适合神经系统疾病的治疗的HGF制剂的制作方法

文档序号：12069662阅读：891来源：国知局

本发明涉及含有肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，以下在本说明书中有时简称为“HGF”)蛋白的制剂。更详细而言，本发明涉及含有HGF蛋白的冷冻干燥制剂、注射液等制剂。另外，本发明还涉及含有HGF蛋白的适合中枢神经系统疾病的治疗的冷冻干燥制剂、注射液等制剂。

背景技术：

HGF是作为对成熟肝细胞具有生长促进活性的生理活性蛋白被发现的(例如参考非专利文献1)。通过之后的研究获知，HGF蛋白不仅作用于肝细胞，还作用于很多上皮系细胞、血管内皮细胞等，参与组织和器官的损伤的修复与再生(参考非专利文献2)。HGF蛋白可利用生物工程的方法以重组蛋白的形式大量生产(例如参考非专利文献3)，重组HGF蛋白不仅作为对肝炎和肝硬化的治疗药应用，而且还可以期待作为对肾病、创伤等的治疗药应用(参考非专利文献2)。

另一方面，通过近年来的包括基因敲除/敲入小鼠的方法在内的基因表达和功能解析中的诸多研究还表明，HGF蛋白还具有促进神经细胞的存活和神经突起的伸长的作用，也是作为神经营养因子的重要因子(参考非专利文献4和5)。

HGF蛋白对海马神经元、多巴胺能神经元、小脑颗粒细胞、感觉神经元和运动神经元等神经细胞显示出神经营养因子活性(参考非专利文献6)。尤其是，HGF蛋白对运动神经元显示出强力的存活促进作用(参考非专利文献7)，其活性可与已知对运动神经元具有最强的存活促进作用的、来自胶质细胞株的神经营养因子(GDNF)的活性相匹敌。

基于这样的神经营养活性，有报道称HGF蛋白可用作针对以肌萎缩侧索硬化(ALS)和脊髄损伤为代表的各种神经系统疾病的治疗药(参考专利文献1～3、非专利文献5、8和9)。

蛋白质药品通常注射到静脉内、皮下或肌肉内。但是，已知通过这些给药途径进行给药的蛋白质由于位于脑组织与血管之间的血脑屏障的存在而极难转移至中枢神经组织中。因此，为了将HGF蛋白用于中枢神经系统疾病的治疗，为了直接将HGF蛋白送达中枢神经组织，认为有效的是鞘内给药或脑室内给药而非为了常规的器官疾病的治疗而进行的静脉内注射、皮下或肌肉内注射这样的给药途径(参考非专利文献8和9)。鞘内给药和脑室内给药是在针对脑肿瘤的抗癌剂治疗中也使用的给药途径。另外，出于治疗中枢神经系统疾病的的目的，也考虑将HGF蛋白直接给药至脑实质内或脊髄实质内。

在HGF蛋白的药品化方面，需要开发稳定化的HGF蛋白制剂。作为HGF蛋白制剂，专利文献4中公开了在HGF蛋白(也称为TCF-II)中含有白蛋白、人血清、明胶、山梨醇、甘露醇和木糖醇等作为稳定剂的水溶液制剂(参考专利文献4)。但是，该HGF水溶液制剂具有在保存中发生HGF蛋白凝集、白浊、凝胶化的难题，并且存在会形成HGF蛋白的聚合物(HGF聚合物)等物理化学稳定性低、生物活性降低的问题。

为了抑制这种聚合物形成，例如，专利文献5中公开了在HGF中含有精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等作为稳定剂的冷冻干燥HGF制剂(参考专利文献5)。另外，专利文献6中公开了在HGF中含有甘氨酸、丙氨酸、山梨醇、甘露醇和硫酸葡聚糖等作为稳定剂的冷冻干燥HGF制剂(参考专利文献6)。此外，专利文献7中公开了在HGF中添加有精制蔗糖和丙氨酸等的冷冻干燥HGF制剂(参考专利文献7)。

由这样的制剂制备的注射液对于为了通常的器官疾病的治疗而进行的静脉内注射、皮下或肌肉内注射而言认为是安全的，但是，例如，在鞘内给药和脑室内给药的情况下，将HGF蛋白直接给药至中枢神经系统，需要充分确认包括制剂中所添加的各种成分在内的制剂成分对中枢神经系统的安全性。在以往公开的HGF制剂中，尚未已知在用于鞘内给药或脑室内给药、或者脊髄实质内给药或脑实质内给药时也确认为安全的制剂。

期望一种能够用于为了治疗中枢神经系统疾病而进行鞘内给药或脑室内给药、或者脊髄实质内给药或脑实质内给药的、安全性高的HGF制剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2002/22162号(对应美国公开号US 2003/0176347)

专利文献2：国际公开第2007/122976号(对应美国专利号US 8575099)

专利文献3：国际公开第2008/105507号(对应美国专利号US 8518880)

专利文献4：国际公开第90/10651号(对应欧洲专利号EP 0462277)

专利文献5：国际公开第00/72873号(对应欧洲专利号EP 1180368)

专利文献6：日本特开平9-25241号公报(对应美国专利号US 7173008)

专利文献7：国际公开第2008/102849号(对应美国专利号US8461112)

非专利文献

非专利文献1：T.Nakamura等、Biochem.Biophys.Res.Commun.,第122卷,第1450页,1984年

非专利文献2：T.Nakamura等、J.Gastroenterol.Hepatol.,第26卷,Suppl.1、第188-202页(2011年)

非专利文献3：Jeong Soo Park等、Protein Expr.Purif.,第70卷,第231-235页(2010年)

非专利文献4：Flavio Maina等、Nat.Neurosci.,第2卷,第213-217页(1999年)

非专利文献5：Funakoshi H等、Current Signal Transduction Therapy第6卷,第156-167页(2011年)

非专利文献6：Honda,S.等、Brain Res.Mol.Brain Res.第32卷,第197-210页(1995年)

非专利文献7：Allen Ebens等、Neuron、第17卷,第1157-1172页(1996年)

