中的任一者)多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含约24种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含约13种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一些实施例中，免疫原性组合物包含一种或多种(诸如，约为1、2、3或4种中的任一者)多糖-蛋白质缀合物，其中多糖抗原(诸如荚膜多糖抗原)来源于选自以下血清型的脑膜炎奈瑟氏菌：A、C、Y和W-135。在一些实施例中，免疫原性组合物包含约4种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖：A、C、Y和W-135。

包含多种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物中不同多糖-蛋白质缀合物之间的相对比(诸如重量之比或摩尔之比)可取决于影响每种多糖-蛋白质缀合物的免疫原性以及影响针对包含在所述免疫原性组合物中的每种多糖抗原的所需免疫原性功效在内的多种因素。例如，多糖抗原与嵌合载体蛋白的相对比率、嵌合载体蛋白的性质(诸如通用表位的类型和数量)、PS抗原的性质(诸如分子量、长度、重复单元的数目、重复单元的化学性质、细菌来源等)以及/或者用于产生PS抗原、嵌合载体蛋白和/或将PS抗原缀合到嵌合载体蛋白的方法可能都会影响免疫原性组合物中每种PS-蛋白缀合物的免疫原性功效，免疫原性功效可因制备PS-蛋白缀合物的批次而异，因此可能必须先对每批次PS-蛋白缀合物进行实验测定，然后再混合这些PS-蛋白缀合物来获得免疫原性组合物。针对每种多糖抗原的所需免疫原性功效取决于免疫原性组合物的实际应用，例如，待免疫个体群体中每种细菌血清型的频率、每种细菌血清型的严重度、待免疫的个体(诸如，个体对PS抗原具有正常免疫应答还是较弱免疫应答、个体早期暴露还是同时暴露于类似的PS-蛋白缀合物等)以及实现针对细菌血清型的期望保护所需的有效PS特异性抗体滴度。本领域已知的测定免疫原性的任何方法(诸如，用于定量分析经免疫原性组合物免疫的动物中PS特异性抗体滴度的ELISA测定法)可用于测定免疫原性组合物中不同多糖-蛋白质缀合物之间的相对比率。另外，分析方法诸如色谱、质谱等可用于测定免疫原性组合物中每种多糖-蛋白质缀合物的化学性质和结构性质。在一些实施例中，免疫原性组合物包含约等摩尔比的多种多糖-蛋白质缀合物。

在一些实施例中，免疫原性组合物还包含一种或多种佐剂。如本文所用，佐剂是可改变其他试剂在免疫原性组合物或疫苗中的效用的试剂，诸如增强免疫原性组合物的免疫原性。可提供佐剂以增强免疫应答，诸如产生更高滴度的抗体、提供更长效的保护和/或减少注射的次数和剂量。佐剂是本领域熟知的。在一些实施例中，佐剂可使免疫原性组合物的制剂稳定。用于增强免疫原性组合物的有效性的合适佐剂包括但不限于：铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；矿物油，诸如石蜡油；细菌产物，诸如细菌细胞壁组分、灭活细菌、细菌类毒素的脱毒突变体等；非细菌有机物，诸如鲨烯、硫柳汞等；递送体系，诸如皂苷佐剂体系(例如)、Ribi^TM佐剂体系(RAS)等；细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-12等)、干扰素(例如γ干扰素)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、辅刺激分子B7-1和B7-2等；组合物，诸如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂；充当免疫刺激剂以增强免疫原性组合物的有效性的其他物质；以及它们的任何组合。在一些实施例中，免疫原性组合物还包含磷酸铝或氢氧化铝。

本发明还提供了包含上述免疫原性组合物中的任一种和药学上可接受的载体的疫苗。本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指适于施用到受试者的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。“药学上可接受的”用于指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的无毒材料。术语“载体”是指天然或合成的有机或无机成分，活性成分与这些成分组合有利于其应用。载体的特征取决于施用途径。生理上和药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及本领域熟知的其他材料。

本文所述的免疫原性组合物中的任一种或任何组合可通过将一种或多种所述免疫原性组合物与药学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂和/或本领域已知的其他试剂组合来用于疫苗或其他药物组合物或制剂中，从而用于本文所述的治疗方法、施用方法和剂量方案中。

合适的药物载体包括：无菌水；盐水、葡萄糖；葡萄糖水溶液或葡萄糖盐水；蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物，其中每摩尔蓖麻油化合约30摩尔至约35摩尔环氧乙烷；液体酸；低级烷醇；油，诸如玉米油、花生油、芝麻油等，含有乳化剂，诸如脂肪酸的单甘油酯或二甘油酯或者磷脂，如卵磷脂等；乙二醇；聚亚烷基二醇；在悬浮剂如羧甲基纤维素钠存在下的水性介质；藻酸钠；聚(乙烯吡咯烷酮)；等等。上述药物载体为单独的或与合适的分散剂如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯等组合。载体还可含有辅助剂，诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂等，以及促渗剂。最终形式可为无菌的，并且还能够轻松地穿过注射装置，诸如中空针。可通过适当选择溶剂或赋形剂来实现和维持适当的粘度。此外，可利用分子包衣或颗粒包衣(诸如卵磷脂)的使用、分散体的粒度的适当选择或者具有表面活性剂性质的材料的使用。

本文所述的药物组合物(包括疫苗)可包含其他试剂、赋形剂或稳定剂，用于改善免疫原性组合物的性质。合适的赋形剂和稀释剂的例子包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。所述制剂可另外包括润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。乳化剂的例子包括生育酚酯诸如生育酚聚乙二醇琥珀酸酯等、基于聚氧乙烯化合物的乳化剂、Span 80及相关化合物，以及本领域已知并被批准用于动物或人剂型的其他乳化剂。可对药物组合物(包括疫苗)进行配制以在通过使用本领域熟知的方法施用到患者之后提供活性成分的速释、缓释或迟释。

在一些实施例中，将药物组合物(包括疫苗)配制为具有约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约5.5至约6.5或者约5.6至约6.0中任一者的pH范围。在一些实施例中，将药物组合物(包括疫苗)的pH配制为不小于约5.6。还可通过添加合适的张度调节剂(诸如甘油)使药物组合物(包括疫苗)与血液等渗。

本文所用的“个体”、“受试者”或“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，药物组合物(包括疫苗)适于施用给人。在一些实施例中，药物组合物(包括疫苗)适于通过胃肠外施用方式施用给人。适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预期受者的血液相容的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如注射器和小瓶)中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临用之前加入无菌液体赋形剂(即水)便可用于本文所述的治疗方法、施用方法和剂量方案中进行注射。即用型注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒以及前述种类制备。可注射制剂是优选的。在一些实施例中，药物组合物(包括疫苗)容纳在一次性注射器(诸如一次性密封注射器)中。在一些实施例中，每个一次性注射器以适于施用到个体的重量或体积单位容纳治疗或预防有效量的一种或多种多糖缀合物。在一些实施例中，药物组合物(包括疫苗)容纳在多次性小瓶中。在一些实施例中，药物组合物(包括疫苗)散装容纳在容器中。

在一些实施例中，疫苗是单价疫苗，其中所述疫苗包含免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物包含来源于单一细菌血清型的多糖抗原。在一些实施例中，提供了包含一种或多种多糖-蛋白质缀合物的单价b型流感嗜血杆菌(Hib)疫苗，其中所述一种或多种多糖-蛋白质缀合物中的每一种包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位(诸如包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列的通用表位)，并且其中所述多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)。在一些实施例中，所述疫苗是多价疫苗，其中所述疫苗包含免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于相同物种的不同血清型的细菌的多糖抗原。在一些实施例中，提供了包含约13种多糖-蛋白质缀合物的13价肺炎链球菌疫苗，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位(诸如包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列的通用表位)，并且其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。在一些实施例中，提供了包含约24种多糖-蛋白质缀合物的24价肺炎链球菌疫苗，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位(诸如包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列的通用表位)，并且其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。在一些实施例中，提供了包含约24种多糖-蛋白质缀合物的4价脑膜炎奈瑟氏菌疫苗，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含嵌合载体蛋白和多糖抗原，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位(诸如包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列的通用表位)，并且其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖：A、C、Y和W-135。在一些实施例中，所述疫苗还包含其他抗原(与PS抗原或嵌合载体蛋白相关或无关)。在一些实施例中，所述其他抗原可与佐剂、稀释剂、赋形剂、载体和其他药学上可接受的物质一起配制。

治疗方法

本发明还提供了治疗或预防由细菌引起的疾病(诸如感染)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的组合物(包括多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)中的任一者，其中所述细菌包含多糖抗原。在一些实施例中，个体是约2岁以下的儿童、老年人或免疫受损的个体。

在一个方面，提供了一种针对由细菌引起的疾病来免疫个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本文所述的免疫原性组合物、药物组合物或疫苗中的任一者，其中所述细菌表达包含多糖抗原的多糖(诸如荚膜多糖)。在另一方面，提供了免疫原性组合物、药物组合物和疫苗中的任一者在制造用于治疗或预防由细菌引起的疾病的药物方面的用途，其中多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。在一些实施例中，细菌是b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，个体是约2岁以下的儿童、老年人或免疫受损的个体。

本文所述的治疗方法通常适用于由表达包含多糖抗原的多糖(诸如荚膜多糖)的细菌引起的任何疾病或病症，包括但不限于由b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)引起的疾病或病症。例如，在一些实施例中，疾病是肺炎、耳部感染、鼻窦感染、脑膜炎、菌血症、它们的任何组合和/或由肺炎链球菌引起的任何其他疾病或病症。在一些实施例中，疾病是脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝织炎、关节炎、耳部感染、它们的任何组合和/或由b型流感嗜血杆菌引起的任何其他疾病或病症。在一些实施例中，疾病是脑膜炎、脑膜炎球菌血症、它们的组合和/或由脑膜炎奈瑟氏菌引起的任何其他疾病或病症。

本文所用的“个体”、“受试者”或“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施例中，所述个体为人类个体。在一些实施例中，所述个体的免疫系统功能低下。在一些实施例中，与健康成人相比，所述个体对多糖抗原的免疫应答较弱(诸如，PS特异性抗体滴度低、免疫应答时间短和/或免疫记忆低)。在一些实施例中，所述个体具有有缺陷或不成熟的T细胞系统。在一些实施例中，所述个体具有有缺陷或不成熟的免疫记忆系统。在一些实施例中，所述个体为幼儿(诸如约2岁以下的儿童，如约3个月、6个月、12个月、1岁半或2岁中任一者以下的儿童)。在一些实施例中，所述个体为老年人，诸如50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更大年龄中任一者以上的个体。在一些实施例中，所述个体为免疫受损的个体。在一些实施例中，所述方法向具有不同MHC分子多态性的个体提供了广泛的免疫保护。

如本文所用，“治疗”是用于获得益处或期望结果(包括临床结果)的方法，包括治疗性治疗和预防性或防御性措施。就本发明的目的而言，有益或期望的临床结果包括但不限于以下结果中的一种或多种：减少疾病导致的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病恶化)、预防或延缓疾病传播、预防或延缓疾病发生或复发、延缓或减缓疾病进展、改善疾病状态、提供疾病缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、提高生活质量和/或延长寿命。在一些实施例中，与治疗之前同一个体中的相应症状相比，或者与未接受治疗方法或组合物的其他个体中的相应症状相比，所述组合物使与疾病相关的一种或多种症状(诸如细菌感染)的严重度降低了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一者。本发明的方法设想了治疗的任何一个或多个这些方面。

能够“延缓疾病进展”的治疗可包括推迟、阻止、减缓、延迟、稳定和/或延慢疾病的发展。这种延缓效果持续的时间可不同，具体取决于病史和/或被治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延缓实际上可涵盖预防个体(例如，具有发生疾病或病症风险的个体)发展疾病。

如本领域所理解，“有效量”是指足以产生所需的治疗结果(例如，降低疾病严重度或缩短疾病持续时间、稳定疾病严重度、消除一种或多种疾病症状或预防疾病发作)的组合物或联合疗法的量。所述量可为一种或多种剂量，即单剂量或多剂量。可使用标准方法来测量有益效果的量级，诸如体外测定法(如ELISA)、基于细胞的测定法(如调理吞噬杀菌测定法)、动物模型和/或人类测试。在一些实施例中，以可诱导免疫保护应答而不会产生显著的不利影响的量施用所述组合物(包括多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)。这种量可根据细菌菌种和细菌的血清型而不同。可通过标准研究(涉及观察受试者中的适当免疫应答)来确定具体疫苗的组分的最佳量。在初次接种疫苗后，受试者可接受充分间隔开的一次或若干次加强免疫。在一些实施例中，以一次或多次(诸如，1、2、3或更多次)剂量施用所述组合物(包括多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)。在一些实施例中，以至少2次(诸如，2、3、4或更多次)剂量施用所述组合物。在一些实施例中，与响应于初始剂量相比，个体中的多糖特异性抗体滴度响应于后续剂量会有所增加。在一些实施例中，两次相邻剂量之间的间隔约为1个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或更久中的任一者。在一些实施例中，每种剂量包含0.1μg至100μg的多糖抗原。在一些实施例中，每种剂量包含0.1μg至10μg的多糖抗原。

可通过任何合适的施用途径施用本发明的组合物(包括多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)。在一些实施例中，以胃肠外方式(诸如注射)施用所述组合物。在一些实施例中，通过全身或粘膜途径施用所述组合物。适于本发明的示例性施用途径包括但不限于经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射，或经由粘膜施用注射到口腔/消化道、呼吸道(如鼻内)或泌尿生殖道。

试剂盒和制品

本发明还提供了包含所述组合物(包括本文所述的嵌合载体蛋白、多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)中的任一者的试剂盒或制品。

在一些实施例中，提供了可用于增强多糖抗原的免疫原性的试剂盒，所述试剂盒包含嵌合载体蛋白，所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位。在一些实施例中，通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。在一些实施例中，载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44以及SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56中任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，所述试剂盒还包含多糖抗原和任选的用于将所述多糖抗原缀合到嵌合载体蛋白的试剂，用于制备可用作针对包含所述多糖抗原的细菌的疫苗的多糖-蛋白质缀合物。

在一些实施例中，提供了可用于治疗或预防由细菌引起的疾病(诸如感染)的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物(包括本文所述的多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)中的任一者，其中多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。在一些实施例中，提供了可用于针对细菌免疫个体的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物(包括本文所述的多糖-蛋白质缀合物、免疫原性组合物、药物组合物和疫苗)中的任一者，其中多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。在一些实施例中，细菌是b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。在一些实施例中，所述组合物(诸如疫苗)容纳在注射器中。

所述制品或试剂盒还可包括容器以及容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、静脉注射溶液袋等。容器可由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器可单独保存组合物，也可一起保存组合物与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且容器可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是嵌合载体蛋白或本发明的多糖-蛋白质缀合物。标签或包装说明书指出所述组合物用于治疗所选病症。本发明的本实施例中的制品还可包括指出所述组合物可用于治疗具体病症的包装说明书。作为另外一种选择或除此之外，所述制品或试剂盒还可包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述容器还可包含商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。

该说明书被认为足以使本领域中的技术人员能够实践本发明。根据先前描述，对本发明的除了本文所示出和描述的那些之外的各种修改对于本领域中的技术人员来说将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请特此全文以引用方式并入。

示例性实施例

实施例1。在一些实施例中，提供了包含嵌合载体蛋白和多糖抗原的多糖-蛋白质缀合物，其中所述嵌合载体蛋白包含载体蛋白和通用表位，并且其中所述多糖抗原共价缀合至所述嵌合载体蛋白。

实施例2。在实施例1的另一些实施例中，嵌合载体蛋白包含约1至约3个拷贝的通用表位。

实施例3。在实施例1或实施例2的另一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含至少两个具有不同氨基酸序列的通用表位。

实施例4。在根据实施例1至3中任一项的另一些实施例中，所述通用表位的长度为约8至约20个氨基酸。

实施例5。在根据实施例1至4中任一项的另一些实施例中，所述通用表位共价融合到所述载体蛋白的N端、C端，或者同时融合到N端和C端。

实施例6。在根据实施例1至5中任一项的另一些实施例中，所述通用表位包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3中任一者的氨基酸序列。

实施例7。在根据实施例1至6中任一项的另一些实施例中，所述载体蛋白来源于破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的交叉反应物质(CRM)、轮状病毒衣壳蛋白VP8、脑膜炎球菌外膜复合物或流感嗜血杆菌蛋白D。

实施例8。在实施例7的另一些实施例中，所述载体蛋白来源于白喉毒素的CRM197的A链。

实施例9。在实施例7的另一些实施例中，所述载体蛋白包含选自SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:6中任一者的氨基酸序列。

实施例10。在根据实施例1至9中任一项的另一些实施例中，所述通用表位与所述载体蛋白通过设置在其间的肽接头共价融合。

实施例11。在实施例10的另一些实施例中，所述肽接头是选自甘氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物或丙氨酸-丝氨酸聚合物的柔性接头。

实施例12。在实施例10或实施例11的另一些实施例中，所述肽接头的长度介于约1至约20个氨基酸残基之间。

实施例13。在根据实施例10至12中任一项的另一些实施例中，所述肽接头包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

实施例14。在根据实施例1至13中任一项的另一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:32中任一者的氨基酸序列。

实施例15。在根据实施例1至13中任一项的另一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:39至SEQ ID NO:44中任一者的氨基酸序列。

实施例16。在根据实施例1至13中任一项的另一些实施例中，所述嵌合载体蛋白包含选自SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:56中任一者的氨基酸序列。

实施例17。在根据实施例1至16中任一项的另一些实施例中，所述多糖抗原与所述嵌合载体蛋白的重量之比为约0.8至约1.2。

实施例18。在根据实施例1至17中任一项的另一些实施例中，所述多糖抗原的平均分子量在约10kDa至约1000kDa之间。

实施例19。在根据实施例1至18中任一项的另一些实施例中，所述多糖抗原来源于荚膜多糖。

实施例20。在根据实施例1至19中任一项的另一些实施例中，所述多糖抗原来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)。

实施例21。在实施例20的另一些实施例中，所述荚膜多糖来源于选自以下血清型的肺炎链球菌：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。