非专利文献8：Ishigaki A等、J Neuropathol Exp Neurol.,第66卷,第1037-1044页(2007年)

非专利文献9：Kitamura K等、PLoS One.,第6卷:e27706(2011年)

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供一种能够用于鞘内给药或脑室内给药、或者脊髄实质内给药或脑实质内给药来治疗中枢神经系统疾病的、对中枢神经的安全性高的注射液等HGF制剂。为了能够作为实用的药物使用，HGF制剂通常需要稳定性也优良。另外，本发明的课题还在于提供稳定性优良的注射液、冷冻干燥制剂等HGF制剂。

用于解决问题的手段

本发明人们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，通过在HGF蛋白中添加乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂，可抑制HGF蛋白的聚合物生成，并且发现，含有这些成分的HGF溶液能够作为稳定的HGF注射液使用，以及，通过将该HGF溶液冷冻干燥，能够得到稳定的HGF冷冻干燥制剂。此外还发现，含有这些成分的HGF注射液对中枢神经系统的毒性极小，对中枢神经等神经系统的安全性高。

本发明人们基于这些见解进一步进行了研究，从而完成了本发明。本发明的HGF制剂在作为药品使用的方面具有充分的稳定性，例如，本发明的HGF注射液可以为了治疗ALS、脊髄损伤等各种中枢神经系统疾病而安全地给药至鞘内或脑室内、或者脊髄实质内或脑实质内。

即，本发明提供以下的HGF制剂。

(1)一种HGF制剂，其特征在于，以肝细胞生长因子(HGF)蛋白作为有效成分，进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂。

(2)如上述(1)所述的HGF制剂，其为冷冻干燥制剂。

(3)如上述(2)所述的HGF制剂，其为将含有肝细胞生长因子(HGF)蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的水溶液冷冻干燥而得到的冷冻干燥制剂。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的HGF制剂，其中，乳糖的含量相对于HGF 1重量份为0.1～50重量份。

(5)如上述(3)所述的HGF制剂，其中，水溶液中的乳糖的浓度为0.1～100mg/mL。

(6)如上述(3)所述的HGF制剂，其中，水溶液中的甘氨酸的浓度为0.05～50mg/mL。

(7)如上述(3)所述的HGF制剂，其中，水溶液中的HGF蛋白浓度为0.05～40mg/mL。

(8)如上述(1)所述的HGF制剂，其中，pH缓冲剂为柠檬酸或其水合物与柠檬酸的盐的组合。

(9)如上述(1)所述的HGF制剂，其中，表面活性剂为聚山梨酯。

(10)如上述(1)所述的HGF制剂，其为注射液。

(11)如上述(10)所述的HGF制剂，其中，注射液是将上述(2)所述的冷冻干燥制剂溶解于药学上可接受的溶剂而得到的水溶液。

(12)如上述(1)所述的HGF制剂，其用于中枢神经系统疾病的治疗。

(13)如上述(12)所述的HGF制剂，其中，中枢神经系统疾病为肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓小脑变性症、脊髄损伤、脑梗塞、脑缺血和多发性硬化中的任一种。

(14)如上述(1)所述的HGF制剂，其特征在于，其为给药至鞘内、脑室内、脊髄实质内或脑实质内的制剂。

(15)如上述(10)所述的HGF制剂，其中，注射液中的乳糖的浓度为0.1～100mg/mL。

(16)如上述(10)所述的HGF制剂，其中，注射液中的甘氨酸的浓度为0.05～50mg/mL。

(17)如上述(10)所述的HGF制剂，其中，注射液中的HGF蛋白浓度为0.05～40mg/mL。

(18)如上述(1)所述的HGF制剂，其中，HGF蛋白为来源于人的HGF蛋白。

(19)如上述(18)所述的HGF制剂，其中，HGF蛋白为由序列编号5或序列编号6所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

(20)如上述(1)所述的HGF制剂，其中，HGF蛋白为与序列编号5所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的蛋白质，且为具有作为HGF的生物活性的蛋白质。

另外，本发明涉及利用乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂使HGF水溶液或HGF冷冻干燥制剂中的HGF稳定的方法，更详细而言，涉及抑制HGF蛋白的聚合物生成的方法。

此外，本发明涉及将上述(1)所述的HGF制剂给药至罹患中枢神经系统疾病的患者的鞘内、脑室内、脊髄实质内或脑实质内而治疗中枢神经系统疾病的方法。

发明效果

本发明的HGF制剂作为制剂是稳定的，且能够安全地对中枢神经使用。例如，本发明的HGF注射液对中枢神经系统的安全性高，可以为了治疗ALS、脊髄损伤等各种中枢神经系统疾病而给药至鞘内或脑室内、或者脊髄实质内或脑实质内。

具体实施方式

本发明的HGF制剂以HGF蛋白作为有效成分，进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂。

本发明的HGF制剂可以含有HGF蛋白以外的有效成分(药效成分)，但优选不含有HGF蛋白以外的有效成分。

本发明的HGF制剂的剂型没有特别限定，优选例如冷冻干燥制剂、注射液等非经口给药的剂型等。冷冻干燥制剂优选为注射用冷冻干燥制剂。

注射液是指能够直接注射到生物体内的液态组合物。在本发明的HGF制剂为注射液的情况下，有时仅简称为“HGF注射液”。

另外，冷冻干燥制剂是指其成分以冷冻干燥体的固体状态提供的制剂。在本发明的HGF制剂为冷冻干燥制剂的情况下，有时仅简称为“HGF冷冻干燥制剂”。冷冻干燥制剂通常在用时使用适当的溶剂(溶解液)进行溶解，将其溶液直接作为注射液，或者根据期望进一步稀释至适当的溶剂等中之后作为注射液进行给药。即，可以说在冷冻干燥制剂中添加任意的溶剂将其溶解而得到的溶液与注射液实质上是同等的。

本发明的HGF制剂优选为以HGF蛋白作为有效成分、进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的冷冻干燥制剂。另外，以HGF蛋白作为有效成分、进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的HGF注射液也是本发明的HGF制剂的优选实施方式之一。