实施例22。在实施例20的另一些实施例中，所述荚膜多糖来源于b型流感嗜血杆菌(Hib)。

实施例23。在实施例20的另一些实施例中，所述荚膜多糖来源于选自以下血清型的脑膜炎奈瑟氏菌：A、C、Y和W-135。

实施例24。在一些实施例中，提供了包含根据实施例1至23的多糖-蛋白质缀合物中的任一种或任何组合的免疫原性组合物。

实施例25。在实施例24的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物中的至少两种包含彼此不同的载体蛋白。

实施例26。在实施例24或实施例25的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀合物中的至少两种包含来源于彼此不同的细菌菌种的多糖抗原。

实施例27。在实施例24或实施例25的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含多种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于相同物种的不同血清型的细菌的多糖抗原。

实施例28。在实施例27的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含约13种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。

实施例29。在实施例27的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含约24种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F。

实施例30。在实施例27的另一些实施例中，所述免疫原性组合物包含约4种多糖-蛋白质缀合物，其中每种多糖-蛋白质缀合物包含来源于选自以下不同血清型的脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖：A、C、Y和W-135。

实施例31。在根据实施例24至30中任一项的另一些实施例中，所述免疫原性组合物还包含佐剂。

实施例32。在实施例31的另一些实施例中，所述佐剂是磷酸铝或氢氧化铝。

实施例33。在一些实施例中，提供了包含根据实施例24至32的免疫原性组合物中的任一种和药学上可接受的载体的疫苗。

实施例34。在一些实施例中，提供了一种针对由细菌引起的疾病来免疫个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的根据实施例24至32的免疫原性组合物或根据权利要求33的疫苗中的任一者，其中所述多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。

实施例35。在实施例34的另一些实施例中，将所述免疫原性组合物或所述疫苗以至少两种剂量向所述个体施用。

实施例36。在实施例34或实施例35的另一些实施例中，所述疾病是由肺炎链球菌引起的肺炎、耳部感染、鼻窦感染、脑膜炎或菌血症。

实施例37。在实施例34或实施例35的另一些实施例中，所述疾病是由b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝织炎、关节炎或耳部感染。

实施例38。在实施例34或实施例35的另一些实施例中，所述疾病是由脑膜炎奈瑟氏菌引起的脑膜炎或脑膜炎球菌血症。

实施例39。在根据实施例34至38中任一项的另一些实施例中，所述个体对所述多糖抗原具有不良的免疫应答。

实施例40。在根据实施例34至39中任一项的另一些实施例中，所述个体是小于约2岁的儿童、老年人或免疫受损的个体。

实施例41。在一些实施例中，提供了根据实施例24至32的免疫原性组合物或根据实施例33的疫苗中的任一者在制造用于治疗或预防由细菌引起的疾病的药物方面的用途，其中所述多糖抗原是在所述细菌表面上表达的多糖或其衍生物。

实施例42。在一些实施例中，提供了一种制备根据实施例1至23的多糖-蛋白质缀合物中的任一种的方法，所述方法包括将所述多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白。

实施例43。在实施例42的另一些实施例中，所述多糖抗原通过以下方式来制备：培养包含所述多糖抗原的细菌，并从培养物中回收所述多糖抗原。

实施例44。在实施例42或实施例43的另一些实施例中，所述方法还包括在将所述多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白之前制备所述多糖抗原。

实施例45。在根据实施例42至44中任一项的另一些实施例中，所述嵌合载体蛋白通过以下方式来制备：在允许表达所述嵌合载体蛋白的条件下，培养用包含编码所述嵌合载体蛋白的核酸序列的载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收表达的所述嵌合载体蛋白。

实施例46。在实施例45的另一些实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌或酵母。

实施例47。在实施例45或实施例46的另一些实施例中，所述载体包含选自SEQ ID NO:34至SEQ ID NO:38中的任一者的核酸序列。

实施例48。在实施例45或实施例46的另一些实施例中，所述载体包含选自SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:50中的任一者的核酸序列。

实施例49。在实施例45或实施例46的另一些实施例中，所述载体包含选自SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:63中的任一者的核酸序列。

实施例50。在根据实施例42至49中任一项的另一些实施例中，所述方法还包括在将所述多糖抗原缀合到所述嵌合载体蛋白之前制备所述嵌合载体蛋白。

实施例51。在根据实施例42至50中任一项的另一些实施例中，所述多糖抗原通过还原胺化、氰基化缀合或碳二亚胺反应缀合到所述嵌合载体蛋白。

实施例52。在实施例51的另一些实施例中，所述多糖抗原由1-氰-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化。

实施例53。在实施例51的另一些实施例中，所述多糖抗原通过己二酸二酰肼(ADH)接头缀合到所述嵌合载体蛋白。

实施例54。在根据实施例42至53中任一项的另一些实施例中，所述方法还包括分离所述经缀合的嵌合载体蛋白和多糖抗原，以获得多糖-蛋白质缀合物。

实例

旨在仅对本发明进行举例说明并且因此不应被视为以任何方式限制本发明的实例还描述和详细说明了上文所述的本发明的各方面和各实施例。这些实例并非旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有实验。已经努力确保关于所使用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。

以下实例提供了通过向缀合物中的载体蛋白添加一个或多个通用表位来增强多糖-蛋白质缀合物的免疫原性的方法。使用经重组工程改造的细菌产生包含通用表位的嵌合载体蛋白。然后将多糖共价缀合到包含通用表位的嵌合载体蛋白。进入动物体内后，多糖-蛋白质缀合物可被抗原递呈细胞(APC)摄取并降解而产生通用表位和多糖的重复单元片段，所述通用表位和多糖的重复单元片段可被MHC II类分子结合和展示以进行有效的T细胞诱导，从而导致增强的免疫原性，以及产生增大滴度的针对细菌荚膜多糖的特异性抗体。与不具有任何通用表位的对应多糖-蛋白质缀合物相比，如本文所述的在载体蛋白中具有通用表位的示例性多糖-蛋白质缀合物具有增强约3-5倍的免疫原性。

本文所述的示例性多糖-蛋白质缀合物的技术策略如下：

a)将一个或多个通用表位引入载体蛋白以制备嵌合载体蛋白，并使用经基因重组工程改造的细菌产生嵌合载体蛋白；

b)将a)中具有通用表位的嵌合载体蛋白共价缀合到多糖以获得多糖-蛋白质缀合物。

在另一些实施例中，如这些实例中所述的嵌合载体蛋白包含X个通用表位，其中X大于或等于1。

在另一些实施例中，如这些实例中所述的嵌合载体蛋白包含连接到载体蛋白的N端、C端或同时连接到N端和C端两者的通用表位。

在另一些实施例中，如这些实例中所述的嵌合载体蛋白包含经由GSGSG氨基酸序列连接到载体蛋白的N端和/或C端的通用表位。

在另一些实施例中，如在这些实例中所述的嵌合载体蛋白包含选自QYIKANSKFIGITEL(称为P2)、FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(称为P30)、ISQAVHAAHAEINEAGR(称为OVAp)以及它们的任何组合的通用表位。

在另一些实施例中，如这些实例中所述的嵌合载体蛋白包含选自突变型白喉毒素CRM197A链(称为CRM197A)、轮状病毒表面蛋白核心VP8(称为CoreVP8)以及突变型白喉毒素H21GA链(称为H21G)的载体蛋白。

在另一些实施例中，在这些实例中描述的经基因重组工程改造的细菌是基因重组大肠杆菌。

在另一些实施例中，如这些实例中所述的多糖是通过培养b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Pn)或脑膜炎奈瑟氏菌(Men)制备的荚膜多糖。

在另一些实施例中，将多糖共价缀合到如这些实例中所述的包含通用表位的嵌合载体蛋白的方法是还原胺化、ADH方法(使用己二酸二酰肼)或CDAP方法(使用3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N、N-二甲基-丙-1-胺)。

实例1：包含具有CRM197A和通用表位的嵌合载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物的制备和免疫学评估

第1部分。嵌合载体蛋白的氨基酸序列的设计

1.CRM197免疫原性载体蛋白的序列设计

白喉毒素是由携带白喉毒素基因的β噬菌体在细菌白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)中表达的胞质多肽。该多肽具有560个氨基酸，分子量为62,000道尔顿。野生型白喉毒素的氨基酸序列如下以SEQ ID NO:64示出。

(SEQ ID NO：64)MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

在多肽分泌到细菌外部后，N端25个残基的前导序列被移除，从而得到具有535个氨基酸和58kDa分子量的分泌单链多肽，其氨基酸序列如以下SEQ ID No：65所示。

(SEQ ID NO：65)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKISLFFEIKS

分泌的白喉毒素被酶切成A链和B链，A链和B链通过二硫键连接而形成单个蛋白分子。两条多肽链中的每条均具有独特的功能。A链是白喉毒素蛋白的N端片段，具有193个氨基酸和21kDa的分子量。A链是白喉毒素毒性的罪魁祸首。在真核细胞的细胞质中，A链将NAD+的ADP-核糖部分共价转移至延长因子-2(EF-2)，从而减少宿主细胞中的蛋白质合成，这导致对细胞生长的抑制并最终导致细胞死亡。B链是白喉毒素的C端片段，具有342个氨基酸和37kDa的分子量。B链可以识别敏感细胞表面上的特异性受体，这允许将白喉毒素附着至敏感细胞并利于A链进入细胞。

白喉毒素的A链具有优异的水溶性。其氨基酸如以下SEQ ID NO：66所示。

(SEQ ID NO：66)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

研究已表明，β噬菌体中编码白喉毒素的tox基因的突变对噬菌体的复制几乎没有影响，但是大大降低或消除了表达的白喉毒素的毒性，所述突变被称为交叉反应物质(CRM)(Giannini et al.(1984)“The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtheria toxin：CRM45and CRM197.”Nucleic Acid Research 12：4063-4069(Giannini等人，1984年，“白喉毒素的两种无毒突变体：CRM45和CRM197的氨基酸序列”，《核酸研究》，第12卷，第4063-4069页))。血清中CRM的免疫原性质仍然与野生型毒素的那些免疫原性质高度相关。具体地讲，无毒性突变体CRM197具有在氨基酸52中的Gly→Glu点突变，并且其氨基酸序列如以下SEQ ID NO：4所示。

(SEQ ID NO：4)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

与市场上用于针对肺炎链球菌的疫苗的其他载体蛋白相比，CRM197A链(下文中称为CRM197A)具有以下优点。CRM197A和全长野生型白喉毒素的免疫原性质高度相关。CRM197A具有小分子量和高水溶性，因此易于生产和易于用于制备高分子量分子的化学反应中。基于白喉毒素的疫苗的长期临床应用已经证明了这种疫苗的安全性和功效。

在此，重组表达的CRM197A蛋白用作多糖-蛋白质缀合物生产中的载体蛋白。将CRM197A共价连接至肺炎链球菌(Pn)的荚膜多糖(CP)以制备Pn PS-CRM197A缀合物。将CRM197A共价连接至b型流感嗜血杆菌(Hib)的荚膜多糖(CP)以制备Hib PS-CRM197A缀合物。将CRM197A共价连接至脑膜炎奈瑟氏菌(Men)的荚膜多糖(CP)以制备Men CP-CRM197A缀合物。将缀合物的每一种进一步制备成疫苗组合物以用作对照，用于研究具有相同CP但具有含CRM197A和一个或多个通用表位的嵌合载体蛋白的对应缀合物的免疫原性。

2.嵌合载体蛋白的序列设计

将通用表位融合至CRM197A免疫原性载体蛋白，以构建可用于制备多糖-蛋白质缀合物的新嵌合载体蛋白。将通用表位P2、P30或OVAp各自单独融合至CRM197A载体蛋白的N端或C端。或者，将两种不同类型的通用表位的组合中的每一种分别融合至CRM197A载体蛋白的N端或C端。在第三种策略中，将同一通用表位的两个拷贝彼此融合，然后融合至CRM197A载体蛋白的N端或C端。第四种策略是将通用表位融合至CRM197A载体蛋白的C端或N端，并且CRM197A的剩余端连接至相同或不同类型的通用表位的两个拷贝，所述两个拷贝彼此融合。

2-1包含P2和CRM197A的嵌合载体蛋白的序列设计

2-1-1 P2-N端-CRM197A嵌合载体蛋白(P2CRM197A)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2CRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：8示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：8)QYIKANSKFIGTTELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-1-2 CRM197A-C端-P2嵌合载体蛋白(CRM197AP2)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为CRM197AP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：9示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：9)MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-1-3 P2-N端-CRM197A-C端-P2嵌合载体蛋白(P2CRM197AP2)的序列设计

分别将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端和C端各自经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2CRM197AP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：10示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：10)QYIKAMSKFIGITELGSGSGGADGVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIqKGIQKDKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-1-4 P2P2-N端-CRM197A嵌合嵌体蛋白(P2P2CRM197A)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2P2CRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：11示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：11)QVIKANSKFIGTTELGSGSGQVIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-1-5 CRM197A-C端-P2P2嵌合嵌体蛋白(CRM197AP2P2)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2P2CRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：12示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：12)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-1-6 P2P2-N端-CRM197A-C端-P2嵌合载体蛋白(P2P2CRM197AP2)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2P2CRM197AP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：13示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：13)QYIYAMSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-1-7 P2-N端-CRM197A-C端-P2P2嵌合载体蛋白(P2CRM197AP2P2)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2CRM197AP2P2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：14示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：14)QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-2包含P30和CRM197A的嵌合载体蛋白的序列设计

2-2-1 P30-N端-CRM197A嵌合载体蛋白(P30CRM197A)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30CRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：15示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：15)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-2-2 CRM197A-C端-P30嵌合载体蛋白(CRM197AP30)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为CRM197AP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：16示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：16)MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-2-3 P30-N端-CRM197A-C端-P30嵌合载体蛋白(P30CRM197AP30)的序列设计

分别将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端和C端各自经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30CRM197AP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：17示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：17)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-2-4 P30P30-N端-CRM197A嵌合载体蛋白(P30P30CRM197A)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的两个拷贝通过设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30P30CRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：18示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：18)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-2-5 CRM197A-C端-P30P30嵌合载体蛋白(CRM197A P30P30)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为CRM197AP30P30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：19示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：19)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-2-6 P30P30-N端-CRM197A-C端-P30嵌合载体蛋白(P30P30CRM197AP30)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将P30(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30P30CRM197AP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：20示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：20)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-2-7 P30-N端-CRM197A-C端-P30P30嵌合载体蛋白(P30CRM197AP30P30)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30CRM197AP30P30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：21示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：21)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-3包含OVAp和CRM197A的嵌合载体蛋白的序列设计

2-3-1 OVAp-N端-CRM197A嵌合载体蛋白(OVApCRM197A)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为OVApCRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：22示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：22)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-3-2 CRM197A-C端-OVAp嵌合载体蛋白(CRM197AOVAp)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为CRM197AOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：23示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：23)MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

2-3-3 OVAp-N端-CRM197A-C端-OVAp嵌合载体蛋白(OVApCRM197AOVAp)的序列设计

分别将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端和C端各自经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为OVApCRM197AOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：24示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：24)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

2-3-4 OVApOVAp-N端-CRM197A嵌合载体蛋白(OVApOVApCRM197A)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为OVApOVApCRM197A的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：25示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：25)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-3-5 CRM197A-C端-OVApOVAp嵌合载体蛋白(CRM197AOVApOVAP)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为CRM197AOVApOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：26示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID N O：26)GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAhAEINEAGR

2-3-6 OVApOVAp-N端-CRM197A-C端-OVAp嵌合载体蛋白(OVApOVApCRM197AOVAp)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将OVAp的氨基酸序列的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为OVApOVApCRM197AOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：27示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：27)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSS YHGTKPGYVDS IQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEF IKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

2-3-7 OVAp-N端-CRM197A-C端-OVApOVAp嵌合载体蛋白(OVApCRM197AOVApOVAp)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的两个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，并且将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为OVApCRM197AOVApOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：28示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：28)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

2-4包含至少两种不同类型的通用表位的嵌合载体蛋白的序列设计

分别将三种不同的通用表位P2、P30和OVAp的组合融合至CRM197A载体蛋白，以进行新的嵌合载体蛋白的序列设计。

2-4-1 P2-N端-CRM197A-C端-P30嵌合载体蛋白(P2CRM197AP30)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，并且将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2CRM197AP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：29示出。P2表位和P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：29)QYIKANSKFIGITELGSGSGGaDDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-4-2 P30-N端-CRM197A-C端-P2嵌合载体蛋白(P30CRM197AP2)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，并且将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30CRM197AP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：30示出。P2表位和P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：30)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSLQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-4-3 P2P30-N端-CRM197A-C端-P2嵌合载体蛋白(P30CRM197AP2)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝和P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2P30CRM197AP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：31示出。P2、P30和OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：31)QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-4-4 P2P30-N端-CRM197A-C端-OVAp嵌合载体蛋白(P2P30CRM197AOVAp)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝和P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，将所融合的序列随后与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CRM197A载体蛋白(SEQ ID NO：4)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2P30CRM197AOVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：32示出。P2、P30和OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：32)QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEVINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

II.构建包含CM197A载体蛋白和一个或多个通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒

1.构建CRM197A载体蛋白的表达质粒

完整CRM197蛋白的氨基酸序列PRF：224021获自GenBank，并且CRM197的A链片段(下文称为CRM197A)的序列被确定为CRM197序列的第1-193位氨基酸。基于CRM197A序列，对编码CRM197A序列的核酸序列进行优化以使得能够在大肠杆菌中高效表达A链片段。使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析CRM197A的核酸序列，在CRM197A序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码CRM197A蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO：33所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码CRM197载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2.构建包含CRM197A和通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒

2-1.构建P2CRM197A的表达质粒

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2CRM197A的核酸序列，在P2CRM197A序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2CRM197A蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:34所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2CRM197A载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-2.构建P2CRM197AP2的表达质粒

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2CRM197AP2的核酸序列，在P2CRM197AP2序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2CRM197AP2蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:35所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2CRM197AP2载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-3.构建CRM197AP2、P2P2CRM197A、CRM197AP2P2、P2P2CRM197AP2和P2CRM197AP2P2的表达质粒