本发明的HGF制剂对中枢神经系统的安全性高。本发明的HGF注射液等HGF制剂对中枢神经系统的毒性极低，因此例如可以给药至鞘内或脑室内、或者脊髄实质内或脑实质内，能够适合用于各种中枢神经系统疾病的治疗等。

作为本发明中的HGF蛋白，种没有特别限定，可以适当使用各种动物来源的HGF蛋白(天然型HGF蛋白或利用基因工程技术制造的重组蛋白)等。本发明中，例如，优选使用来源于应用本发明的HGF制剂的动物的HGF蛋白。例如，作为在本发明中使用的HGF蛋白，在将本发明的制剂应用于人的情况下，优选使用来源于人的HGF蛋白(以下有时也称为人HGF蛋白)。更优选为重组人HGF蛋白。在将本发明的HGF制剂对人以外的哺乳动物使用的情况下，优选使用来源于这些动物种的HGF，例如，可以使用来源于猴、牛、马、猪、山羊、犬、猫、大叔、小鼠、兔、仓鼠、豚鼠、黑猩猩等的HGF蛋白。另外，本发明中使用的HGF蛋白可以是缺失了5个氨基酸残基的缺失型(dHGF)。

人HGF蛋白例如优选由序列编号1或序列编号2所表示的碱基序列构成的DNA所编码的蛋白质等。更具体而言，优选由序列编号3所表示的氨基酸序列构成的蛋白质、由序列编号4所表示的氨基酸序列构成的蛋白质、由序列编号5所表示的氨基酸序列构成的蛋白质、由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的蛋白质等。其中，作为人HGF蛋白，优选具有序列编号5或序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质，更优选由序列编号5或序列编号6所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。例如，由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的HGF蛋白是序列编号5所表示的氨基酸序列的第131～135位的5个氨基酸残基发生缺失的5氨基酸缺失型HGF蛋白(dHGF)。具有序列编号5或序列编号6所表示的氨基酸序列的蛋白质这两者均为人体内天然存在的HGF蛋白(天然型HGF蛋白)，具有作为HGF的促细胞分裂(mitogen)活性、促细胞运动(motogen)活性等。

本发明中使用的HGF蛋白还包含与各种动物来源的HGF蛋白(天然型HGF蛋白)的氨基酸序列具有至少约80％以上的序列同一性、优选具有约90％以上的序列同一性、更优选具有约95％以上的序列同一性、且具有作为HGF的生物活性(促细胞分裂活性和促细胞运动活性)的蛋白质。关于氨基酸序列的“序列同一性”，是指将蛋白质的一级结构进行比较时序列之间的构成各个序列的氨基酸残基的一致性，“％以上”是指其一致的程度。

HGF蛋白具有上述促细胞分裂活性和促细胞运动活性例如可以通过J.Biol.Chem.273,22913-22920,1998中记载的方法来确认。优选使用按照上述J.Biol.Chem.273,22913-22920,1998测定的促细胞分裂活性和促细胞运动活性与天然型HGF蛋白相比较通常为约50％以上、优选为约70％以上、更优选为约80％以上、进一步优选为约90％以上的蛋白质。

作为与HGF蛋白具有上述序列同一性的蛋白质，可以列举例如包含序列编号5或6所表示的氨基酸序列中置换、缺失和/或插入1个～几个氨基酸残基而得到的氨基酸序列、或者对1个～几个氨基酸残基进行修饰而得到的氨基酸序列等、且具有作为HGF的生物活性的蛋白质。

“几个”通常是指1个～8个(1、2、3、4、5、6、7、8个)，通常为8个、优选为6个、更优选为5个、进一步优选为3个、特别优选为2个。插入的氨基酸或置换的氨基酸优选天然氨基酸，但也可以为由基因编码的20种氨基酸以外的非天然氨基酸。非天然氨基酸只要具有氨基和羧基，则可以为任何化合物，可以列举例如γ-氨基丁酸等。

对氨基酸残基进行置换是将多肽中的氨基酸残基用其他氨基酸残基置换，优选为保守性置换。“保守性置换”是指以实质上不改变多肽活性的方式将1个～几个氨基酸残基利用其他的化学性质类似的氨基酸残基进行置换。可以列举例如将某一疏水性氨基酸残基利用其他疏水性氨基酸残基进行置换的情况、将某一极性氨基酸残基利用具有相同电荷的其他极性氨基酸残基进行置换的情况等。能够进行这种置换的功能上类似的氨基酸对于每种氨基酸而言是该技术领域中公知的。作为具有非极性(疏水性)侧链的氨基酸，可以列举甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为具有极性侧链的氨基酸中的中性氨基酸，可以列举丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷(碱性)的氨基酸，可以列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷(酸性)的氨基酸，可以列举天冬氨酸、谷氨酸等。

本发明的制剂中含有的HGF蛋白可以仅为一种，也可以为两种以上的上述HGF蛋白。

本发明的制剂中使用的HGF蛋白只要为纯化至能够作为药物使用的程度的HGF蛋白，则可以使用利用各种方法制备的HGF蛋白。作为HGF蛋白的制备方法，已知有各种方法，例如可以从大鼠、牛、马、山羊等哺乳动物的肝脏、脾脏、肺脏、骨髄、脑、肾脏、胎盘等器官、血小板、白细胞等血液细胞、或者血浆、血清等中提取和纯化而得到。

作为从上述生物体组织等中提取纯化HGF蛋白的方法，例如，可以对大鼠进行四氯化碳腹腔内给药，摘取形成肝炎状态的大鼠的肝脏并粉碎，通过利用S-琼脂糖凝胶、肝素琼脂糖凝胶等的柱色谱、HPLC等通常的蛋白质纯化法进行纯化。