所述方法与上文在部分“2-1.构建P2CRM197A的表达质粒”中所述方法相同。

2-4.构建P30CRM197A的表达质粒

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30CRM197A的核酸序列，在P30CRM197A序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30CRM197A蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:36所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30CRM197A载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-5.构建CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、P30P30CRM197AP30和P30CRM197AP30P30的表达质粒

所述方法与上文在部分“2-4.构建P30CRM197A的表达质粒”中所述方法相同。

2-6.构建OVApCRM197A的表达质粒

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析OVApCRM197A的核酸序列，在OVApCRM197A序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码OVApCRM197A蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:37所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码OVApCRM197A载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-7.构建CRM197AOVAp、OVApCRM197AOVAp、OVApOVApCRM197A、CRM197AOVApOVAp、OVApOVApCRM197AOVAp和OVApCRM197AOVApOVAp的表达质粒

所述方法与上文在部分“2-6.构建OVApCRM197A的表达质粒”中所述方法相同。

2-8.构建P30CRM197AP2的表达质粒

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30CRM197AP2的核酸序列，在P30CRM197AP2序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30CRM197AP2蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:38所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30CRM197AP2载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-9.构建P2CRM197AP30、P2P30CRM197AP2和P2P30CRM197AOVAp的表达质粒

所述方法与上文在部分“2-8.构建P30CRM197AP2的表达质粒”中所述方法相同。

III.制备包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白

实验已经证明CRM197A载体蛋白和包含CRM197A载体蛋白和通用表位的嵌合载体蛋白具有相似性质。因此，本文所述的所有载体蛋白的纯化方法是相似的。下文描述了用于制备包含CRM197A载体蛋白和通用表位的嵌合载体蛋白的示例性方法。

1.表达包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的工程化细菌的制备

使用标准分子生物学方法将用于表达嵌合载体蛋白的每个质粒转化到感受态细胞中，并检查蛋白质表达。选择具有高蛋白质表达水平并通过抗血清测试的克隆来建立主原液文库和工作原液文库。

2.表达包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的工程化细菌的发酵

从低温冰箱中的工程化大肠杆菌工作原液文库中取出一管可以表达包含通用表位的特异性CRM197A嵌合载体蛋白的细菌，并在室温下解冻。使用无菌技术将工作原液中的细菌悬液转移到50mL培养基中，并在37℃的振荡培养箱中以180rpm的振荡速度培养，直到OD₆₀₀达到约1.0。然后用该细菌培养物接种1L培养基，将其在37℃的振荡培养箱中以180rpm的振荡速度培养，直至OD₆₀₀达到约1.0。接着用该1L细菌培养物接种50L发酵罐中的20L培养基，然后在240rpm和37℃下发酵。当OD₆₀₀达到约7-8时，将IPTG加入到培养物中以诱导细菌中的蛋白质表达。在发酵过程开始后14小时停止发酵。将经发酵的细菌培养物离心，并收集细菌。

3.包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的纯化

因为CRM197A用作构建具有通用表位的不同嵌合载体蛋白的核心组分，所以实验显示，虽然添加了通用表位，但是蛋白质纯化的参数未受到显著影响。可以改进CRM197A载体蛋白的纯化工序，以建立用于包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的纯化方法。

将50g湿细菌称入2L离心杯中。向该杯中加入300mL的1X PBS pH7.0缓冲液以重悬细菌。将细菌悬浮液在磁力搅拌盘上充分混合30分钟，然后在4℃、4000rpm下离心20分钟。弃去上清液并收集细菌。重复这些步骤两次。向含有细菌的离心管中加入300mL的1X PBS pH 7.0。将细菌在匀化器中裂解，并在4℃、10000rpm下离心20分钟。收集沉淀物并弃去上清液。向沉淀物中加入300mL的1X PBS pH 7.0缓冲液，并将混合物在磁力搅拌盘上充分混合30分钟。将混合物在4℃、4000rpm下离心20分钟。收集包涵体，并弃去上清液。向经洗涤的包涵体添加900mL变性溶液。然后将混合物在25℃、10000rpm下离心30分钟。收集上清液，并弃去沉淀物。将上清液转移到6-8KDA透析袋中。将透析袋密封并置于10L重新折叠缓冲液1中，并使其在室温下在磁力搅拌盘上平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液2中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L透析缓冲液3中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液4中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液5中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到2L储存缓冲液中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将储存缓冲液更换两次，并在室温下进行透析过夜。获得1mL透析溶液，并在室温和12000rpm下离心10分钟。收集上清液，并测量蛋白质浓度。将蛋白质样品上样到预平衡的DEAE凝胶柱上，并以梯度模式洗脱以收集目标蛋白质峰。然后将收集的样品上样到苯基疏水柱上以进一步纯化，并收集洗脱的峰。最后，将收集的样品上样到SP凝胶柱上，并收集洗脱的峰。将收集的经纯化目标蛋白质转移至透析袋，并用0.15M NaCl缓冲液透析。将经透析的样品转移至4℃进行保存。

IV.细菌荚膜多糖的制备

纯化来自三种细菌菌种(包括肺炎链球菌的13种血清型、b型流感嗜血杆菌，以及脑膜炎奈瑟氏菌的A、C、Y和W135组)的荚膜多糖，以合成缀合物疫苗。经纯化的荚膜多糖的质量满足在多糖-蛋白质缀合物疫苗合成中使用的多糖的WHO标准。

1.来自肺炎链球菌的荚膜多糖的制备

1-1.原液文库的构建

肺炎链球菌的13种血清型菌株购自ATCC，包括1(货号：9163)、3(货号：10813)、4(货号：BAA-334)、5(货号：BAA-341)、6A(货号：BAA-659)、6B(货号：700675)、7F(货号：10351)、9V(货号：700671)、14(货号：6314)、18C(货号：10356)、19A(货号：700673)、19F(货号：700905)，以及23F(700669)。将0.5mL肺炎链球菌液体培养基AHC加入至购自ATCC的每种细菌菌株(原始原液)中，并与细菌菌株充分混合。使用0.25mL细菌培养物接种含有5％绵羊血的AHC培养基，并在摇床中于36℃±1℃，120rpm下温育约12-20小时。当OD₆₀₀达到1.0后，使用接种环将该含有5％绵羊血的AHC培养物接种到AHC琼脂板上，并在培养箱中于36℃±1℃下温育12-20小时。使用接种环将1至若干个细菌菌落各自接种到10mL的AHC培养液中，并在摇床中于36℃±1℃下以150-200rpm的振荡速度温育12小时。当细菌培养物的OD₆₀₀达到1.0时，使用5mL该细菌AHC培养物接种新鲜的200mL AHC培养物，并在摇床中于36℃±1℃下以150-200rpm的振荡速度温育12小时。当OD₆₀₀达到1.0后，将细菌培养物等分至200个各自容纳有1mL细菌培养物的小试管中，并离心(4000rpm，10分钟)。弃去上清液，向沉淀物中加入0.5mL新鲜的AHC培养液和0.5mL无菌脱脂乳，充分混合，并在乙醇-干冰浴中快速冷冻。然后将样品冻干、编号，并作为主原液保存在4℃冰箱中。取出主原液，并使用形成主原液的方法形成工作原液：使用细菌培养物接种新鲜的200mL AHC培养液，并在摇床中于36℃±1℃下以150-200rpm的振荡速度温育12小时。当OD₆₀₀达到1.0后，将细菌培养物等分至200个各自容纳有1mL细菌培养物的小试管中，并离心(4000rpm，10分钟)。弃去上清液，向样品中加入0.6mL新鲜的AHC培养液和0.4mL 40％甘油溶液，充分混合，在干冰上快速冷冻，并保存在-70℃低温冰箱中作为工作原液。

1-2.肺炎链球菌的发酵

从原液文库中取出冻干的工作原液，加入1mL富AHC培养液以溶解冻干的细菌。使用溶解的细菌溶液接种试管中的5mL富AHC培养液，并通过在CO₂培养箱中静置而温育过夜。当观察到细菌生长时，使用细菌培养物接种烧瓶中的100mL富AHC培养基。将烧瓶置于摇床中并在36℃、200rpm下温育直至OD₆₀₀达到1.0。分别使用两等分试样的100mL细菌培养物各自接种培养瓶中的1L富AHC培养基。将培养瓶置于摇床中并在36℃、200rpm下温育直至OD₆₀₀达到1.0。将35L经无菌过滤的富AHC培养液转移到50L发酵罐中。将OD为1的2L细菌培养物转移到发酵罐中。当细菌生长达到平台期时，将细菌灭活并收获上清液。

1-3.荚膜多糖的纯化

使用深度过滤器过滤上清液以进一步除去剩余的细菌和碎屑。使用100KDa超滤膜将无菌上清液浓缩10倍(约600mL)。使用6L 25mM乙酸钠进行超滤洗涤。加入HB储存溶液以获得1％(w/v)的最终浓度，充分混合，并在冷藏室中保存过夜。将溶液以4000rpm离心1小时，收获多糖/HB沉淀物，并弃去上清液。将25mM乙酸钠和1％HB溶液加入到多糖/HB沉淀物中，将其通过搅拌重新悬浮，然后将重悬液以4000rpm离心1小时，收获多糖/HB沉淀物，并弃去上清液。将离心过程重复3次。将600mL0.25氯化钠溶液加入到多糖+HB混合物中，充分混合，加入碘化钾至最终浓度为0.5％。将溶液在冷藏室中保存过夜。使用深度过滤器过滤溶液以去除HB/I沉淀物，并使用0.25M氯化钠/0.5％碘化钾溶液洗涤深度过滤器上的沉淀物。收集滤液，并弃去沉淀物。将粗制多糖溶液在含有活性炭的深度过滤器中循环过滤30分钟(4％活化过滤器/0.5mg/ml粗制多糖溶液)。将pH6.8的磷酸钠缓冲液加入到多糖溶液中，以获得25mM的最终浓度。将上述溶液通过HA柱(50-100ml)并循环30分钟。使用4-5倍柱体积的相同磷酸盐缓冲液来洗涤柱。使用30KDa膜来超滤和浓缩多糖溶液5次。使用不含热原的水超滤清洗多糖溶液。使用0.22μm的膜来过滤多糖溶液，然后将其冻干。

2.来自b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖的制备

2-1.原液文库的构建

将作为赠品获得的b型流感嗜血杆菌菌株用作原始原液来形成主原液和工作原液。形成原液的方法描述于构建肺炎链球菌的原液文库的部分中。

2-2.b型流感嗜血杆菌的发酵

使用b型流感嗜血杆菌(Hib)工作原液接种平板中的培养基，并在36.5℃培养箱中温育过夜。取Hib菌落来接种5mL新鲜的必需培养基，并在摇床中于36.5℃和300rpm下温育。当接种的培养物达到OD为0.6-1.0的培养基对数生长期时，将接种的培养物转移到容纳有45mL新鲜必需培养基的250mL培养瓶中，并在摇床中于36.5℃和300rpm下温育。当接种的培养物达到OD为0.6-1.0的培养基对数生长期时，将接种的培养物转移到容纳有1L新鲜必需培养基的4L培养瓶中，并在摇床中于36.5℃和300rpm下温育。当接种的培养物达到OD为0.6-1.0的培养基对数生长期(约16-18小时)时，将接种的培养物转移到容纳有20L新鲜必需培养基的发酵罐中。当Hib细菌达到培养基对数生长期时，加入新鲜必需培养基和补充培养基，以在培养基中提供23g/L的最终葡萄糖浓度。所添加的新鲜补充培养液的总体积为25L。在温育14.5小时后停止发酵。

2-3.荚膜多糖的纯化

将Hib培养物离心，收集沉淀的Hib细菌，重悬于2L蒸馏水中，并使用磁力搅拌器充分混合。将200mL 12％脱氧胆酸钠溶液加入细菌悬浮液中，充分混合30分钟，然后转移至10℃±3℃的冷藏室中，搅拌8-24小时以裂解细菌并释放多糖。使用50％乙酸溶液在20℃±5℃下将细菌裂解液的pH调节至6.4-6.8，然后停止搅拌，使溶液静置12-24小时。将溶液在10,000rpm下离心1小时，收集上清液，并弃去沉淀物。使用pH7.0的0.05M磷酸盐缓冲液对多糖上清液进行透析。加入等体积的0.2％HB溶液，使用磁力搅拌器混合30分钟，然后转移到4℃冷藏室中静置过夜。将溶液在10,000rpm下离心1小时，收集沉淀物并弃去上清液。加入100mL 0.5M氯化钠溶液以溶解沉淀物。加入680mL无水乙醇，充分混合，然后转移到4℃冷藏室中静置过夜。将溶液在10,000rpm下离心30分钟，收集上清液并弃去沉淀物。加入5.2L无水乙醇，充分混合，然后转移到4℃冷藏室中静置过夜。将溶液在10,000rpm下离心30分钟，收集沉淀物并弃去上清液。加入500mL蒸馏水以溶解沉淀物，然后将其透析并冻干。

3.来自脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的制备

3-1.原液文库的构建

将作为赠品获得的脑膜炎奈瑟氏菌菌株A、C、Y和W135用作原始菌株来形成主原液和工作原液。形成原液的方法描述于构建肺炎链球菌的原液文库的部分中。

3-2.脑膜炎奈瑟氏菌的发酵和荚膜多糖的纯化

参见关于发酵Hib和纯化Hib多糖的对应部分。

V.多糖-蛋白质缀合物的制备

不同细菌多糖的化学结构含有不同的官能团。因此，需要不同的合成方法来将不同的多糖共价连接至载体蛋白以形成缀合物。用不同合成方法形成的缀合物的收率和免疫原性质可为不同的。本发明的实验结果表明三种不同的合成方法，即还原胺化、CDAP方法(使用3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N,N-二甲基-丙-1-胺)和ADH方法(己二酸二酰肼)，合成了特异性多糖-蛋白质缀合物。本发明的示例性多糖-蛋白质缀合物包括13价肺炎链球菌(Pn)多糖缀合物、b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖缀合物以及4价脑膜炎奈瑟氏菌(Men)多糖缀合物。

1. 13价肺炎链球菌(Pn)多糖-P2CRM197A缀合物的制备

对包含CRM197A嵌合载体蛋白的26种多糖-蛋白质缀合物进行序列设计和生产。因为蛋白质的结构相似，所以使用选自还原胺化、ADH方法和CDAP方法的相同方法来合成多糖-蛋白质缀合物。以下实例仅为了进行示意性的说明，显示了使用P2CRM197A嵌合载体蛋白的合成过程。使用其他嵌合载体蛋白的合成方法相似，因此本文不再赘述。

1-1.肺炎链球菌血清型1(Pn1)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

将5mg经消化的Pn1多糖称入反应烧瓶中，并向该反应烧瓶中加入0.5mL的1M NaCl。通过搅拌使多糖完全溶解。记录多糖溶液的初始pH，量取适量的CDAP溶液并加入到反应烧瓶中。搅拌该混合物并使其在室温下反应1.5分钟，并在30秒时测量混合物的pH。1.5分钟后，加入0.2M NaOH溶液以将溶液的pH调节至9.5，搅拌混合物并使其在室温下反应3分钟(使用0.2M NaOH来将混合物的pH保持在9.5)。3分钟后立即向反应烧瓶中加入5mg P2CRM197A嵌合蛋白，搅拌混合物并使其在室温(25℃)下反应1小时。向反应烧瓶中加入37.5μL的2M赖氨酸溶液，并使用0.1N HCl溶液将混合物的pH调节至9.0。搅拌混合物并使其在室温下反应30分钟。将反应烧瓶转移至4℃以允许反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8000)，并在4℃下用0.85％NaCl溶液透析3次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-2.肺炎链球菌血清型3(Pn3)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量20mg经消化的Pn1多糖放入反应烧瓶中，并向反应烧瓶中加入2mL的0.15M NaCl。通过搅拌使多糖完全溶解。量取适量的CDAP溶液并加入反应烧瓶中。搅拌该混合物并使其在室温下反应1.5分钟，并在30秒时测量混合物的pH。1.5分钟后，加入0.2M NaOH溶液以将溶液的pH调节至9.5，搅拌混合物并使其在室温下反应3分钟(使用0.2M NaOH来将混合物的pH保持在9.5)。将ADH加入反应烧瓶中以达到0.8M的最终浓度，充分混合，然后使其在室温下反应2小时。将所得的多糖转移至透析袋，用0.15M NaCl溶液透析，并更换三次NaCl溶液。将样品加载到G-50柱上，使用0.15M NaCl洗脱，收集空隙体积以外的峰。将收集的样品转移至透析袋，用水透析，并更换三次水。称量5mg所得的Pn3多糖，将其溶解在0.5mL的0.15M NaCl溶液中。加入5mg P2CRM197A嵌合蛋白，充分混合。加入30mM EDC，使其在室温下反应4小时，然后转移至4℃进行过夜反应。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8000)，并在4℃下用0.85％NaCl溶液透析3次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-3.肺炎链球菌血清型4(Pn4)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5mg经活化的多糖放入反应烧瓶中，量取100μL的0.5M磷酸钠缓冲液同样加入反应烧瓶中。称量5mg P2CR197A嵌合蛋白并加入反应烧瓶中。搅拌混合物直至多糖完全溶解。量取0.5mL纯水并加入反应烧瓶中，通过搅拌充分混合。称量5.0mg氰基硼氢化钠并加入反应烧瓶中。将该反应体系置于40℃干浴中，反应12小时。反应完成后，向反应烧瓶中加入1.5mL 0.15M氯化钠溶液。称量2.5mg硼氢化钠并加入反应烧瓶中。将反应体系置于22℃下，反应5小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 12-14kDa)，然后在4℃下用0.15M NaCl溶液透析3次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-4.肺炎链球菌血清型5(Pn5)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5mg经活化的多糖放入反应烧瓶中，量取100μL的0.5M磷酸钠缓冲液同样加入反应烧瓶中。称量4.0mg P2CR197A嵌合蛋白并加入反应烧瓶中。量取0.5mL纯水，并加入反应烧瓶中，通过磁力搅拌混合以溶解反应物，并测量反应混合物的pH。称量5.0mg氰基硼氢化钠并加入反应烧瓶中。将反应体系置于室温下，反应48小时。称量2.5mg硼氢化钠，使用移液管将其溶解在10μL纯水中，并装入反应烧瓶内。将反应体系置于23℃下，反应5小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，然后在4℃下用0.15M NaCl溶液透析3次，每5个小时更换一次NaCl溶液。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-5.肺炎链球菌血清型6A(Pn6A)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量6.0mg经活化的多糖Pn6A放入反应烧瓶中。将1mL纯水加入反应烧瓶中，搅拌直至多糖完全溶解，并测量溶液的初始pH。使用0.1M NaOH将溶液的pH调节至7.0。将4.0mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，充分搅拌。称量5.0mg氰基硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应18小时。在反应后取样并送出进行测试。称量2.7mg硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应5小时。在反应后取样并送出进行测试。将反应混合物转移至透析袋，然后在4℃下用0.15M NaCl溶液透析3次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-6.肺炎链球菌血清型6B(Pn6B)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5.0mg Pn6B多糖放入反应烧瓶中。将1mL纯水加入反应烧瓶中，搅拌直至多糖完全溶解，并测量溶液的初始pH。使用0.1M NaOH将溶液的pH调节至7.0。将2.5mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，充分搅拌。称量5.0mg氰基硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应20小时。称量2.5mg硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应6小时。将反应混合物转移至透析袋，然后在4℃下用0.15M NaCl溶液透析5次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-7.肺炎链球菌血清型6F(Pn6B)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量10.0mg Pn6F多糖放入反应烧瓶中。将1mL纯水加入反应烧瓶中，搅拌直至多糖完全溶解。将0.1M NaOH滴加到多糖溶液中，以将溶液的pH调节至7.0。将3.5mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并搅拌以充分混合。称量5.0mg氰基硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应20小时。将990μL水加入反应烧瓶中，充分混合。称量2.5mg硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应6小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，然后在4℃下用5mM琥珀酸盐/0.9％氯化钠缓冲液透析5次(6L/次)。透析后，将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，并收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-8.肺炎链球菌血清型9V(Pn9V)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量10.0mg经活化的Pn9V多糖放入反应烧瓶中。将125μL磷酸钠缓冲液加入反应烧瓶中。将125μL纯水加入反应烧瓶中，搅拌直至多糖完全溶解。将15mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并搅拌以完全溶解。称量10mg NaBH₃(CN)并加入反应烧瓶中。将反应体系置于22℃下，反应48小时。称量2.5mg硼氢化钠，加入反应烧瓶中，并使其在22℃下反应5小时。将反应混合物在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-9.肺炎链球菌血清型14(Pn14)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5mg经活化的Pn14多糖放入反应烧瓶中。将1mL的3.9mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并搅拌以使多糖完全溶解。将5mg氰基硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在22℃下反应48小时。将2.5mg硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应4小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 12-14KDA)，包括2mL用于冲洗反应烧瓶的透析溶液。将反应混合物用0.15M氯化钠溶液以6L/次透析3次，每5个小时更换一次氯化钠溶液。透析后，将经透析的样品在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-10.肺炎链球菌血清型18C(Pn18C)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5mg经消化的Pn18C多糖放入反应烧瓶中，并加入1mL的1M氯化钠溶液以溶解多糖。测量溶解的溶液的初始pH。加入适量的CDAP溶液，并在室温下搅拌1.5分钟。加入0.2M NaOH溶液以将混合物的pH调节至9.0。然后使混合物在室温下反应3分钟。将10mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并使其在25℃下反应45分钟。反应完成后，加入37.5μL的2M赖氨酸溶液，并使其在25℃下反应30分钟。然后使混合物在4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，并用0.85％氯化钠溶液以6L/次透析，更换氯化钠溶液3次，其中每5个小时更换一次氯化钠溶液。透析后，将经透析的样品在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-11.肺炎链球菌血清型19A(Pn19A)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量10mg经活化的Pn19A多糖放入反应烧瓶中。将0.5mL缓冲溶液加入反应烧瓶中，使用磁力棒搅拌直至多糖完全溶解。将10mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并搅拌以充分混合。将5mg氰基硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应20小时。将2.5mg硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在室温下反应5小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，并用0.85％氯化钠溶液以6L/次透析3次，每5个小时更换一次氯化钠溶液。透析后，将经透析的样品在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-12.肺炎链球菌血清型19F(Pn19F)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量5.2mg经氧化的Pn19F多糖并加入反应烧瓶中。将1mL纯水加入反应烧瓶中，使用磁力棒搅拌直至多糖完全溶解。将3.0mg P2CRM197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中，并搅拌以充分混合。将4.9mg氰基硼氢化钠加入反应烧瓶中，在磁力搅拌盘上进行搅拌，并使其在18℃下反应24小时。将2.5mg硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在18℃下于培养箱中反应5小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 12-14KDA)，并以6L透析溶液/次透析5次，每5个小时更换一次透析溶液。透析后，将经透析的样品在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

1-13.肺炎链球菌血清型23F(Pn23F)荚膜多糖-P2CRM197A缀合物的制备

称量4.9mg经氧化的Pn23F多糖并加入反应烧瓶中。将1mL纯水加入反应烧瓶中，使用磁力棒搅拌直至多糖完全溶解。将5.0mg P2CR197A嵌合蛋白加入反应烧瓶中。将5.1mg氰基硼氢化钠加入反应烧瓶中，在磁力搅拌盘上进行搅拌，并使其在18℃下于培养箱中反应17小时。将2.5mg硼氢化钠加入反应烧瓶中，并使其在18℃下于培养箱中反应5小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 12-14KDA)，并用0.15M氯化钠溶液以6L透析溶液/次透析5次，每5个小时更换一次透析溶液。透析后，将经透析的样品在10,000rpm下离心10分钟，然后收集上清液。将上清液纯化并使用Sepharose CL-4B凝胶柱进行透析，收集缀合物峰，取样并送出进行测试。

2.b型流感嗜血杆菌(Hib)多糖-P2CRM197A(Hib-P2CRM197A)缀合物的制备

在合成b型流感嗜血杆菌(Hib)缀合物疫苗的实例中，使用了包含通用表位和CRM197载体蛋白的六种嵌合载体蛋白，包括P2CRM197A、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2和P2P30CRM197AOVAp嵌合载体蛋白。因为合成具有不同嵌合载体蛋白的Hib缀合物的方法是相似的，所以在本文中将使用P2CRM197A嵌合载体蛋白的方法用作本发明的示例来描述缀合物合成方法。

ADH方法用于合成Hib缀合物。该方法的合成步骤可以分为Hib多糖衍生步骤和缀合物合成步骤。

2-1.Hib多糖衍生步骤

将5mg Hib多糖溶解在1mL纯水中，并通过加入溴化氰活化。向反应混合物中加入2mL ADH溶液以达到0.4M的最终浓度，并使其在2-8℃下反应过夜。将反应混合物用0.2M氯化钠透析。将样品加载到G-50柱上，并收集空隙体积以外的峰。将缀合物样品转移至透析袋，用纯水透析，然后冻干，获得固体多糖衍生物。多糖衍生物应保存在-20℃或更低温度下。

2-2.Hib多糖-P2CRM197A缀合物的合成

称量10mg Hib多糖衍生物并加入反应烧瓶中。将0.5mL的0.15M NaCl加入反应烧瓶中，搅拌以溶解多糖，置于室温下，然后在4℃下过夜以确保多糖完全溶解。混合物中多糖的浓度为20mg/mL。将多糖溶液通过0.45μm膜无菌过滤到反应烧瓶中。使用0.1M NaOH或0.1N HCl将过滤后溶液的pH调节至5.5。将含有5mg P2CRM197A的溶液加入反应烧瓶中，并搅拌以充分混合。将2.9mg EDC加入反应烧瓶中，搅拌，并使其反应4小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，在4℃下用0.15M NaCl溶液透析，更换三次NaCl溶液。将经透析的样品通过Sepharose CL-4B柱纯化，并收集空隙体积以外的峰。基于分析结果，将含有缀合物的级分合并，无菌过滤，并保存在4℃下。

2-3.Hib多糖-CRM197A缀合物的合成

根据上述“Hib多糖-P2CRM197A缀合物的合成”部分中所述的方法，本发明选择了包含通用表位的六种另外的嵌合载体蛋白(包括CRM197AP2、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2、P2P30CRM197AOVAp以及使用CRM197A载体蛋白的对照样品)来制备总共7种缀合物，即Hib-CRM197AP2、Hib-P2CRM197AP2、Hib-P30CRM197A、Hib-OVApCRM197A、Hib-P30CRM197AP2、Hib-P2P30CRM197AOVAp和Hib-CRM197A。

3.4价脑膜炎奈瑟氏菌(Men)多糖-P2CRM197A缀合物的制备

使用ADH方法合成脑膜炎奈瑟氏菌多糖-P2CRM197A缀合物。该方法包括两个步骤，即多糖衍生和共轭合成。

3-1.脑膜炎奈瑟氏菌A群菌株多糖-P2CRM197A缀合物(MenA-P2CRM197A)的合成

3-1-1.脑膜炎奈瑟氏菌A群菌株(MenA)多糖的衍生

将20mg MenA多糖溶解在4mL纯水中，并通过加入溴化氰活化。向反应混合物中加入10mL ADH溶液以达到0.4M的最终浓度，并使其在2-8℃下反应过夜。将反应混合物用0.2M氯化钠透析。将样品加载到G-50柱上，并收集空隙体积以外的峰。将缀合物样品转移至透析袋，用纯水透析，然后冻干，获得固体多糖衍生物。多糖衍生物应保存在-20℃或更低温度下。

3-1-2.MenA多糖-P2CRM197A缀合物的合成

称量5mg MenA多糖衍生物并加入反应烧瓶中。将0.5mL的0.15M NaCl加入反应烧瓶中，搅拌以溶解多糖，置于室温下，然后在4℃下过夜以确保多糖完全溶解。混合物中多糖的浓度为20mg/mL。将多糖溶液通过0.45μm膜无菌过滤到反应烧瓶中。使用0.1M NaOH或0.1N HCl将过滤后溶液的pH调节至5.5。将含有5mg P2CRM197A的溶液加入反应烧瓶中，并搅拌以充分混合。将2.9mg EDC加入反应烧瓶中，搅拌，并使其反应4小时。将反应混合物转移至透析袋(MWCO 6-8KDA)，在4℃下用0.15M NaCl溶液透析，更换三次NaCl溶液。将经透析的样品通过Sepharose CL-4B柱纯化，并收集空隙体积以外的峰。基于分析结果，将含有缀合物的级分合并，无菌过滤，并保存在4℃下。

3-1-3.其他脑膜炎奈瑟氏菌多糖-CRM197A缀合物的合成

根据上述“MenA多糖-P2CRM197A缀合物的合成”部分中所述的方法，合成三种另外的缀合物，包括脑膜炎奈瑟氏菌C群多糖-P2CRM197A(称为MenC-P2CRM197A)、脑膜炎奈瑟氏菌Y群多糖-P2CRM197A(称为MenY-P2CRM197A)以及脑膜炎奈瑟氏菌W135群多糖-P2CRM197A(称为MenW135-P2CRM197A)。

3-2.其他4价脑膜炎奈瑟氏菌多糖-CRM197A缀合物的制备

根据先前“4价脑膜炎奈瑟氏菌(Men)多糖-P2CRM197A缀合物的制备”部分中所述的方法，本发明选择了包含通用表位的六种嵌合载体蛋白(包括CRM197AP2、P2CRM197AP2、P30CRM197A、OVApCRM197A、P30CRM197AP2、P2P30CRM197AOVAp以及使用CRM197A载体蛋白的对照样品)来制备总共7种缀合物，即4Men-CRM197AP2、4Men-P2CRM197AP2、4Men-P30CRM197A、4Men-OVApCRM197A、4Men-P30CRM197AP2、4Men-P2P30CRM197AOVAp和4Men-CRM197A。

VI.多糖-蛋白质缀合物的免疫原性评估

将使用相应多糖-蛋白质缀合物制备的疫苗注射到小鼠体内。收集血样，并使用ELISA测定法测定血清中抗多糖抗体的滴度。使用调理吞噬测定法评估免疫原性的增强。

1. 13价肺炎链球菌多糖-蛋白质缀合物的免疫原性评估

1)13价Pn多糖-P2CRM197A缀合物的免疫原性评估

为了评估包含具有通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物是否比包含不具有通用表位的CRM197A载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物具有更优的免疫原性，合成13价Pn-CRM197A缀合物以用作评估13价Pn-CRM197A嵌合载体蛋白缀合物的免疫原性增强的对照。

1-1. 13价Pn多糖-P2CRM197A蛋白缀合物疫苗和13价Pn多糖-CRM197A蛋白缀合物疫苗的制备

使用LABSCALE^TM切向流过滤(TFF)系统(美国密理博公司(Millipore,USA))将包含Pn-1、Pn-3、Pn-4、Pn-5、Pn-6A、Pn-7F、Pn-9V、Pn-14、Pn-18C、Pn-19A、Pn-19F和Pn-23F荚膜多糖的每种缀合物溶液浓缩至多糖浓度为约40μg/mL。将包含Pn-6B血清型荚膜多糖的缀合物的溶液的浓度浓缩至多糖浓度为80μg/mL。根据下表1中所列的最终多糖浓度，将相应计算体积的每种单一血清型缀合物加入制备瓶中。

表1.单一血清型缀合物溶液的最终浓度

将缀合物混合物通过0.22μm过滤器进行无菌过滤。加入无菌磷酸铝凝胶以达到125mg/mL的最终铝离子浓度。加入缓冲液以达到最终体积，并包装成0.5mL/瓶。

1-2.包含具有通用表位的其他嵌合载体蛋白的13价肺炎链球菌(Pn)多糖-蛋白质缀合物的制备

根据先前“13价Pn多糖-P2CRM197AP2蛋白缀合物的制备”部分中所述的方法，本发明制备了对应于以下13价Pn多糖-CRM197嵌合载体蛋白缀合物的疫苗，所述疫苗用于免疫原性评估测定。

使用包含具有P2通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn多糖缀合物制备的疫苗：13Pn-CRM197AP2、13Pn-P2CRM197AP2、13Pn-P2P2CRM197A、13Pn-CRM197AP2P2、13Pn-P2P2CRM197P2和13Pn-P2CRM197AP2P2。

使用包含具有P30通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn多糖缀合物制备的疫苗：13Pn-P30CRM197A、13Pn-CRM197AP30、13Pn-P30CRM197AP30、13Pn-P30P30CRM197A、13Pn-CRM197AP30P30、13Pn-P30P30CRM197AP30和13-P30CRM197AP30P30。

使用包含具有OVAp通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn多糖缀合物制备的疫苗：13Pn-OVApCRM197A、13Pn-CRM197AOVAp、13Pn-OVApCRM197AOVAp、13Pn-OVApOVApCRM197A、13Pn-CRM197AOVApOVAp、13Pn-OVApOVApCRM197AOVAp和13Pn-OVApCRM197AOVApOVAp。

使用包含具有至少两种不同类型通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn多糖缀合物制备的疫苗：13Pn-P30CRM197AP2、13Pn-P2CRM197AP30、13Pn-P2P30CRM197AP2和13Pn-P2P30CRM197AOVAp。

1-3.小鼠免疫和血液收集

获得5-6周龄的70只KM57小鼠。为每只小鼠注射所制备的13价Pn多糖-P2CRM197A蛋白缀合物疫苗。注射体积为0.1mL/小鼠/时间。将小鼠分为两组：第1组注射13价Pn多糖-P2CRM197A疫苗；第2组注射13价Pn多糖-CRM197A疫苗作为对照。小鼠的免疫计划表如下表2所示：

表2.免疫计划表

将血样收集在离心管中，使其在室温下静置2小时，并在10,000rpm下离心10分钟。使用移液管从上清液中小心取出血清，并保存在4℃冰箱中用于进一步测试。

1-4.使用ELISA测定小鼠血清中的抗多糖抗体滴度

制备13种溶液，每种溶液含有1mg/mL的13种Pn血清型特异性多糖之一(在1×PBS溶液中)，并将所述溶液保存在4℃冰箱中。将血清型特异性Pn多糖溶液在包被缓冲液中稀释至2-4μg/mL。将100μL包被缓冲液加入ELISA板的每个孔中以包被孔，并在室温下温育过夜。用洗涤缓冲液洗涤孔4次，向每个孔中加入100μL封闭缓冲液，在室温下温育2小时。用洗涤缓冲液洗涤孔4次，并可在4℃下保存1周。

将从注射过缀合物疫苗或对照样品的小鼠获得的血清样品以1:10稀释以获得工作血清样品，将所述工作血清样品进一步稀释适当的倍数，并加入ELISA板的第一行孔中，总体积为200μL/孔。在后续行中制备第一行样品的连续两倍稀释物，并将板在室温下温育2小时。用洗涤缓冲液洗涤孔4次。向每个孔中加入100μL碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠抗体(1:2000稀释物)，并在室温下温育4小时。用洗涤缓冲液洗涤孔4次。向每个孔中加入100μL 4-硝基苯基磷酸二钠底物，记录405nm波长处的OD。小鼠血清中血清型特异性Pn多糖抗体的滴度如下表3所示。

表3.血清型特异性Pn多糖抗体滴度

结果显示，包含具有通用表位的嵌合载体蛋白的缀合物(即，包含P2CRM197A嵌合载体蛋白的13价Pn荚膜多糖-P2CRM197A缀合物)的疫苗具有比13价Pn荚膜多糖-CRM197A缀合物更优的免疫原性。三次注射后小鼠血清中针对Pn多糖的特异性IgG抗体的滴度显著高于一次或两次注射后IgG抗体的滴度。三次注射后每种血清型特异性抗体的滴度比一次注射后的滴度高4倍以上，这满足关于增加缀合物疫苗滴度的WHO标准。与13价Pn荚膜多糖-CRM197A缀合物相比，三次注射后13价Pn PS-P2CRM197A缀合物在小鼠血清中具有更高的针对每种血清型特异性CP的抗体滴度。