另外，也可以对产生HGF蛋白的原代培养细胞或细胞系进行培养，从培养物(培养上清、培养细胞等)中分离纯化而得到HGF蛋白。或者，可以利用基因工程的方法将编码HGF蛋白的基因(优选由序列编号1或2所表示的碱基序列构成的DNA)组入适当的载体中，将其插入到适当的宿主中进行转化，从该转化体的培养物得到作为目标的重组HGF蛋白(例如参考Biochem.Biophys.Res.Commun.180:1151-1158,1991；J.Clin.Invest.87:1853-1857,1991；Protein Expr.Purif.70:231-235,2010等)。上述宿主细胞没有特别限定，可以使用以往在基因工程的方法中使用的各种宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、丝状菌、植物或动物细胞等。例如，在使用动物细胞作为宿主细胞的情况下，可以利用组入有编码人HGF蛋白的氨基酸序列的cDNA的表达载体对动物细胞、例如中国仓鼠卵巣(CHO)细胞、小鼠C127细胞、猴COS细胞等进行转化，分离其培养上清，通过上述柱色谱等进行纯化，从而得到HGF蛋白。

如此得到的HGF蛋白只要具有作为HGF的生物活性，也可以为天然型HGF蛋白的氨基酸序列中的1个或多个[例如1个～几个(“几个”为与上述相同的含义，例如为1～8个、优选为1～6个、更优选为1～5个、进一步优选为1～3个、特别优选为1～2个；以下同样)]氨基酸被置换、缺失和/或插入而得到的氨基酸序列。置换优选为保守性置换。另外，同样地，可以在HGF蛋白上进行糖链的置换、缺失或插入。在此，关于氨基酸序列中的“1个或多个氨基酸缺失、置换和/或插入”是指，利用基因工程的方法、定点诱变法等公知的技术性方法、或者天然可产生的程度的数量(通常为1个～几个)的氨基酸发生了缺失、置换和/或插入等。进行了糖链的置换、缺失或插入的HGF蛋白是指例如将天然型HGF蛋白上附加的糖链利用酶等进行处理而使糖链缺失的HGF蛋白、对天然型HGF蛋白中糖链附加部位的氨基酸序列实施了突变从而不附加糖链的HGF蛋白、或者对氨基酸序列实施了突变使得在与天然的糖链附加部位不同的部位附加糖链的HGF蛋白等。

本发明的HGF制剂中使用的乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂可以优选使用各国药典(例如，日本药典、美国药典、欧洲药典等)收录品，在使用未收录在药典中的成分的情况下，优选药学上可接受的成分。“药学上可接受的”是指，通常安全且毒性低，在生物学上和其他方面都没有问题，且在作为动物药物和人的药物可被批准的制剂的制备中有用。

本发明的HGF制剂中使用的乳糖可以优选使用各国药典(例如，日本药典、美国药典、欧洲药典等)中收录的乳糖。乳糖的添加量相对于HGF蛋白1重量份优选为约0.1重量份～约50重量份，更优选为约0.5重量份～约10重量份，进一步优选为约1重量份～约5重量份(包括1～2重量份、1～3重量份、1～4重量份、1～5重量份、2～3重量份、2～4重量份、2～5重量份、3～4重量份、3～5重量份、4～5重量份)。

本发明的HGF制剂中使用的甘氨酸可以优选使用各国药典(例如，日本药典等)中收录的甘氨酸。甘氨酸的添加量相对于HGF蛋白1重量份优选为约0.01重量份～约1重量份，更优选为约0.05重量份～约1重量份，进一步优选为约0.1重量份～约0.5重量份(包括0.1～0.2重量份、0.1～0.3重量份、0.1～0.4重量份、0.1～0.5重量份、0.2～0.3重量份、0.2～0.4重量份、0.2～0.5重量份、0.3～0.4重量份、0.3～0.5重量份、0.4～0.5重量份)。

本发明的HGF制剂中使用的pH缓冲剂是指，在溶解于水等溶剂中时能够形成具有将溶液的pH保持在一定范围内的作用的缓冲液的试剂，通常可以列举弱酸与其盐的组合等。作为优选的pH缓冲剂，可以列举在溶解时能够形成例如磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或硼酸缓冲液的例如磷酸、柠檬酸或硼酸与它们的盐的组合等，更优选能够形成柠檬酸缓冲液的柠檬酸与其盐的组合。这些弱酸和它们的盐可以为溶剂化物，溶剂化物例如优选水合物。将pH缓冲剂溶解而得到的溶液为缓冲液，具有调节HGF水溶液的pH、保持HGF蛋白的溶解性和稳定性的作用。作为本发明中的HGF水溶液，可以列举例如HGF注射液、在制造后述的冷冻干燥制剂时制备的冷冻干燥前的水溶液、将该冷冻干燥制剂再溶解于溶剂后的水溶液等。例如HGF制剂若为冷冻干燥制剂，则pH缓冲剂优选使HGF制剂再溶解后的水溶液的pH为约4.5～约8.0的pH缓冲剂。另外，若为HGF注射液，则优选使该注射液的pH为约4.5～约8.0的pH缓冲剂。具体而言，例如，本发明中的pH缓冲剂在HGF注射液、HGF冷冻干燥制剂等任一种HGF制剂中均优选柠檬酸或其溶剂化物与柠檬酸盐或其溶剂化物的组合，均更优选柠檬酸或其水合物与柠檬酸的盐的组合，均进一步优选柠檬酸水合物与柠檬酸钠(优选柠檬酸三钠二水合物、或柠檬酸三钠(无水))的组合。柠檬酸缓冲液使HGF水溶液中的HGF蛋白稳定的作用优良，能够有助于HGF注射液、制备HGF冷冻干燥制剂前的HGF水溶液和HGF冷冻干燥制剂再溶解后的水溶液中的HGF的蛋白质的稳定化。关于pH缓冲剂的添加量，例如若为HGF注射液，作为注射液中的浓度，优选以达到约1mM～约100mM、更优选约1mM～约20mM的范围的方式添加。若为冷冻干燥制剂，作为制造后述的冷冻干燥制剂时的冷冻干燥前的水溶液中的浓度，优选以达到优选约1mM～约100mM、更优选约1mM～20mM的范围的方式添加。