1-5.调理吞噬测定法(OPA)

调理吞噬测定法是评估基于Pn多糖缀合物的疫苗的杀菌效力的方法。使用UAB-MOPA的“protocol for multiplexed opsonogphagocytic killing assay for antibodies against Streptococcus pnaeumoniae capsular polysaccharide”(用于针对肺炎链球菌荚膜多糖的抗体的多重调理吞噬细胞杀伤测定法的方案)测试小鼠血清样品。OPA浓度示于下表4中。

表4.OPA浓度

实验结果显示，三次注射13价Pn PS-P2CRM197A缀合物后获得的小鼠血清样品的OPA浓度与三次注射13-价Pn PS-CRM197A缀合物后获得的小鼠血清样品的OPA浓度相比显著增大。

2)其他13价Pn PS-CRM197A缀合物的免疫原性评估

类似于先前“13价Pn PS-P2CRM197A缀合物的免疫原性评估”部分中所述的方法，响应于包含具有通用表位的嵌合载体蛋白的其他疫苗的抗多糖IgG抗体的滴度如下表5所示。表5仅列出三次注射后的抗多糖IgG滴度。

表5.抗PS IgG滴度

上述结果表明，与包含不具有通用表位的CRM197A载体蛋白的13价Pn PS缀合物相比，包含具有通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物的免疫原性显著增强。与包含具有通用表位的仅一个拷贝的CRM197A嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物相比，包含具有同一通用表位的两个拷贝的CRM197A嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物具有更高的免疫原性。当嵌合载体蛋白中的通用表位的拷贝数增加到3时，用该嵌合载体蛋白制备的13价Pn PS缀合物的免疫原性与包含具有通用表位的两个拷贝的CRM197A嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物相比没有显著差异。通用表位与嵌合载体蛋白的N端或C端的融合导致相应的13价Pn PS-CRM197A嵌合载体蛋白缀合物的免疫原性没有差异。具有至少两种不同类型的通用表位的嵌合载体蛋白进一步增强了相应的13价Pn PS-CRM197A嵌合载体蛋白缀合物的免疫原性。

2.Hib PS-CRM197A嵌合载体蛋白缀合物的免疫原性评估

2-1.基于Hib PS-CRM197A嵌合蛋白缀合物的疫苗的制备

使用Hib多糖(Hib PS)制备包含CRM197A载体蛋白的缀合物或具有通用表位的6种不同类型的CRM197A嵌合载体蛋白中任一种的缀合物。使用Hib PS-蛋白缀合物进一步制备相应疫苗以用于注射。该方法如下所述：

使用LABSCALE^TM切向流过滤(TFF)系统(美国密理博公司(Millipore,USA))将每种CP-蛋白缀合物溶液浓缩至多糖浓度为约25μg/mL。将浓缩的溶液各自通过0.22μm过滤器无菌过滤。向每种溶液中加入无菌磷酸铝佐剂，以达到125mg/mL的最终铝离子浓度。搅拌疫苗溶液以充分混合，并保存在2-8℃的冰箱中。

2-2.免疫和疫苗的免疫原性评估。

使用类似于先前“13-价Pn PS-CRM197A缀合物的免疫原性评估”部分中所述的方法来使动物免疫，收集血样，并使用ELISA测定法测定针对Hib多糖的抗体的血清滴度。结果示于下表6中。

表6.小鼠血清中抗Hib PS抗体的滴度

上述抗Hib PS抗体的滴度显示了不同类型的Hib PS-CRM197A嵌合蛋白缀合物的类似结果。与不具有通用表位的Hib PS-CRM197A蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的其他六种缀合物(即Hib-P2CRM197A、Hib-P2CRM197AP2、Hib-P30CRM197A、Hib-OVApCRM197A、Hib-P30CRM197AP2和Hib-P2P30CRM197AOVAp)具有显著增强的IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p<0.05。

3. 4价Men PS-CCRM197A嵌合蛋白缀合物的免疫原性评估

3-1. 4价MenPS-CRM197A嵌合蛋白缀合物疫苗(4Men-P2CRM197A)的制备

使用LABSCALE^TM切向流过滤(TFF)系统(美国密理博公司(Millipore,USA))将MenA-P2CRM197A、MenC-P2CRM197A、MenY-P2CRM197A和MenW135-P2CRM197A缀合物的每种溶液浓缩至多糖浓度为约1000μg/mL，然后用0.85％NaCl溶液稀释并混合以制备每组多糖浓度为100μg/mL的4Men-P2CRM197A缀合物疫苗。将疫苗溶液通过0.22μm膜过滤以去除细菌。向疫苗溶液中加入无菌磷酸铝佐剂，以达到125mg/mL的最终铝离子浓度。将疫苗溶液保存在2-8℃的冰箱中。

3-2.免疫和疫苗的免疫原性评估

使用与先前“13价Pn PS-CRM197A缀合物的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法获得血清样品。以10μg/小鼠/时间的多糖注射剂量为每只小鼠注射0.1mL疫苗溶液。使用ELISA测定法测定针对每个Men多糖群组的抗体的血清滴度。结果示于下表7中。

表7.小鼠血清中抗Men PS抗体的滴度

上述抗Men PS抗体的滴度表现出与13价Pn PS缀合物和Hib PS缀合物类似的结果。与不具有通用表位的4价Men PS-CRM197A蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的缀合物具有显著更高的特异性抗PS IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p<0.05。

实例2：包含具有轮状病毒表面蛋白VP8(CoreVP8)和通用表位的嵌合载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物的制备和免疫原性评估

I.CoreVP8和包含通用表位的CoreVP8嵌合蛋白的序列设计

1CoreVP8的序列设计

基于病毒的免疫原性性质，轮状病毒可分为不同类型、亚型和血清型。目前，已经发现了7种血清型(A到G血清型)。大多数人病原性轮状病毒属于A、B和C血清型。不同轮状病毒的表面衣壳蛋白VP7和VP4的抗原簇是不同的，并且各自可独立地诱导相应的中和抗体。轮状病毒的血清型可通过VP4和VP7抗原的特异性免疫原性来确定。基于VP7和VP4的性质，轮状病毒A可以进一步分类为G血清型和P血清型。VP4是一种可被胰蛋白酶切割成两种不同病毒蛋白(即VP8和VP5)的蛋白质。研究表明VP5具有稳定的氨基酸序列，而VP8的氨基酸序列与高突变率相关。VP8的序列决定病毒是否属于P血清型。因此，VP8表面蛋白可以用作抗原来使动物免疫，以获得具有广泛保护范围的抗原。本发明使用VP8作为多糖-蛋白质缀合物中的免疫原性载体蛋白。来源于缀合物中的VP8免疫性载体蛋白的抗原可触发被免疫的人群体中的抗体产生并提供针对轮状病毒感染的免疫。

轮状病毒Wa毒株的P血清型属于P1A血清型，并且占人类中所有特有病原性轮状病毒毒株的90％。本发明是基于编码轮状病毒Wa毒株的VP4中的亚基VP8的基因。将VP8基因修饰、克隆、表达并纯化，制备缀合物疫苗中的载体蛋白。

人轮状病毒Wa毒株的VP8蛋白具有247个氨基酸和32,000道尔顿的分子量。所述氨基酸序列如以下SEQ ID NO：67所示。

(SEQ ID NO：67)MASLIYRQLLSNSYVTNISDEVNEIGTKKTTNVTVNPGPFAQTGYAPVDWGHGELPDSTLVQPTLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLPPIQNTRNTVPVNITSRQIKDAIR

VP8病毒蛋白是轮状病毒的衣壳蛋白并且是一种结构蛋白。全长VP8蛋白的水溶性很差。如果使用全长VP8作为载体蛋白来合成缀合物，则纯化过程将非常困难并且缀合物的收率会很低。为了克服此问题，可以选择性地切割编码全长VP8蛋白的基因以克隆不同长度的VP8片段，以便提高经切割的VP8蛋白的水溶性。尽管可以切割，但是必须保留VP8蛋白的主要表位。VP8蛋白的切割位点可以在蛋白的N端、C端或这两者。本发明的优选实施方案切割了VP8蛋白的N端和C端两者，即在从N-端开始的第64位之前和在C-端附近的第223位之后进行切割。经切割的VP8蛋白具有160个氨基酸。实验已经表明，此序列包含介导轮状病毒附着至宿主细胞的受体区。宿主细胞表面上的唾液酸被视为供VP8附着的配体。经切割的VP8多肽被称为核心VP8，其分子量为28kDa。CoreVP8的氨基酸序列如以下SEQ ID NO：5所示。

(SEQ ID NO：5)LDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL

实验已经表明，CoreVP8多肽具有高水溶性并且易于纯化。此外，作为缀合物的载体蛋白，CoreVP8使得能够获得高收率的合成缀合物。

2.包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的序列设计

将通用表位融合至CoreVP8免疫原性载体蛋白，以构建用于制备多糖-蛋白质缀合物的新嵌合载体蛋白。可将通用表位可融合至CoreVP8蛋白的N端或C端。或者，可分别将两种不同的通用表位各自融合至CoreVP8蛋白的N端或C端。在第三种策略中，可将同一通用表位的两个拷贝彼此融合，然后融合至CoreVP8蛋白的N端或C端。

由于包含CoreVP8和通用表位的嵌合载体蛋白的序列设计与包含CRM197A和通用表位的嵌合载体蛋白的序列设计类似，因此本公开描述了包含通用表位的若干代表性CoreVP8嵌合载体蛋白。应当理解，本发明不限于本文所述的实例。

2-1包含P2和CoreVP8的嵌合载体蛋白的序列设计

2-1-1 P2-N端-CoreVP8嵌合载体蛋白(P2CoreVP8)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2CoreVP8的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：39示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：39)QYIKANSKFIGITELGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL

2-1-2 P2-N端-CoreVP8-C端-P2嵌合载体蛋白(P2CoreVP8P2)的序列设计

分别将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端和C端各自经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2CoreVP8P2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：40示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：40)QYIKANSKFIGITELGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-2包含P30和CoreVP8的嵌合载体蛋白的序列设计

2-2-1 P30-N端-CoreVP8嵌合载体蛋白(P30 CoreVP8)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P30CoreVP8的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：41示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：41)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL

2-3包含OVAp和CoreVP8的嵌合载体蛋白的序列设计

2-3-1 OVAp-N端-CoreVP8嵌合载体蛋白(OVAp CoreVP8)的序列设计

将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为OVApCoreVP8的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：42示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：42)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGL

2-4包含至少两种不同类型的通用表位的嵌合载体蛋白的序列设计

2-4-1 P30-N端-CoreVP8-C端-P2嵌合载体蛋白(P30CoreVP8P2)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，并且将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30CoreVP8P2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：43示出。P2表位和P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：43)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-4-2 P2P30-N端-CoreVP8-C端-OVAp嵌合载体蛋白(P2P30CoreVP8OVAp)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝和P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，将该融合的序列随后与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将OVAp的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与CoreVP8载体蛋白(SEQ ID NO：5)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2P30CoreVP8OVAp的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：44示出。P2、P30和OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：44)QYTKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGLDGPYQPTSLNLPVDYWMLIAPTREGKVAEGTNTTDRWFACVLVEPNVQNTQRQYVLDGRNVQLNVSNESRTSWKFILFIKLTPDGTYTQYSTLSTPHKLCAWMKRDNRVYWYQGATPNASESYYLTINNDNSNVSSDAEFYLIPQSQTAMCTQYINNGLGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

II.包含CoreVP8载体蛋白和一个或多个通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒的构建

1.CoreVP8载体蛋白的表达质粒的构建

人轮状病毒Wa毒株的氨基酸序列GenBank:AGI04377由GenBank获得，并且对VP8蛋白片段的序列进行测定。基于VP8序列，分别从氨基酸序列的N端和C端去除区段以获得CoreVP8氨基酸序列。将编码CoreVP8氨基酸序列的核酸序列进行优化，以使得能够在大肠杆菌中高效表达CoreVP8蛋白。

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析CoreVP8的核酸序列，在CoreVP8序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码CoreVP8蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:45所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码CRM197载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2.包含CoreVP8和通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒的构建

为了评估包含具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的PS-蛋白缀合物的免疫原性，设计了六种不同类型的CoreVP8嵌合载体蛋白作为实例。

2-1.用于P2CoreVP8的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2CoreVP8的核酸序列，在P2CoreVP8序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2CoreVP8蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:46所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2CoreVP8载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-2.用于P2CoreVP8P2的表达质粒的构建

该方法类似于先前“2-1.用于P2CoreVP8的表达质粒的构建”部分中所述的方法。

2-3.用于P30CoreVP8的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30CoreVP8的核酸序列，在P30CoreVP8序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30CoreVP8蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:47所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30CoreVP8载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-4.用于OVApCoreVP8的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析OVApCoreVP8的核酸序列，在OVApCoreVP8序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码OVApCoreVP8蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:48所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码OVApCoreVP8载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-5.用于P30CoreVP8P2的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30CoreVP8P2的核酸序列，在P30CoreVP8P2序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30CoreVP8P2蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:49所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30CoreVP8P2载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-6.用于P2P30CoreVP8OVAp的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2P30CoreVP8OVAp的核酸序列，在P2P30CoreVP8OVAp序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2P30CoreVP8OVAp蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:50所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2P30CoreVP8OVAp载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

III.CoreVP8载体蛋白和包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的制备

实验已经证明了CoreVP8载体蛋白和包含CoreVP8载体蛋白和通用表位的嵌合载体蛋白的相似性质。因此，本文所述的所有载体蛋白的纯化方法是相似的。下面描述了用于制备包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的示例性方法。

1.表达包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的工程化细菌的制备

使用标准分子生物学方法将用于表达嵌合载体蛋白的每个质粒转化到感受态细胞中，并检查蛋白质表达。选择具有高蛋白表达水平并通过了抗血清测试的克隆来建立主原液文库和工作原液文库。

2.表达包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的工程化细菌的发酵

从低温冰箱中的工程化大肠杆菌工作原液文库中取出一管可以表达包含通用表位的特异性CoreVP8嵌合载体蛋白的细菌，并在室温下解冻。使用无菌技术将工作原液中的细菌悬液转移到50mL培养基中，并在37℃的振荡培养箱中以180rpm的振荡速度培养，直到OD₆₀₀达到约1.0。然后用该细菌培养物接种1L培养基，将其在37℃的振荡培养箱中以180rpm的振荡速度培养，直至OD₆₀₀达到约1.0。接着用该1L细菌培养物接种50L发酵罐中的20L培养基，然后在240rpm和37℃下发酵。当OD₆₀₀达到约7-8时，将IPTG加入到培养物中以诱导细菌中的蛋白质表达。在发酵过程开始后14小时停止发酵。将经发酵的细菌培养物离心，并收集细菌。

3.包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的纯化

因为CoreVP8用作构建具有通用表位的不同嵌合载体蛋白的核心组分，所以实验显示，虽然添加了通用表位，但是蛋白质纯化的参数未受到显著影响。可以改进CoreVP8载体蛋白的纯化工序，以建立用于包含通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的纯化方法。

将50g湿细菌称入2L离心杯中。向该杯中加入300mL的1X PBS pH 7.0缓冲液以重悬细菌。将细菌悬浮液在磁力搅拌盘上充分混合30分钟，然后在4℃、4000rpm下离心20分钟。弃去上清液并收集细菌。重复这些步骤两次。向含有细菌的离心管中加入300mL的1X PBS pH 7.0。将细菌在匀化器中裂解，并在4℃、10000rpm下离心20分钟。收集沉淀物并弃去上清液。向沉淀物中加入300mL的1X PBS pH 7.0缓冲液，并将混合物在磁力搅拌盘上充分混合30分钟。将混合物在4℃、4000rpm下离心20分钟。收集包涵体，并弃去上清液。向经洗涤的包涵体添加900mL变性溶液。然后将混合物在25℃、10000rpm下离心30分钟。收集上清液，并弃去沉淀物。将上清液转移到6-8KDA透析袋中。将透析袋密封并置于10L重新折叠缓冲液1中，并使其在室温下在磁力搅拌盘上平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液2中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L透析缓冲液3中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液4中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液5中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到2L储存缓冲液中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将储存缓冲液更换两次，并在室温下进行透析过夜。获得1mL透析溶液，并在室温和12000rpm下离心10分钟。收集上清液，并测量蛋白质浓度。将蛋白质样品上样到预平衡的DEAE凝胶柱上，并以梯度模式洗脱以收集目标蛋白质峰。然后，将收集的样品加载到Q琼脂糖柱上以进一步纯化，并收集洗脱的峰。最后，将收集的样品上样到SP凝胶柱上，并收集洗脱的峰。将收集的经纯化目标蛋白质转移至透析袋，并用0.15M NaCl缓冲液透析。将经透析的样品转移至4℃进行保存。

IV.多糖-CoreVP8缀合物的制备

使用三种不同的合成方法，即还原胺化、CDAP方法(使用3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N,N-二甲基-丙-1-胺)和ADH方法(使用己二酸二酰肼)来合成特异性多糖-CoreVP8缀合物。用不同合成方法形成的缀合物的收率和免疫原性质可为不同的。为了研究具有通用表位的不同嵌合载体蛋白对不同细菌多糖(PS)缀合物的免疫原性的影响，本公开描述了13价肺炎链球菌(Pn)PS-CoreVP8缀合物、b型流感嗜血杆菌(Hib)PS-CoreVP8缀合物和4价脑膜炎奈瑟氏菌(Men)PS-CoreVP8缀合物。

1. 13价Pn PS-CoreVP8蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白(包括P2CoreVp8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2和P2P30CoreVP8OVAp)各自合成以下13价Pn PS缀合物疫苗：13Pn-P2CoreVp8、13Pn-P2CoreVP8P2、13Pn-P30CoreVP8、13Pn-OVApCoreVP8、13Pn-P30CoreVP8P2和13Pn-P2P30CoreVP8OVAp。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备13价Pn PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

2.Hib PS-CoreVP8蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白(包括P2CoreVp8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2和P2P30CoreVP8OVAp)各自合成以下Hib PS缀合物疫苗：Hib-P2CoreVp8、Hib-P2CoreVP8P2、Hib-P30CoreVP8、Hib-OVApCoreVP8、Hib-P30CoreVP8P2和13Pn-P2P30CoreVP8OVAp。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备Hib PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