作为本发明的HGF制剂中使用的表面活性剂，可以列举例如聚山梨酯(例如，聚山梨酯20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)、聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)等)、Pluronic(注册商标)F-68(GIBCO公司)、聚乙二醇等，可以并用2种以上。作为表面活性剂，优选聚山梨酯，特别优选聚山梨酯80。由于HGF蛋白容易吸附在作为容器材质的玻璃、树脂等上，因此，通过添加这样的表面活性剂，能够在HGF制剂的制造过程中防止HGF蛋白吸附到容器上。另外，通过添加表面活性剂，能够防止HGF注射液和HGF制剂再溶解后的HGF水溶液中的HGF蛋白吸附到容器上。关于表面活性剂的添加量，若为HGF注射液，作为注射液中的浓度，例如优选为约0.001重量％～约2.0重量％的范围，更优选约0.005重量％～约1.0重量％的范围。另外，若为冷冻干燥制剂，例如以制造后述的冷冻干燥制剂时的冷冻干燥前的水溶液中的浓度计，表面活性剂的添加量优选为约0.001重量％～约2.0重量％的范围，更优选约0.005重量％～约1.0重量％的范围。

本发明的HGF制剂中使用的氯化钠具有保持HGF蛋白的溶解性的作用。即，通过氯化钠的添加，HGF蛋白的溶解度提高，特别是氯化钠为约150mM以上时，溶解性提高。另外，通过添加氯化钠，能够使HGF水溶液的渗透压接近于体液的渗透压。氯化钠的添加量根据目标渗透压比适当调节即可，以生理盐溶液为基准(渗透压比为1)，优选使作为医疗用或动物药用注射剂的渗透压比可接受的渗透压比为约1～3的量。例如若为HGF注射液，以氯化钠浓度计优选约150mM～约1000mM，更优选约150mM～约300mM。若为冷冻干燥制剂，例如，以制造后述的冷冻干燥制剂时的HGF水溶液中的浓度计，优选约150mM～约1000mM，更优选约150mM～约300mM。

本发明的HGF制剂的制造方法没有特别限定，例如若为冷冻干燥制剂，可以通过将含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的水溶液进行冷冻干燥来制造。如此得到的冷冻干燥制剂为本发明的HGF制剂的优选实施方式之一。冷冻干燥制剂的制造中使用的上述水溶液只要是含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的水溶液即可，其制备方法没有特别限定。上述水溶液例如可以通过在纯化的HGF蛋白溶液(通常含有pH缓冲液、氯化钠和表面活性剂)中分别添加乳糖、甘氨酸和根据需要的药学上可接受的溶剂(例如，灭菌水、注射用蒸馏水、纯水、缓冲液、生理盐溶液等)来制造。优选以HGF蛋白在水溶液中优选为约0.05mg/mL～约40mg/mL的浓度、更优选为约0.1mg/mL～约40mg/mL的浓度、进一步优选为约0.1mg/mL～约20mg/mL的浓度的方式制备。乳糖以在水溶液中为约0.1mg/mL～约100mg/mL、更优选为约0.5mg/mL～约50mg/mL、进一步优选为约1mg/mL～约20mg/mL的方式添加。甘氨酸以在水溶液中优选为约0.05mg/mL～约50mg/mL、更优选为约0.05mg/mL～约20mg/mL、进一步优选为约0.1mg/mL～约10mg/mL的方式添加。在该HGF水溶液中也可以进一步根据需要添加助溶剂、抗氧化剂、无痛剂或等渗剂等添加物。HGF水溶液优选利用过滤器等过滤灭菌并注入小瓶或安瓿中进行冷冻干燥。过滤器优选使用例如孔径约0.22μm以下的灭菌用过滤器。作为灭菌用过滤器，可以优选列举例如デュラポア(注册商标、默克株式会社制)或ザルトポア2(注册商标、ザルトリウス株式会社制)等。

将上述水溶液进行冷冻干燥的方法没有特别限定，可以采用通常的冷冻干燥方法。作为冷冻干燥方法，可以列举例如由在常压下进行冷却冷冻的冷冻过程、在减压下将不受溶质约束的自由水升华干燥的一次干燥过程、将溶质固有的吸附水和结晶水除去的二次干燥过程这三个工序构成的干燥方法。冷冻过程的冷却温度优选约-60℃～约-40℃，一次干燥过程的温度优选约-50℃～约0℃，进一步二次干燥过程的温度优选约4℃～约40℃。真空压力优选约0.1Pa～约1.5Pa，特别优选约0.5Pa～约1.2Pa。对冷冻干燥后的干燥箱内进行复压。作为复压的方法，优选如下方法：将无菌的空气或不活泼气体(例如无菌氮气、无菌氦气等)送入箱内，一次复压至优选约70kPa～约100kPa、更优选约80kPa～约95kPa，接着复压(二次复压)至大气压。小瓶的落塞(打栓)优选在一次复压后进行，落塞了的小瓶优选在二次复压后迅速用盖子封闭。安瓿的情况下，优选在干燥结束后利用热(通常为气体燃烧器)将安瓿末端熔融密封。

HGF冷冻干燥制剂优选水分含量为约2重量％以下。

本发明的HGF冷冻干燥制剂在保存中的HGF蛋白聚合物形成得到抑制，稳定性优良。在此，“蛋白质聚合物”是指多个蛋白质单体结合成例如链状或网状而生成的物质，在本发明中包括HGF蛋白的二聚体、三聚体或四聚体。

本发明的HGF冷冻干燥制剂在使用时通常溶解于药学上可接受的溶剂，以水溶液的形态使用。“药学上可接受的”为与上述相同的含义。作为药学上可接受的溶剂，可以优选列举例如注射用蒸馏水、生理盐溶液、各种输液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工脑脊液等。溶剂更优选为注射用蒸馏水或生理盐溶液。在优选的方式中，将本发明的HGF冷冻干燥制剂以HGF蛋白的浓度优选为约0.05mg/mL～约40mg/mL、更优选为约0.1mg/mL～约40mg/mL、进一步优选为约0.1mg/mL～约20mg/mL的方式溶解在例如注射用蒸馏水等药学上可接受的溶剂中，可以作为注射液适当使用。

本发明的HGF冷冻干燥制剂也可以与上述药学上可接受的溶剂一起以试剂盒的形式进行包装、制造。

本发明的HGF注射液优选为含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的水溶液。乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂以及其优选方式等如上所述。

本发明的HGF注射液的制造方法没有特别限定，例如，可以将上述HGF冷冻干燥制剂溶解在药学上可接受的溶剂中而得到。作为药学上可接受的溶剂，可以优选列举例如注射用蒸馏水、生理盐溶液、各种输液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工脑脊液等。溶剂更优选为注射用蒸馏水或生理盐溶液。另外，本发明的HGF注射液也可以在约0.1mg/mL～约40mg/mL的浓度的纯化HGF蛋白水溶液(通常含有pH缓冲液、氯化钠和表面活性剂)中添加乳糖、甘氨酸和根据需要的药学上可接受的溶剂(例如，灭菌水、注射用蒸馏水、纯水、缓冲液、生理盐溶液等)来制备。例如，也可以将上述冷冻干燥制剂的制造中使用的含有HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的水溶液作为HGF注射液使用。

本发明的HGF注射液中的HGF蛋白浓度优选为约0.05mg/mL～约40mg/mL，更优选为约0.1mg/mL～约40mg/mL，进一步优选为约0.1mg/mL～约20mg/mL。

本发明的HGF注射液中的乳糖的浓度优选约0.1mg/mL～约100mg/mL，更优选约0.5mg/mL～约50mg/mL的范围，进一步优选为约1mg/mL～约20mg/mL。

本发明的HGF注射液中的甘氨酸的浓度优选为约0.05mg/mL～约50mg/mL，更优选为约0.05mg/mL～约20mg/mL的范围，进一步优选为约0.1mg/mL～10mg/mL。

本发明的HGF注射液的pH优选为约4.5～约8.0。

在本发明的HGF注射液中，也可以进一步根据需要添加助溶剂、抗氧化剂、无痛剂或等渗剂等添加物。

本发明的HGF注射液通常为澄清的溶液。本发明的HGF注射液虽然为溶液的状态，但可抑制保存中的HGF聚合物形成，稳定性优良。

本发明的HGF制剂的用途没有特别限定，优选作为用于治疗或预防中枢神经系统疾病、例如肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓小脑变性症、脊髄损伤、脑梗塞、脑缺血、多发性硬化等的药物组合物使用。其中，本发明的HGF制剂优选用于中枢神经系统疾病的治疗。

本发明的HGF注射液、HGF冷冻干燥制剂等HGF制剂例如可以给药至脑室内或鞘内。例如本发明的HGF注射液适合作为脑室内给药用或鞘内给药用的制剂。可给药本发明的HGF注射液的脊髓腔是脊髄周围的被脑脊液充满的空间，该空间由蛛网膜和硬膜这两层膜包围。脊髓腔是存在于周围这两层膜中位于内侧的蛛网膜的内部的空间，鞘内给药即表示蛛网膜下腔内给药。脑和脊髄的周围均被脑脊液所充满，脑内部的脑室也被脑脊液充满。脑室、脑周围和脊髓腔形成相连的空间，脑脊液在该空间内循环。因此，脑室内给药和鞘内给药均是将药剂给药至脑脊液中，通常，脑室内给药和鞘内给药实质上为相同的给药途径。另外，本发明的HGF注射液等HGF制剂也可以给药至脑实质内或脊髄实质内。在脑室内给药或鞘内给药、或者脑实质内给药或脊髄实质内给药时，可以将注射液静脉推注给药，也可以使用注射泵等持续注入。

需要说明的是，本发明的HGF制剂的使用用途并不仅限于中枢神经系统疾病的治疗。本发明的HGF制剂作为药物具有充分的稳定性，并且安全性也优良，因此，也可以用于中枢神经系统疾病以外的疾病的治疗。该情况下，给药途径可以采用静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、局部给药等适合所应用的疾病的治疗的给药途径。

本发明的HGF制剂的给药量根据对象疾病的种类、病情等适当设定即可。例如，在为了中枢神经系统疾病的治疗而使用HGF注射液的情况下，成人每1天以HGF蛋白计优选给药约0.01mg～约50mg、更优选给药约0.1mg～约10mg。另外，优选将HGF注射液进行脑室内给药或鞘内给药。另外，本发明的HGF注射液等HGF制剂在给药时可以用药学上可接受的适当的溶剂适当稀释来使用。作为药学上可接受的溶剂，例如为注射用蒸馏水、生理盐溶液、各种输液(例如，5％葡萄糖液、林格氏液等)或人工脑脊液等，更优选列举注射用蒸馏水或生理盐溶液。

本发明还包含将以HGF蛋白作为有效成分、进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的HGF制剂给药至中枢神经系统疾病的患者的中枢神经系统疾病的治疗方法。

本发明还包含用于中枢神经系统疾病的治疗的、以HGF蛋白作为有效成分、进一步含有乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂的HGF制剂。

HGF制剂优选为冷冻干燥制剂(HGF冷冻干燥制剂)或注射液(HGF注射液)，更优选为注射液。

HGF制剂、HGF冷冻干燥制剂和HGF注射液以及它们的优选方式等如上所述。在中枢神经系统疾病的治疗中，HGF制剂优选给药至鞘内或脑室内、或者脊髄实质内或脑实质内。

本发明还包含一种水溶液中的HGF聚合物生成抑制方法，其为抑制含有HGF蛋白的水溶液中的HGF聚合物(HGF蛋白的聚合物)生成的方法，其特征在于，在该水溶液中配合乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂。水溶液中的HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂、以及它们的优选添加量等与上述HGF注射液中的情况同样。