3. 4价Men PS-CoreVP8蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白(包括P2CoreVp8、P2CoreVP8P2、P30CoreVP8、OVApCoreVP8、P30CoreVP8P2和P2P30CoreVP8OVAp)各自合成以下4价Men PS缀合物疫苗：4Men-P2CoreVp8、4Men-P2CoreVP8P2、4Men-P30CoreVP8、4Men-OVApCoreVP8、4Men-P30CoreVP8P2和4Men-P2P30CoreVP8OVAp。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备4价Men PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

V.多糖-CoreVP8缀合物疫苗的免疫原性评估

1. 13价Pn PS-CoreVP8缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“13价Pn PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法测定抗PS IgG抗体的滴度，结果示于下表9中。表9仅列出三次注射后的抗PS IgG的滴度。

表9.三次注射13价Pn PS-CoreVP8缀合物疫苗后小鼠血清中的抗PSIgG滴度

表9中的数据表明，与包含不具有通用表位的CoreVP8载体蛋白的13价Pn PS-CoreVP8缀合物相比，包含具有通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn PS-CoreVP8缀合物的免疫原性显著增强。与包含具有通用表位的仅一个拷贝的CoreVP8嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物相比，包含具有同一通用表位的两个拷贝的CoreVP8嵌合载体蛋白的13价Pn PS缀合物具有更高的免疫原性。具有至少两种不同类型的通用表位的嵌合载体蛋白进一步增强了相应的13价Pn PS-CoreVP8缀合物的免疫原性。

2.Hib PS-CoreVP8缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“Hib PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法来通过ELISA测定法测定抗PS IgG抗体的滴度。结果示于下表10中。

表10.小鼠血清中响应于Hib PS-CoreVP8缀合物疫苗的抗PS IgG滴度

上述抗Hib PS抗体的滴度显示了不同类型的Hib PS-CoreVP8嵌合蛋白缀合物的类似结果。与不具有通用表位的Hib PS-CoreVP8蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的其他六种缀合物(即Hib-P2CoreVP8、Hib-P2CoreVP8P2、Hib-P30CoreVP8、Hib-OVApCoreVP8、Hib-P30CoreVP8P2和Hib-P2P30CoreVP8OVAp)具有显著增强的IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p<0.05。

3. 4价Men PS-CoreVP8缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“13价Pn PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法获得血清样品。以10μg/小鼠/时间的多糖注射剂量为每只小鼠注射0.1mL疫苗溶液。使用ELISA测定法测定针对每个多糖群组的抗体的血清滴度。结果示于下表11中。

表11.小鼠血清中抗Men PS抗体的滴度

上述抗Men PS抗体的滴度表现出与13价Pn PS缀合物和Hib PS缀合物类似的结果。与不具有通用表位的4价Men PS-CoreVP8蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的CoreVP8嵌合载体蛋白的缀合物具有显著更高的特异性抗PS IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p＜0.05。

实例3：包含具有白喉H21G蛋白A链(下文称为H21G)和通用表位的嵌合载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物的制备和免疫原性评估

I.H21G和包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的序列设计

1.H21G的序列设计

H21G载体蛋白是基于白喉毒素A链的重组蛋白，其中白喉毒素A链的组氨酸(H)21被甘氨酸(G)置换。与白喉毒素突变体CRM197类似，经修饰的白喉毒素突变体A链保留了白喉毒素的特异性免疫原性。抗H21G血清与白喉毒素或类毒素交叉反应。由于H21G与白喉毒素类似，从安全角度来看，H21G可以充当用于合成缀合物疫苗的合适载体蛋白。白喉毒素突变体H21G的氨基酸序列如以下SEQ ID NO：6所示。

(SEQ ID NO：6)GADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2.包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的序列设计

将通用表位融合至H21G免疫原性载体蛋白，以构建用于制备多糖-蛋白质缀合物的新嵌合载体蛋白。将通用表位可融合至H21G蛋白的N端或C端。或者，可分别将两种不同的通用表位各自融合至H21G蛋白的N端或C端。在第三种策略中，可将同一通用表位的两个拷贝彼此融合，然后融合至H21G蛋白的N端或C端。

由于包含具有通用表位的嵌合载体蛋白的多糖-蛋白质缀合物具有类似机制，因此本公开描述了包含通用表位的6种代表性CoreVP8嵌合载体蛋白。应当理解，本发明不限于本文所述的实例。

2-1包含P30和H21G的嵌合载体蛋白的序列设计

2-1-1 P30-N端-H21G嵌合载体蛋白(P30H21G)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P30H2 1G的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：5 1示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：51)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-1-2 P30-N端-H21G-C端-P30嵌合载体蛋白(P2CoreVP8P2)的序列设计

分别将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的N端和C端各自经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ IDNO：7)融合，以获得名为P30H21GP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：52示出。P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：5 2)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

2-2包含P3和H21G的嵌合载体蛋白的序列设计

2-2-1 P2-N端-H21G嵌合载体蛋白(P2H21G)的序列设计

将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQID NO：6)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为P2H21G的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：53示出。P2表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：5 3)QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-3包含OVAp和H21G的嵌合载体蛋白的序列设计

2-3-1 OVAp-N端-H21G嵌合载体蛋白(OVApH21G)的序列设计

将氨基酸序列OVAp(SEQ ID NO：3)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合以获得名为OVApCoreVP8的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：54示出。OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：54)ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

2-4包含至少两种不同类型的通用表位的嵌合载体蛋白的序列设计

2-4-1 P30-N端-H21G-C端-P2嵌合载体蛋白(P30H21GP2)的序列设计

将P30的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，并且将P2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P30H21GP2的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：55示出。P2表位和P30表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：55)FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

2-4-2 P2OVAp-N端-H21G-C端-P30嵌合载体蛋白(P2OVApH21GP30)的序列设计

将氨基酸序列P2(SEQ ID NO：1)的一个拷贝和氨基酸序列OVAp(SEQ ID NO：3)的一个拷贝经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)彼此融合，将融合的序列随后与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的N端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合；另外，将氨基酸序列P30(SEQ ID NO：2)的一个拷贝与H21G载体蛋白(SEQ ID NO：6)的C端经由设置在其间的GSGSG接头(SEQ ID NO：7)融合，以获得名为P2OVApH21GP30的新嵌合载体蛋白。新嵌合载体蛋白的氨基酸序列如下以SEQ ID NO：56示出。P2、P30和OVAp表位的序列以下划线标出。

(SEQ ID NO：56)QYIKANSKFIGITELGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYGGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE

II.包含H21G载体蛋白和一个或多个通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒的构建

1.H21G载体蛋白的表达质粒的构建

全长白喉毒素的氨基酸序列(参考序列：NP_928615)由GenBank获得，并且对白喉毒素A链片段的序列进行测定。该序列的组氨酸21被甘氨酸置换。基于经修饰的序列，将编码H21G氨基酸序列的核酸序列进行优化，以使得能够在大肠杆菌中高效表达H21G蛋白。使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析H21G的核酸序列，在H21G序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码H21G蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO：57所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码H21G载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2.包含H21G和通用表位的嵌合载体蛋白的表达质粒的构建

2-1.用于P30H21G的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30H21G的核酸序列，在P30H21G序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30H21G蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:58所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30H21G载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-2.用于P30H21GP30的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30H21GP30的核酸序列，在P30H21GP30序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30H21GP30蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:59所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30H21GP30载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-3.用于P2H21G的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2H21G的核酸序列，在P2H21G序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2H21G蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:60所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2H21G载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-4.用于OVApH21G的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析OVApH21G的核酸序列，在OVApH21G序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码OVApH21G蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:61所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码OVApH21G载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-5.用于P30H21GP2的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P30H21GP2的核酸序列，在P30H21GP2序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P30H21GP2蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:62所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P30H21GP2载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

2-6.用于P2OVApH21GP30的表达质粒的构建

使用定制的表达质粒。使用限制性酶Nde I来识别具有CATATG序列的位点，并且使用限制性酶Bam HI来识别具有GGATCC序列的位点。分析P2OVApH21GP30的核酸序列，在P2OVApH21GP30序列中没有发现Nde I或Bam HI识别位点。编码P2OVApH21GP30蛋白的合成核酸序列如以下SEQ ID NO:63所示。

将酶NdeI和BamHI各自添加至空质粒和编码P2OVApH21GP30载体蛋白的合成基因的PCR产物中，以进行双酶限制性消化。纯化后，将T4连接酶加入到连接混合物中以连接片段。连接反应完成后，将表达质粒纯化并使用PCR验证方法和限制性消化作图进行验证。使用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化到细胞中，并筛选菌落。获得经工程改造的表达细菌的阳性克隆后，建立了原液文库，所述原液文库包括主原液和工作原液。将所述原液文库保存在-20℃的冰箱中。

III.CoreVP8载体蛋白和包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的制备

实验已经证明了H21G载体蛋白和包含H21G载体蛋白和通用表位的嵌合载体蛋白的相似性质。因此，本文所述的所有载体蛋白的纯化方法是相似的。下面描述了用于制备包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的示例性方法。

1.表达包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的工程化细菌的制备

使用标准分子生物学方法将用于表达嵌合载体蛋白的每个质粒转化到感受态细胞中，并检查蛋白质表达。选择具有高蛋白表达水平并通过了抗血清测试的克隆来建立主原液文库和工作原液文库。

2.表达包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的工程化细菌的发酵

参见“表达包含通用表位的CRM197A嵌合载体蛋白的工程化细菌的发酵”部分中所述的方法。

3.包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的纯化

因为H21G用作构建具有通用表位的不同嵌合载体蛋白的核心组分，所以实验显示，虽然添加了通用表位，但是蛋白质纯化的参数未受到显著影响。可以改进H21G载体蛋白的纯化工序，以建立用于包含通用表位的H21G嵌合载体蛋白的纯化方法。

将50g湿细菌称入2L离心杯中。向该杯中加入300mL的1X PBS pH 7.0缓冲液以重悬细菌。将细菌悬浮液在磁力搅拌盘上充分混合30分钟，然后在4℃、4000rpm下离心20分钟。弃去上清液并收集细菌。重复这些步骤两次。向含有细菌的离心管中加入300mL的1X PBS pH 7.0。将细菌在匀化器中裂解，并在4℃、10000rpm下离心20分钟。收集沉淀物并弃去上清液。向沉淀物中加入300mL的1X PBS pH 7.0缓冲液，并将混合物在磁力搅拌盘上充分混合30分钟。将混合物在4℃、4000rpm下离心20分钟。收集包涵体，并弃去上清液。向经洗涤的包涵体添加900mL变性溶液。然后将混合物在25℃、10000rpm下离心30分钟。收集上清液，并弃去沉淀物。将上清液转移到6-8KDA透析袋中。将透析袋密封并置于10L重新折叠缓冲液1中，并使其在室温下在磁力搅拌盘上平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液2中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L透析缓冲液3中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液4中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将透析袋转移到10L重新折叠缓冲液5中，并搅拌以在室温下平衡过夜。第二天，将透析袋转移到2L储存缓冲液中，并搅拌以在室温下平衡约8-10小时。将储存缓冲液更换两次，并在室温下进行透析过夜。获得1mL透析溶液，并在室温和12000rpm下离心10分钟。收集上清液，并测量蛋白质浓度。将蛋白质样品上样到预平衡的DEAE凝胶柱上，并以梯度模式洗脱以收集目标蛋白质峰。然后，将收集的样品加载到苯基琼脂糖柱上以进一步纯化，并收集洗脱的峰。最后，将收集的样品加载到Q琼脂糖柱上，并收集洗脱的峰。将收集的经纯化目标蛋白质转移至透析袋，并用0.15M NaCl缓冲液透析。将经透析的样品转移至4℃进行保存。

IV.多糖-H21G缀合物的制备

使用三种不同的合成方法，即还原胺化、CDAP方法(使用3-(乙基亚氨基亚甲基氨基)-N,N-二甲基-丙-1-胺)和ADH方法(使用己二酸二酰肼)来合成特异性多糖-H21G缀合物。用不同合成方法形成的缀合物的收率和免疫原性质可为不同的。为了研究具有通用表位的不同嵌合载体蛋白对不同细菌多糖(PS)缀合物的免疫原性的影响，本公开描述了13价肺炎链球菌(Pn)PS-H21G缀合物、b型流感嗜血杆菌(Hib)PS-H21G缀合物和4价脑膜炎奈瑟氏菌(Men)PS-H21G缀合物。

1. 13价Pn PS-H21G蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的H21G嵌合载体蛋白(包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2和P2OVApH21GP30)各自合成以下13价Pn PS缀合物疫苗：13Pn-P30H21G、13Pn-P30H21GP30、13Pn-P2H21G、13Pn-OVApH21G、13Pn-P30H21GP2和13Pn-P2OVApH21GP30。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备13价Pn PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

2.Hib PS-H21G蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的H21B嵌合载体蛋白(包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2和P2OVApH21GP30)各自合成以下Hib PS缀合物疫苗：Hib-P30H21G、Hib-P30H21GP30、Hib-P2H21G、Hib-OVApH21G、Hib-P30H21GP2和Hib-P2OVApH21GP30。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备Hib PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

3. 4价Men PS-H21G蛋白(具有或不具有通用表位)缀合物的制备

使用6种具有通用表位的H21G嵌合载体蛋白(包括P30H21G、P30H21GP30、P2H21G、OVApH21G、P30H21GP2和P2OVApH21GP30)各自合成以下4价Men PS缀合物疫苗：4Men-P30H21G、4Men-P30H21GP30、4Men-P2H21G、4Men-OVApH21G、4Men-P30H21GP2和4Men-P2OVApH21GP30。用于制备这些缀合物的方法类似于上述用于制备4价Men PS-CRM197A缀合物疫苗的方法。

V.多糖-H21G缀合物疫苗的免疫原性评估

1. 13价Pn PS-H21G缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“13价Pn PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法测定抗PS IgG抗体的滴度，结果示于下表12中。表12仅列出三次注射后的抗PS IgG的滴度。使用制备的13价Pn PS-H21G缀合物疫苗来使小鼠免疫，并从小鼠获得血清样品。为每只小鼠注射0.1mL疫苗溶液，多糖剂量为10μg/小鼠/时间。

表12.三次注射13价Pn PS-H21G缀合物疫苗后小鼠血清中的抗PSIgG滴度

来自表12的数据显示，与包含不具有通用表位的CoreVP8载体蛋白的13价Pn PS-H21G缀合物相比，包含具有通用表位的嵌合载体蛋白的13价Pn PS-H21G缀合物的免疫原性显著增强。

2.Hib PS-H21G缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“Hib PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法来通过ELISA测定法测定抗PS IgG抗体的滴度。结果示于下表13中。

表13.小鼠血清中响应于Hib PS-H21G缀合物疫苗的抗PS IgG滴度。

上述抗Hib PS抗体的滴度显示了不同类型的Hib PS-H21G嵌合蛋白缀合物的类似结果。与不具有通用表位的Hib PS-H21G蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的H21G嵌合载体蛋白的其他六种缀合物(即Hib-P30H21G、Hib-P30H21GP30、Hib-P2H21G、Hib-OVApH21G、Hib-P30H21GP2和Hib-P2OVApH21GP30)具有显著增强的IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p<0.05。

3. 4价Men PS-H21G缀合物疫苗的免疫原性评估

使用与先前“13价Pn PS-P2CRM197A缀合物疫苗的免疫原性评估”部分中所述的那些方法类似的方法获得血清样品。以10μg/小鼠/时间的多糖注射剂量为每只小鼠注射0.1mL疫苗溶液。使用ELISA测定法测定针对每个多糖群组的抗体的血清滴度。结果示于下表14中。

表14.小鼠血清中抗Men PS抗体的滴度

上述抗Men PS抗体的滴度表现出与13价Pn PS缀合物和Hib PS缀合物类似的结果。与不具有通用表位的4价Men PS-H21G蛋白缀合物相比，包含具有通用表位的H21G嵌合载体蛋白的缀合物具有显著更高的特异性抗PS IgG滴度。三次注射后血清样品的IgG滴度与一次注射后血清样品的IgG滴度相比也显著不同，其中p<0.05。

序列表

<110>康泰生物制药公司(KANVAX BIOPHARMACEUTICALS LTD.)