本发明还包含一种冷冻干燥制剂中的HGF聚合物生成抑制方法，其为抑制含有HGF蛋白的冷冻干燥制剂中的HGF聚合物(HGF蛋白的聚合物)的生成的方法，其特征在于，在该冷冻干燥制剂中配合乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂。HGF蛋白、乳糖、甘氨酸、氯化钠、pH缓冲剂和表面活性剂、以及它们的优选添加量等与上述HGF冷冻干燥制剂中的情况同样。

实施例

以下，利用实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限定。

以下，在由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的重组人HGF蛋白(以下，仅表示为HGF)中添加各种添加物，对稳定性和安全性进行研究。需要说明的是，在以下的实施例中，只要没有特殊声明，则％表示质量％。所使用的HGF依据Biochem.Biophys.Res.Commun.180:1151-1158,1991中记载的方法利用CHO细胞进行制造。

[实施例1]

在含有5mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)和0.375M氯化钠、0.005％聚山梨酯80的HGF溶液中溶解乳糖和甘氨酸，分别按照下述表1所示的浓度进行制备。

[表1]

将所得到的上述溶液各1mL无菌分装到小瓶(φ23×43mm)中。用橡胶盖半落塞在小瓶上，整齐排列在托盘中，放入冷冻干燥机(トリオマスター；共和真空技术株式会社制)中，在-50℃进行预冷冻后，经过一次干燥(-50℃→-20℃/4小时、-20℃/24小时以上、0.01～0.1托)和二次干燥(-20℃→20～30℃/8～10小时、20～30℃/10小时以上、0.01～0.1托)，得到冷冻干燥制剂。冷冻干燥结束后，向トリオマスター箱内鼓入无菌氮气进行复压(箱内压力：88.0kPa；一次复压)，将橡胶盖全落塞后用无菌氮气使トリオマスター箱内恢复至大气压(二次复压)，取出小瓶后，迅速将小瓶用盖子封闭。如此，得到本发明的HGF冷冻干燥制剂。

[实施例2]

除了使乳糖的添加浓度为7.5mg/mL以外，与实施例1同样地操作，得到HGF冷冻干燥制剂。

[实施例3]

除了使乳糖的添加浓度为10mg/mL以外，与实施例1同样地操作，得到HGF冷冻干燥制剂。

[实施例4]

在含有2mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)和0.15M氯化钠、0.002％聚山梨酯80的HGF溶液中以分别达到下述表2所示浓度的方式溶解乳糖和甘氨酸，得到HGF注射液。另外，也可以将实施例2中得到的HGF冷冻干燥制剂用注射用蒸馏水2.5mL溶解而得到表2的组成的HGF注射液。

[表2]

实验例1

以10mg/mL HGF、10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)、0.3M氯化钠和0.03％聚山梨酯80作为基本成分，在该基本成分中添加表3的各添加物，制备配方1～3的HGF溶液(2mL)，将其在小瓶中与实施例1同样地进行冷冻干燥，制作各冷冻干燥制剂。将各冷冻干燥制剂在作为使其强制劣化的条件的50℃下保存1周，测定保存前后的聚合物含量。将结果示于表4。

[表3]

关于HGF制剂的聚合物含量，将各冷冻干燥制剂用2mL的注射用蒸馏水溶解，利用高效液相色谱(HPLC)在下述条件下对所得到的HGF溶液进行分析，利用下述式1以所得到的面积百分率(％)(以下称为聚合物含量(％))的形式求出HGF制剂的聚合物含量。

式1中，A_M表示HGF峰面积、A_A表示聚合物峰面积。

(HPLC条件)

柱：凝胶过滤柱(商品名：Superdex 200 10/300、GE healthcare公司制)

流动相：将氯化钠58.44g、柠檬酸三钠二水合物2.94g和聚山梨酯80 0.1g溶解于纯水，用纯水调节为1L，将所得到的溶液作为A液。将氯化钠58.44g、柠檬酸一水合物2.10g和聚山梨酯80 0.1g溶解于纯水，调节为1L，将所得到的溶液作为B液。在A液中加入B液，调节pH至6.0后，使用0.45μm的过滤器(商品名：Millicup-HV、孔径0.45μm、默克公司制)进行过滤，在使用前进行脱气。在室温下保存，2周以内使用。

柱温：25℃

流速：0.5mL/分钟

检测液注入量：25μL

检测波长：280nm

[表4]

在利用仅由基本成分构成的配方1的HGF溶液制作的冷冻干燥制剂的情况下，在苛酷条件下保存时，确认到显著的聚合物生成。另一方面，在由配方2和3的HGF溶液制作的冷冻干燥制剂的情况下，即使在苛酷条件下也抑制了聚合物的生成，如以往所知的那样，确认到在精制蔗糖或L-丙氨酸中稳定地维持HGF冷冻干燥制剂的效果。

实验例2

以2.5mg/mL HGF、5mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)和0.375M氯化钠、0.005％聚山梨酯80作为基本成分，在该基本成分中添加表5的各添加物，制备配方4～6的HGF溶液(1mL)，将其在小瓶中与实施例1同样地进行冷冻干燥，制作各冷冻干燥制剂。将各冷冻干燥制剂在50℃下保存1周，与实验例1同样地测定保存前后的聚合物含量。将结果示于表6。

[表5]

[表6]

可知在添加有甘氨酸和乳糖的配方5的HGF冷冻干燥制剂的情况下，抑制了聚合物的生成，制剂的稳定性好。

实验例3

为了确认添加有甘氨酸和乳糖的HGF冷冻干燥制剂的稳定性，以2.5mg/mL HGF、5mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)、0.375M氯化钠和0.005％聚山梨酯80作为基本成分，在该基本成分中添加表7的各添加物，制备配方4、5、7和8的HGF溶液(1mL)，将其在小瓶中与实施例1同样地进行冷冻干燥，制作各冷冻干燥制剂。将各冷冻干燥制剂在25℃下保存1～2个月或在50℃下保存2周，与实验例1同样地测定保存前后的聚合物含量。将结果示于表8。

[表7]

[表8]