<120>用于增强多糖

-蛋白质缀合物的免疫原性的组合物和方法

<130> 750342000140

<140> Not Yet Assigned

<141>未与本发明同时转让

<150> CN2014101985335

<151> 2014-05-11

<160> 67

<170>用于Windows的FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>破伤风类毒素P2表位

<400> 1

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>破伤风类毒素P30表位

<400> 2

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu

20

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>破伤风类毒素OVAp表位

<400> 3

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 4

<211> 193

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>白喉毒素CRM197A

<400> 4

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg

<210> 5

<211> 160

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>轮状病毒CoreVP8

<400> 5

Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr

1 5 10 15

Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr

20 25 30

Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val

35 40 45

Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu

50 55 60

Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile

65 70 75 80

Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr

85 90 95

Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp

100 105 110

Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile

115 120 125

Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile

130 135 140

Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu

145 150 155 160

<210> 6

<211> 193

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>白喉毒素H21G

<400> 6

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr Gly Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>接头

<400> 7

Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 8

<211> 213

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2CRM197A

<400> 8

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

20 25 30

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

35 40 45

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

50 55 60

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

85 90 95

Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

100 105 110

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

115 120 125

Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

130 135 140

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

145 150 155 160

Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Asn Arg Val Arg Arg

210

<210> 9

<211> 214

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> CRM197AP2

<400> 9

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1 5 10 15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

20 25 30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

35 40 45

Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65 70 75 80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

85 90 95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

115 120 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145 150 155 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

165 170 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

180 185 190

Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe

195 200 205

Ile Gly Ile Thr Glu Leu

210

<210> 10

<211> 233

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2CRM197AP2

<400> 10

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

20 25 30

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

35 40 45

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

50 55 60

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

85 90 95

Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

100 105 110

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

115 120 125

Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

130 135 140

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

145 150 155 160

Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn

210 215 220

Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

225 230

<210> 11

<211> 233

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2P2CRM197A

<400> 11

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

20 25 30

Thr Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys

50 55 60

Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser

65 70 75 80

Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr

85 90 95

Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro

100 105 110

Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu

115 120 125

Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys

130 135 140

Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr

145 150 155 160

Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu

165 170 175

Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn

180 185 190

Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu

195 200 205

Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln

210 215 220

Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

225 230

<210> 12

<211> 233

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> CRM197AP2P2

<400> 12

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile

195 200 205

Gly Ile Thr Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn

210 215 220

Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

225 230

<210> 13

<211> 253

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2P2CRM197AP2

<400> 13

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

20 25 30

Thr Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys

50 55 60

Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser

65 70 75 80

Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr

85 90 95

Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro

100 105 110

Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu

115 120 125

Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys

130 135 140

Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr

145 150 155 160

Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu

165 170 175

Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn

180 185 190

Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu

195 200 205

Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln

210 215 220

Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr

225 230 235 240

Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

245 250

<210> 14

<211> 253

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2CRM197AP2P2

<400> 14

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

20 25 30

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

35 40 45

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

50 55 60

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

85 90 95

Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

100 105 110

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

115 120 125

Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

130 135 140

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

145 150 155 160

Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn

210 215 220

Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr

225 230 235 240

Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

245 250

<210> 15

<211> 219

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P30CRM197A

<400> 15

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly

35 40 45

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

85 90 95

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

145 150 155 160

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

210 215

<210> 16

<211> 220

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> CRM197AP30

<400> 16

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1 5 10 15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

20 25 30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

35 40 45

Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65 70 75 80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

85 90 95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

115 120 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145 150 155 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

165 170 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

180 185 190

Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp

195 200 205

Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu

210 215 220

<210> 17

<211> 245

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P30CRM197AP30

<400> 17

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly

35 40 45

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

85 90 95

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

145 150 155 160

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Glu

245

<210> 18

<211> 245

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P30P30CRM197A

<400> 18

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val

20 25 30

Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

50 55 60

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

65 70 75 80

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

85 90 95

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

100 105 110

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

115 120 125

Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

130 135 140

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

145 150 155 160

Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

165 170 175

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

180 185 190

Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

195 200 205

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

210 215 220

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

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Asn Arg Val Arg Arg

245

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<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> CRM197AP30P30

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Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

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Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

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Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

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Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

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Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu

195 200 205

Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Glu

245

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<213>人工序列

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Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val

20 25 30

Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly

35 40 45

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

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Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

100 105 110

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

115 120 125

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Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

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Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

165 170 175

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

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Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

195 200 205

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

210 215 220

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225 230 235 240

Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val

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Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly

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Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

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65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

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Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

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Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

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Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

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Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val

245 250 255

Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu

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<213>人工序列

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<223> OVApCRM197A

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Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys

20 25 30

Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly

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Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr

50 55 60

Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn

65 70 75 80

Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser

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Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys

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Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu

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Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu

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Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu

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Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys

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Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

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<223> CRM197AOVAp

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Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

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Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

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Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

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Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

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Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

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Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

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Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

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Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

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Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

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Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His

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Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys

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Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr

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Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys

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Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu

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Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu

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Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu

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Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu

165 170 175

Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg

180 185 190

Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys

195 200 205

Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala

210 215 220

Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg

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Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr

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Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu

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Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu

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Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu

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Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu

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Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

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Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

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Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala

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Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala

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Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala

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Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp

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Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr

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Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu

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Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser

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Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly

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Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

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Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys

20 25 30

Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly

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Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr

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Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu

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Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu

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Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu

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Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg

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Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys

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Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala

210 215 220

Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Gly Ser Gly

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Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu

245 250 255

Ala Gly Arg

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<212> PRT

<213>人工序列

<220>

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<400> 29

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

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Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

20 25 30

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

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Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

50 55 60

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

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Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

100 105 110

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

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Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

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Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

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Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val

210 215 220

Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu

225 230 235

<210> 30

<211> 239

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P30CRM197AP2

<400> 30

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

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Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly

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Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

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Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr

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Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

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Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

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Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

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Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

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Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

225 230 235

<210> 31

<211> 259

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P30CRM197AP2

<400> 31

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

20 25 30

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala

35 40 45

Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser

50 55 60

Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly

65 70 75 80

Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp

85 90 95

Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser

100 105 110

Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys

115 120 125

Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn

130 135 140

Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu

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Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly

165 170 175

Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser

180 185 190

Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu

195 200 205

Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met

210 215 220

Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile

245 250 255

Thr Glu Leu

<210> 32

<211> 261

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223> P2P30CRM197AOVAp

<400> 32

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

20 25 30

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala

35 40 45

Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser

50 55 60

Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly

65 70 75 80

Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp

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100 105 110

Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys

115 120 125

Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn

130 135 140

Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu

145 150 155 160

Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly

165 170 175

Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser

180 185 190

Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu

195 200 205

Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met

210 215 220

Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly

225 230 235 240

Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile

245 250 255

Asn Glu Ala Gly Arg

260

<210> 33

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CRM197A

<400> 33

catatgggtg cggacgacgt tgtggactcc tcaaaatcgt ttgtcatgga aaacttcagc 60

tcttatcatg gcaccaaacc gggttacgtg gactccattc agaagggcat ccaaaaaccg 120

aagtcaggca cccagggtaa ctacgatgac gattggaagg aattctacag cacggacaat 180

aagtatgatg cggccggcta ctctgttgac aacgaaaatc cgctgagtgg taaagcaggc 240

ggtgtggtta aggtcaccta tccgggtctg acgaaagttc tggcgctgaa ggtcgataac 300

gccgaaacca ttaaaaagga actgggcctg tctctgaccg aaccgctgat ggaacaagtg 360

ggtacggaag aatttatcaa acgtttcggc gatggtgcat cgcgtgtcgt gctgagcctg 420

ccgtttgctg aaggcagttc ctcagtggaa tacattaaca attgggaaca agcaaaagct 480

ctgtcagttg aactggaaat caatttcgaa acgcgtggca aacgcggtca agatgctatg 540

tatgaatata tggctcaggc gtgtgcgggc aatcgcgtcc gtcgctaagg atcc 594

<210> 34

<211> 652

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2CRM197A

<400> 34

catatgcaat acatcaaggc gaacagcaaa ttcatcggca tcacggaact gggctcgggc 60

tctggcgtgc ggacgacgtt gtggactcct caaaatcgtt tgtcatggaa aacttcagct 120

cttatatggc accaaaccgg gttacgtgga ctccattcag aagggcatcc aaaaaccgaa 180

gtcaggcacc cagggtaact acgatgacga ttggaaggaa ttctacagca cggacaataa 240

gtatgatgcg gccggctact ctgttgacaa cgaaaatccg ctgagtggta aagcaggcgg 300

tgtggttaag gtcacctatc cgggtctgac gaaagttctg gcgctgaagg tcgataacgc 360

cgaaaccatt aaaaaggaac tgggcctgtc tctgaccgaa ccgctgatgg aacaagtggg 420

tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga tggtgcatcg cgtgtcgtgc tgagcctgcc 480

gtttgctgaa ggcagttcct cagtggaata cattaacaat tgggaacaag caaaagctct 540

gtcagttgaa ctggaaatca atttcgaaac gcgtggcaaa cgcggtcaag atgctatgta 600

tgaatatatg gctcaggcgt gtgcgggcaa tcgcgtccgt cgctaaggat cc 652

<210> 35

<211> 712

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2CRM197AP2

<400> 35

catatgcaat acatcaaggc gaacagcaaa ttcatcggca tcacggaact gggctcgggc 60

tctggcgtgc ggacgacgtt gtggactcct caaaatcgtt tgtcatggaa aacttcagct 120

cttatatggc accaaaccgg gttacgtgga ctccattcag aagggcatcc aaaaaccgaa 180

gtcaggcacc cagggtaact acgatgacga ttggaaggaa ttctacagca cggacaataa 240

gtatgatgcg gccggctact ctgttgacaa cgaaaatccg ctgagtggta aagcaggcgg 300

tgtggttaag gtcacctatc cgggtctgac gaaagttctg gcgctgaagg tcgataacgc 360

cgaaaccatt aaaaaggaac tgggcctgtc tctgaccgaa ccgctgatgg aacaagtggg 420

tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga tggtgcatcg cgtgtcgtgc tgagcctgcc 480

gtttgctgaa ggcagttcct cagtggaata cattaacaat tgggaacaag caaaagctct 540

gtcagttgaa ctggaaatca atttcgaaac gcgtggcaaa cgcggtcaag atgctatgta 600

tgaatatatg gctcaggcgt gtgcgggcaa tcgcgtccgt cgctaaggct cgggctctgg 660

ccaatacatc aaggcgaaca gcaaattcat cggcatcacg gaactgggat cc 712

<210> 36

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CRM197A

<400> 36

catatgttca ataattttac ggtgtcgttt tggctgcgtg tcccgaaagt ctctgcgagt 60

catctggaag gttctggtag cggtggtgcg gatgacgtgg ttgatagctc taaatctttc 120

gttatggaaa acttcagttc ctatcatggc accaaaccgg gttacgtcga ttcgattcag 180

aaaggcatcc aaaaaccgaa aagcggcacc cagggtaact acgatgacga ttggaaagaa 240

ttctactcaa cggacaacaa atacgatgcg gccggctact ccgtggacaa cgaaaatccg 300

ctgagcggta aagcgggcgg tgtcgtgaaa gttacctatc cgggtctgac gaaagtgctg 360

gctctgaaag ttgataatgc ggaaaccatc aaaaaagaac tgggcctgtc cctgaccgaa 420

ccgctgatgg aacaagtggg tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga cggtgcctct 480

cgcgttgtcc tgagtctgcc gtttgcagaa ggctcatcga gcgtcgaata cattaacaat 540

tgggaacaag caaaagctct gagcgtggaa ctggaaatca acttcgaaac gcgtggcaaa 600

cgcggtcagg atgcgatgta tgaatacatg gcgcaagcct gcgcaggtaa tcgtgttcgt 660

cgcggatcc 669

<210> 37

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OVApCRM197A

<400> 37

catatgatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 60

agcggttctg gcggtgcaga cgatgttgtt gactccagca aatcattcgt catggaaaac 120

tttagctctt atcatggcac caaaccgggt tacgtggact ccattcagaa aggcatccaa 180

aaaccgaaat caggcaccca gggtaactat gatgacgatt ggaaagaatt ctactctacg 240

gacaacaaat acgatgcggc cggctactct gttgacaacg aaaatccgct gagtggtaaa 300

gcaggcggtg tggttaaagt cacctatccg ggtctgacga aagttctggc gctgaaagtc 360

gataacgccg aaaccatcaa aaaagaactg ggcctgtcgc tgaccgaacc gctgatggaa 420

caagtgggta cggaagaatt tatcaaacgt ttcggcgatg gtgcatcgcg tgtcgtgctg 480

agcctgccgt ttgctgaagg cagttcctca gtggaataca ttaacaattg ggaacaagca 540

aaagctctga gtgttgaact ggaaatcaat ttcgaaacgc gtggtaaacg cggtcaggac 600

gcaatgtatg aatatatggc ccaggcttgt gcaggcaacc gtgttcgccg ttaaggatcc 660

<210> 38

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CRM197AP2

<400> 38

catatgttca acaattttac ggtctcgttt tggctgcgtg tcccgaaagt gtctgcctca 60

catctggaag gtagcggttc aggtggtgcg gatgacgtgg ttgatagctc taaatccttt 120

gttatggaaa acttcagttc ctatcatggt accaaaccgg gctacgtcga ttctattcag 180

aaaggtatcc aaaaaccgaa aagtggtacc cagggcaact atgatgacga ttggaaagaa 240

ttctactcta cggacaacaa atacgatgcg gccggttact cggtggacaa cgaaaatccg 300

ctgagcggta aagccggcgg tgtcgtgaaa gttacctatc cgggcctgac gaaagtgctg 360

gctctgaaag ttgataacgc ggaaaccatc aaaaaagaac tgggtctgag cctgaccgaa 420

ccgctgatgg aacaagtggg cacggaagaa tttatcaaac gtttcggtga cggtgcatcc 480

cgtgttgtcc tgtcactgcc gtttgcagaa ggttcatcga gcgtcgaata catcaacaac 540

tgggaacaag caaaagctct gagcgtggaa ctggaaatca atttcgaaac ccgtggtaaa 600

cgcggccagg atgctatgta tgaatacatg gcgcaagcct gcgcaggtaa ccgtgttcgt 660

cgcggctctg gtagtggcca gtacatcaaa gcgaacagta aattcatcgg catcacggaa 720

ctgggatcc 729

<210> 39

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2CoreVP8

<400> 39

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu

20 25 30

Pro Val Asp Tyr Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val

35 40 45

Ala Glu Gly Thr Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val

50 55 60

Glu Pro Asn Val Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg

65 70 75 80

Asn Val Gln Leu Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe

85 90 95

Ile Leu Phe Ile Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser

100 105 110

Thr Leu Ser Thr Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn

115 120 125

Arg Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr

130 135 140

Tyr Leu Thr Ile Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu

145 150 155 160

Phe Tyr Leu Ile Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Gly Leu

180

<210> 40

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2CoreVP8P2

<400> 40

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu

20 25 30

Pro Val Asp Tyr Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val

35 40 45

Ala Glu Gly Thr Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val

50 55 60

Glu Pro Asn Val Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg

65 70 75 80

Asn Val Gln Leu Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe

85 90 95

Ile Leu Phe Ile Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser

100 105 110

Thr Leu Ser Thr Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn

115 120 125

Arg Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr

130 135 140

Tyr Leu Thr Ile Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu

145 150 155 160

Phe Tyr Leu Ile Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Gly Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser

180 185 190

Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

195 200

<210> 41

<211> 186

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CoreVP8

<400> 41

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gly Pro Tyr Gln

20 25 30

Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr Trp Met Leu Ile Ala Pro

35 40 45

Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr Asn Thr Thr Asp Arg Trp

50 55 60

Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val Gln Asn Thr Gln Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu Asn Val Ser Asn Glu Ser

85 90 95

Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile Lys Leu Thr Pro Asp Gly

100 105 110

Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr Pro His Lys Leu Cys Ala

115 120 125

Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Ala Thr Pro

130 135 140

Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Asn Asn Asp Asn Ser Asn

145 150 155 160

Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile Pro Gln Ser Gln Thr Ala

165 170 175

Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu

180 185

<210> 42

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OVApCoreVP8

<400> 42

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu

20 25 30

Asn Leu Pro Val Asp Tyr Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly

35 40 45

Lys Val Ala Glu Gly Thr Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val

50 55 60

Leu Val Glu Pro Asn Val Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp

65 70 75 80

Gly Arg Asn Val Gln Leu Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp

85 90 95

Lys Phe Ile Leu Phe Ile Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln

100 105 110

Tyr Ser Thr Leu Ser Thr Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg

115 120 125

Asp Asn Arg Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu

130 135 140

Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp

145 150 155 160

Ala Glu Phe Tyr Leu Ile Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln

165 170 175

Tyr Ile Asn Asn Gly Leu

180

<210> 43

<211> 206

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CoreVP8P2

<400> 43

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gly Pro Tyr Gln

20 25 30

Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr Trp Met Leu Ile Ala Pro

35 40 45

Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr Asn Thr Thr Asp Arg Trp

50 55 60

Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val Gln Asn Thr Gln Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu Asn Val Ser Asn Glu Ser

85 90 95

Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile Lys Leu Thr Pro Asp Gly

100 105 110

Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr Pro His Lys Leu Cys Ala

115 120 125

Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Ala Thr Pro

130 135 140

Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Asn Asn Asp Asn Ser Asn

145 150 155 160

Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile Pro Gln Ser Gln Thr Ala

165 170 175

Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Gly Ser Gly Ser Gly Gln

180 185 190

Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

195 200 205

<210> 44

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2P30CoreVP8OVAp

<400> 44

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

20 25 30

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp

35 40 45

Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr Trp Met

50 55 60

Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr Asn Thr

65 70 75 80

Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val Gln Asn

85 90 95

Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu Asn Val

100 105 110

Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile Lys Leu

115 120 125

Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr Pro His

130 135 140

Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp Tyr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Asn Asn

165 170 175

Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile Pro Gln

180 185 190

Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

210 215 220

Glu Ala Gly Arg

225

<210> 45

<211> 514

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CoreVP8

<400> 45

catatgtgga tggtccgtat caaccgacga cgtttacccc gccgaacgat tattggattc 60

tgatcaactc aaatacgaac ggcgtggttt acgaaagtac caacaattcc gatttctgga 120

cggcggtcgt ggccatcgaa ccgcatgtta atccggcgac cgccagtata ccatttttgg 180

tgaaatgcaa acaattcaat gtcagcaacg actctaataa atggaagttt ctggaaatgt 240

tccgtagctc tagtcagaac gaattttata atcgtcgcac cctgacgtct gatacccgtc 300

tggtgggcat cctgaagtac ggcggtcgcg tttggacctt ccatggtgaa acgccgcgtg 360

caaccacgga ctcctcatcg accgcgaacc tgaacaatat ttcaatcacg attcaccacg 420

attcaccacg attcactcgg aattttacat catcccgcgt agccaggaaa gcaaatgcaa 480

cgaatacatc aataatggtc tgtgataagg atcc 514

<210> 46

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2CoreVP8

<400> 46

catatgcagt acattaaagc aaactcaaaa ttcattggca ttaccgaact gggctcaggc 60

tcaggttgga tggtccgtat caaccgacga cgtttacccc gccgaacgat tattggattc 120

tgatcactca aatacgaacg gcgtggttta cgaaagtacc aacaattccg atttctggac 180

ggcggtcgtg gccatcgaac cgcatgttaa tccggtcgac cgccagtata ccatttttgg 240

tgaaagcaaa caattcaatg tcagcaacga ctctaataaa tggaagtttc tggaaatgtt 300

ccgtagctct agtcagaacg aattttataa tcgtcgcacc ctgacgtctg atacccgtct 360

ggtgggcatc ctgaagtacg gcggtcgcgt ttggaccttc catggtgaaa cgccgcgtgc 420

aaccacggac tcctcatcga ccgcgaacct gaacaatatt tcaatcacga ttcactcgga 480

attttacatc atcccgcgta gccaggaaag caaatgcaac gaatacatca ataatggtct 540

gtgaggatcc 550

<210> 47

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CoreVP8

<400> 47

catatgttca ataattttac ggtgtcgttt tggctgcgtg tgccgaaagt gtctgcctcc 60

catctggaag gttctggttc aggtctggac ggtccgtatc agccgaccac gtttaccccg 120

ccgaacgatt actggattct gatcaacagc aatacgaacg gcgtggttta tgaatcaacc 180

aacaattcgg atttctggac ggcggtcgtg gccatcgaac cgcatgttaa tccggtcgac 240

cgccagtaca ccatcttcgg tgaatcaaaa caattcaacg tcagcaacga ctctaacaaa 300

tggaaattcc tggaaatgtt ccgtagctct agtcagaacg aattttataa tcgtcgcacc 360

ctgacgtccg atacccgtct ggtgggcatc ctgaaatacg gcggtcgcgt ttggaccttc 420

catggtgaaa cgccgcgtgc aaccacggac tcctcatcga ccgcgaacct gaacaatatt 480

agcatcacga tccactctga attctacatc atcccgcgca gtcaagaatc caaatgcaac 540

gaatacatca acaatggcct gtaaggatcc 570

<210> 48

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OVApCoreVP8

<400> 48

catatgatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 60

agcggttctg gcctggatgg tccgtatcaa ccgacgacgt ttaccccgcc gaacgattat 120

tggattctga tcaactcaaa tacgaacggc gtggtttacg aaagtaccaa caattccgat 180

ttctggacgg cggtcgtggc catcgaaccg catgttaatc cggtcgaccg ccagtatacc 240

atttttggtg aaagcaaaca attcaatgtc agcaacgact ctaataaatg gaagtttctg 300

gaaatgttcc gtagctctag tcagaacgaa ttttataatc gtcgcaccct gacgtctgat 360

acccgtctgg tgggcatcct gaagtacggc ggtcgcgttt ggaccttcca tggtgaaacg 420

ccgcgtgcaa ccacggactc ctcatcgacc gcgaacctga acaatatttc aatcacgatt 480

cactcggaat tttacatcat cccgcgtagc caggaaagca aatgcaacga atacatcaat 540

aatggtctgt gataaggatc c 561

<210> 49

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30CoreVP8P2

<400> 49

catatgatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 60

agcggttctg gcctggatgg tccgtatcaa ccgacgacgt ttaccccgcc gaacgattat 120

tggattctga tcaactcaaa tacgaacggc gtggtttacg aaagtaccaa caattccgat 180

ttctggacgg cggtcgtggc catcgaaccg catgttaatc cggtcgaccg ccagtatacc 240

atttttggtg aaagcaaaca attcaatgtc agcaacgact ctaataaatg gaagtttctg 300

gaaatgttcc gtagctctag tcagaacgaa ttttataatc gtcgcaccct gacgtctgat 360

acccgtctgg tgggcatcct gaagtacggc ggtcgcgttt ggaccttcca tggtgaaacg 420

ccgcgtgcaa ccacggactc ctcatcgacc gcgaacctga acaatatttc aatcacgatt 480

cactcggaat tttacatcat cccgcgtagc caggaaagca aatgcaacga atacatcaat 540

aatggtctgt gataaggctc aggctcaggt cagtacatta aagcaaactc aaaattcatt 600

ggcattaccg aactgggatc c 621

<210> 50

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2P30CoreVP8OVAp

<400> 50

catatgcagt acattaaagc aaactcaaaa ttcattggca ttaccgaact gggtagcggt 60

tctggcatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 120

agcggttctg gcctggatgg tccgtatcaa ccgacgacgt ttaccccgcc gaacgattat 180

tggattctga tcaactcaaa tacgaacggc gtggtttacg aaagtaccaa caattccgat 240

ttctggacgg cggtcgtggc catcgaaccg catgttaatc cggtcgaccg ccagtatacc 300

atttttggtg aaagcaaaca attcaatgtc agcaacgact ctaataaatg gaagtttctg 360

gaaatgttcc gtagctctag tcagaacgaa ttttataatc gtcgcaccct gacgtctgat 420

acccgtctgg tgggcatcct gaagtacggc ggtcgcgttt ggaccttcca tggtgaaacg 480

ccgcgtgcaa ccacggactc ctcatcgacc gcgaacctga acaatatttc aatcacgatt 540

cactcggaat tttacatcat cccgcgtagc caggaaagca aatgcaacga atacatcaat 600

aatggtctgt gataaggctc aggctcaggt atcagccaag cggttcacgc agcccacgcc 660

gaaattaacg aagcgggtcg cggatcc 687

<210> 51

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21G

<400> 51

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly

35 40 45

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

85 90 95

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

145 150 155 160

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

210 215

<210> 52

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21GP30

<400> 52

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly

35 40 45

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

85 90 95

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

145 150 155 160

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

225 230 235 240

Ala Ser His Leu Glu

245

<210> 53

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2H21G

<400> 53

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe

20 25 30

Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val

35 40 45

Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly

50 55 60

Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys

85 90 95

Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu

100 105 110

Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu

115 120 125

Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile

130 135 140

Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe

145 150 155 160

Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys

180 185 190

Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Asn Arg Val Arg Arg

210

<210> 54

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> OVApH21G

<400> 54

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys

20 25 30

Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly Thr Lys Pro Gly

35 40 45

Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr

50 55 60

Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn

65 70 75 80

Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser

85 90 95

Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys

100 105 110

Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu

115 120 125

Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu

130 135 140

Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu

145 150 155 160

Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu

165 170 175

Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg

180 185 190

Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys

195 200 205

Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg

210 215

<210> 55

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21GP2

<400> 55

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

1 5 10 15

Ala Ser His Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

20 25 30

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly

35 40 45

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

50 55 60

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

85 90 95

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

115 120 125

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

130 135 140

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

145 150 155 160

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

165 170 175

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

180 185 190

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

195 200 205

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

225 230 235

<210> 56

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2OVApH21GP30

<400> 56

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile

20 25 30

Asn Glu Ala Gly Arg Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Val Val

35 40 45

Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Gly Gly

50 55 60

Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro

65 70 75 80

Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr

85 90 95

Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu

100 105 110

Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro

115 120 125

Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile

130 135 140

Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val

145 150 155 160

Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val

165 170 175

Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile

180 185 190

Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn

195 200 205

Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met

210 215 220

Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Gly Ser Gly Ser Gly

225 230 235 240

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

245 250 255

Ala Ser His Leu Glu

260

<210> 57

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H21G

<400> 57

catatgggtg ccgacgacgt ggttgatagc tctaaatctt tcgttatgga aaacttcagt 60

tcctatggcg gtaccaaacc gggctacgtc gattcgattc agaaaggtat ccaaaaaccg 120

aaaagcggca cccagggtaa ctatgatgac gattggaaag gcttttactc aacggacaat 180

aaatatgatg cggccggcta ctccgtggac aacgaaaatc cgctgagcgg taaagcgggc 240

ggtgtcgtga aagttaccta tccgggtctg acgaaagtgc tggctctgaa agttgataat 300

gcggaaacca tcaaaaaaga actgggcctg tccctgaccg aaccgctgat ggaacaagtg 360

ggtacggaag aatttatcaa acgtttcggc gacggtgcct ctcgcgttgt cctgagtctg 420

ccgtttgcag aaggctcatc gagcgtcgaa tacattaaca attgggaaca agcaaaagct 480

ctgagcgtgg aactggaaat caacttcgaa acgcgtggca aacgcggtca ggatgcgatg 540

tatgaataca tggcgcaagc ctgcgcaggt aatcgtgttc gtcgcggatc c 591

<210> 58

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21G

<400> 58

catatgttca acaattttac ggtgtctttt tggctgcgtg tgccgaaagt gtctgcgagt 60

catctggaag gtagtggttc tggtggtgcc gacgacgtgg ttgatagctc taaatctttc 120

gttatggaaa acttcagttc ctatggcggt accaaaccgg gctacgtcga ttcgattcag 180

aaaggtatcc aaaaaccgaa aagcggcacc cagggtaact atgatgacga ttggaaaggc 240

ttttactcaa cggacaataa atatgatgcg gccggctact ccgtggacaa cgaaaatccg 300

ctgagcggta aagcgggcgg tgtcgtgaaa gttacctatc cgggtctgac gaaagtgctg 360

gctctgaaag ttgataatgc ggaaaccatc aaaaaagaac tgggcctgtc cctgaccgaa 420

ccgctgatgg aacaagtggg tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga cggtgcctct 480

cgcgttgtcc tgagtctgcc gtttgcagaa ggctcatcga gcgtcgaata cattaacaat 540

tgggaacaag caaaagctct gagcgtggaa ctggaaatca acttcgaaac gcgtggcaaa 600

cgcggtcagg atgcgatgta tgaatacatg gcgcaagcct gcgcaggtaa tcgtgttcgt 660

cgctaaggat cc 672

<210> 59

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21GP30

<400> 59

catatgttca acaattttac ggtgtctttt tggctgcgtg tgccgaaagt gtctgcgagt 60

catctggaag gtagtggttc tggtggtgcc gacgacgtgg ttgatagctc taaatctttc 120

gttatggaaa acttcagttc ctatggcggt accaaaccgg gctacgtcga ttcgattcag 180

aaaggtatcc aaaaaccgaa aagcggcacc cagggtaact atgatgacga ttggaaaggc 240

ttttactcaa cggacaataa atatgatgcg gccggctact ccgtggacaa cgaaaatccg 300

ctgagcggta aagcgggcgg tgtcgtgaaa gttacctatc cgggtctgac gaaagtgctg 360

gctctgaaag ttgataatgc ggaaaccatc aaaaaagaac tgggcctgtc cctgaccgaa 420

ccgctgatgg aacaagtggg tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga cggtgcctct 480

cgcgttgtcc tgagtctgcc gtttgcagaa ggctcatcga gcgtcgaata cattaacaat 540

tgggaacaag caaaagctct gagcgtggaa ctggaaatca acttcgaaac gcgtggcaaa 600

cgcggtcagg atgcgatgta tgaatacatg gcgcaagcct gcgcaggtaa tcgtgttcgt 660

cgctaaggta gtggttctgg tttcaacaat tttacggtgt ctttttggct gcgtgtgccg 720

aaagtgtctg cgagtcatct ggaaggatcc 750

<210> 60

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2H21G

<400> 60

catatgcagt acattaaagc aaactcaaaa ttcattggca ttaccgaact gggtagtggt 60

tctggtggtg ccgacgacgt ggttgatagc tctaaatctt tcgttatgga aaacttcagt 120

tcctatggcg gtaccaaacc gggctacgtc gattcgattc agaaaggtat ccaaaaaccg 180

aaaagcggca cccagggtaa ctatgatgac gattggaaag gcttttactc aacggacaat 240

aaatatgatg cggccggcta ctccgtggac aacgaaaatc cgctgagcgg taaagcgggc 300

ggtgtcgtga aagttaccta tccgggtctg acgaaagtgc tggctctgaa agttgataat 360

gcggaaacca tcaaaaaaga actgggcctg tccctgaccg aaccgctgat ggaacaagtg 420

ggtacggaag aatttatcaa acgtttcggc gacggtgcct ctcgcgttgt cctgagtctg 480

ccgtttgcag aaggctcatc gagcgtcgaa tacattaaca attgggaaca agcaaaagct 540

ctgagcgtgg aactggaaat caacttcgaa acgcgtggca aacgcggtca ggatgcgatg 600

tatgaataca tggcgcaagc ctgcgcaggt aatcgtgttc gtcgctaagg atcc 654

<210> 61

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> OVApH21G

<400> 61

catatgatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 60

agcggttctg gcggtgccga cgacgtggtt gatagctcta aatctttcgt tatggaaaac 120

ttcagttcct atggcggtac caaaccgggc tacgtcgatt cgattcagaa aggtatccaa 180

aaaccgaaaa gcggcaccca gggtaactat gatgacgatt ggaaaggctt ttactcaacg 240

gacaataaat atgatgcggc cggctactcc gtggacaacg aaaatccgct gagcggtaaa 300

gcgggcggtg tcgtgaaagt tacctatccg ggtctgacga aagtgctggc tctgaaagtt 360

gataatgcgg aaaccatcaa aaaagaactg ggcctgtccc tgaccgaacc gctgatggaa 420

caagtgggta cggaagaatt tatcaaacgt ttcggcgacg gtgcctctcg cgttgtcctg 480

agtctgccgt ttgcagaagg ctcatcgagc gtcgaataca ttaacaattg ggaacaagca 540

aaagctctga gcgtggaact ggaaatcaac ttcgaaacgc gtggcaaacg cggtcaggat 600

gcgatgtatg aatacatggc gcaagcctgc gcaggtaatc gtgttcgtcg ctaaggatcc 660

<210> 62

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P30H21GP2

<400> 62

catatgttca acaattttac ggtgtctttt tggctgcgtg tgccgaaagt gtctgcgagt 60

catctggaag gtagtggttc tggtggtgcc gacgacgtgg ttgatagctc taaatctttc 120

gttatggaaa acttcagttc ctatggcggt accaaaccgg gctacgtcga ttcgattcag 180

aaaggtatcc aaaaaccgaa aagcggcacc cagggtaact atgatgacga ttggaaaggc 240

ttttactcaa cggacaataa atatgatgcg gccggctact ccgtggacaa cgaaaatccg 300

ctgagcggta aagcgggcgg tgtcgtgaaa gttacctatc cgggtctgac gaaagtgctg 360

gctctgaaag ttgataatgc ggaaaccatc aaaaaagaac tgggcctgtc cctgaccgaa 420

ccgctgatgg aacaagtggg tacggaagaa tttatcaaac gtttcggcga cggtgcctct 480

cgcgttgtcc tgagtctgcc gtttgcagaa ggctcatcga gcgtcgaata cattaacaat 540

tgggaacaag caaaagctct gagcgtggaa ctggaaatca acttcgaaac gcgtggcaaa 600

cgcggtcagg atgcgatgta tgaatacatg gcgcaagcct gcgcaggtaa tcgtgttcgt 660

cgctaaggct caggctcagg tcagtacatt aaagcaaact caaaattcat tggcattacc 720

gaactgggat cc 732

<210> 63

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2OVApH21GP30

<400> 63

catatgcagt acattaaagc aaactcaaaa ttcattggca ttaccgaact gggtagtggt 60

tctggtatca gccaagcggt tcacgcagcc cacgccgaaa ttaacgaagc gggtcgcggt 120

agcggttctg gcggtgccga cgacgtggtt gatagctcta aatctttcgt tatggaaaac 180

ttcagttcct atggcggtac caaaccgggc tacgtcgatt cgattcagaa aggtatccaa 240

aaaccgaaaa gcggcaccca gggtaactat gatgacgatt ggaaaggctt ttactcaacg 300

gacaataaat atgatgcggc cggctactcc gtggacaacg aaaatccgct gagcggtaaa 360

gcgggcggtg tcgtgaaagt tacctatccg ggtctgacga aagtgctggc tctgaaagtt 420

gataatgcgg aaaccatcaa aaaagaactg ggcctgtccc tgaccgaacc gctgatggaa 480

caagtgggta cggaagaatt tatcaaacgt ttcggcgacg gtgcctctcg cgttgtcctg 540

agtctgccgt ttgcagaagg ctcatcgagc gtcgaataca ttaacaattg ggaacaagca 600

aaagctctga gcgtggaact ggaaatcaac ttcgaaacgc gtggcaaacg cggtcaggat 660

gcgatgtatg aatacatggc gcaagcctgc gcaggtaatc gtgttcgtcg ctaaggtagt 720

ggttctggtt tcaacaattt tacggtgtct ttttggctgc gtgtgccgaa agtgtctgcg 780

agtcatctgg aaggatcc 798

<210> 64

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>白喉毒素全长

<400> 64

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr

35 40 45

Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

130 135 140

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser

245 250 255

Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu

260 265 270

Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

290 295 300

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly

325 330 335

Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu

340 345 350

Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala

355 360 365

Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

370 375 380

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His

405 410 415

Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg

420 425 430

Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu

435 440 445

Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

450 455 460

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg

465 470 475 480

Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys

485 490 495

Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu

500 505 510

His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu

515 520 525

Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

530 535 540

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

545 550 555 560

<210> 65

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>分泌的白喉毒素全长

<400> 65

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His

405 410 415

Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val

420 425 430

Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr

435 440 445

His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly

465 470 475 480

Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser

485 490 495

Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu

500 505 510

Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser

515 520 525

Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

<210> 66

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>白喉毒素，链A

<400> 66

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg

<210> 67

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VP8全长

<400> 67

Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Ser Asn Ser Tyr Val Thr

1 5 10 15

Asn Ile Ser Asp Glu Val Asn Glu Ile Gly Thr Lys Lys Thr Thr Asn

20 25 30

Val Thr Val Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val

35 40 45

Asp Trp Gly His Gly Glu Leu Pro Asp Ser Thr Leu Val Gln Pro Thr

50 55 60

Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Ser Leu Asn Leu Pro Val Asp Tyr

65 70 75 80

Trp Met Leu Ile Ala Pro Thr Arg Glu Gly Lys Val Ala Glu Gly Thr

85 90 95

Asn Thr Thr Asp Arg Trp Phe Ala Cys Val Leu Val Glu Pro Asn Val

100 105 110

Gln Asn Thr Gln Arg Gln Tyr Val Leu Asp Gly Arg Asn Val Gln Leu

115 120 125

Asn Val Ser Asn Glu Ser Arg Thr Ser Trp Lys Phe Ile Leu Phe Ile

130 135 140

Lys Leu Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Ser Thr Leu Ser Thr

145 150 155 160

Pro His Lys Leu Cys Ala Trp Met Lys Arg Asp Asn Arg Val Tyr Trp

165 170 175

Tyr Gln Gly Ala Thr Pro Asn Ala Ser Glu Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile

180 185 190

Asn Asn Asp Asn Ser Asn Val Ser Ser Asp Ala Glu Phe Tyr Leu Ile

195 200 205

Pro Gln Ser Gln Thr Ala Met Cys Thr Gln Tyr Ile Asn Asn Gly Leu

210 215 220

Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Ile Val Pro Val Asn Ile Thr Ser

225 230 235 240

Arg Gln Ile Lys Asp Ile Arg

245