在由添加有甘氨酸和乳糖的配方5和7的HGF溶液制作的冷冻干燥制剂的情况下，在室温25℃下保存2个月后聚合物含量也被抑制在稍有增加的程度。此外，在由配方5和7的HGF溶液制作的冷冻干燥制剂的情况下，在苛酷条件下、即50℃下保存2周后，聚合物含量也只不过稍过1％，聚合物的生成得到抑制。由配方5和7的HGF溶液制作的冷冻干燥制剂中的聚合物形成抑制效果与配方8基本同等，该配方8中与甘氨酸一同添加有已知对HGF冷冻干燥制剂的稳定化有效的精制蔗糖。

实验例4

将实施例2中得到的HGF冷冻干燥制剂用注射用蒸馏水2.5mL溶解，得到表2的组成的HGF注射液。将该注射液在密闭容器中在40℃下保存2周。与实验例1同样地测定保存前后的HGF注射液的聚合物含量。另外，对于保存前后的HGF注射液的HGF的生物活性，以美洲水鼬肺来源的上皮样细胞Mv1Lu细胞(理研、BRC ID：RCB0996)的增殖性为指标进行评价。

保存前和保存后的HGF注射液中的聚合物含量分别为1.54％和2.67％，在40℃下保存2周期间的聚合物含量的增加限制于约1％。另外，与保存前相比，在40℃下保存2周后的HGF注射液中的HGF的生物活性维持了89.4％(将保存前作为100％的相对活性)的高活性。这样，本发明的HGF注射液在40℃下保存2周的期间也基本稳定。

试验例1

向大鼠鞘内静脉推注(bolus)单次给药表9的HGF溶液1、2或各种溶剂(溶剂A或B)或者生理盐溶液45μL，研究对中枢神经系统的安全性。需要说明的是，大鼠的脑脊液量为约200μL，向其中静脉推注单次给药过量的溶液本身就会导致大鼠引起异常的症状，因此，将可向大鼠的鞘内静脉推注单次给药的最大可接受量设定为45μL。

在戊巴比妥麻醉下用电推剪从颈部至背部对大鼠进行剪毛，用消毒用乙醇和イソジン液10％(商品名、株式会社明治：聚维酮碘10％溶液)对剃毛部位进行擦洗和消毒。切开背部皮肤，露出第11胸椎至第2腰椎后，切除第12/13胸椎间的韧带，使硬膜露出。在露出部位的硬膜和蛛网膜切开小口，确认脑脊液的流出后，立即将充满生理盐溶液(株式会社大塚制药工场)的聚氨酯导管(将MRE025(OD：0.25mm、10cm)和MRE010(OD：0.65mm、2.5cm)连接而成的两段导管；布伦特里，USA)的前端从切开部向鞘内(朝向头部侧)插入约2.5cm。使用医疗用Aron Alpha胶粘剂(商品名：アロンアルファA“三共”、第一三共株式会社)将导管与周围组织固定，同时通过热处理将导管的末端封闭，以适当长度从颈部皮肤露出。使用缝合线将创部缝合。在大鼠从麻醉至清醒为止的期间用保温垫进行保温，清醒后，返回至饲养笼内。导管留置次日，在大鼠清醒的状态下经由留置导管单次静脉推注给药表9的HGF溶液1、2、溶剂A或B或者生理盐溶液45μL，接着进行10μL生理盐溶液的给药(为了将残留在导管内的HGF溶液或溶剂推入鞘内)。然后，对导管进行热处理使其封闭，放回至皮下，观察大鼠的状态。

[表9]

大鼠鞘内的静脉推注给药中，在生理盐溶液给药的情况下，大鼠未显示出任何异常。另一方面，在配合以往已知对HGF制剂的稳定化效果的添加物而制备的溶剂A的鞘内给药的情况下，虽然是暂时性的，但确认到大鼠的自发运动降低、流涎、痉挛等神经学异常所见。与此相对，在配合本发明的HGF制剂中使用的添加物而制备的溶剂B的鞘内给药的情况下，与给药生理盐溶液时同样，大鼠未显示出任何异常。将利用该溶剂B制备的HGF溶液1(与实施例4的注射液相同，相当于本发明的HGF注射液)同样地给药至大鼠的鞘内，大鼠也未显示出任何异常。确认到本发明的HGF注射液对中枢神经系统不造成不良影响，为非常安全的组成。另一方面，将溶剂B的乳糖替换为蔗糖，在将利用所得到的组成的溶剂制备的HGF溶液2给药至大鼠鞘内的情况下，大鼠在给药后约20分钟的期间显示出啼叫、四肢僵直等神经学上的异常症状。

试验例2

制作大鼠的脊髄损伤模型，从损伤后立即反复向鞘内给药HGF溶液(45μL/shot、3次/周、4周)(HGF给药组；n＝6)。此时，作为HGF溶液，使用将实施例2的冷冻干燥制剂用2.5mL的注射用蒸馏水再溶解而得到的表2的组成的HGF溶液。另外，对于对照组的脊髄损伤模型大鼠(n＝6)，同样地给药不含HGF的溶剂(2mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)、0.15M氯化钠、0.002％聚山梨酯80、0.16mg/mL甘氨酸和3mg/mL乳糖)。

脊髄损伤模型大鼠的制作如下进行。首先在氯胺酮和赛拉嗪麻醉下用电推剪从颈部到腰部对大鼠进行剪毛，用70％乙醇和イソジン液10％(商品名、株式会社明治：聚维酮碘10％溶液)进行擦洗。将背部皮肤切开，露出第6胸椎至第5腰椎附近后，切除第9～10胸椎的椎弓和韧带，使硬膜露出。立即使用MASCIS撞击仪(罗格斯大学，USA)，使10g的重锤从25mm的高度落下至第10胸椎高位，制作脊髄损伤。在脊髄损伤后立即切除第1/2腰椎间的韧带，使硬膜露出，在硬膜和蛛网膜上切开小口。确认脑脊液的漏出，立即将聚氨酯导管(将MRE025(OD：0.25mm、10cm、布伦特里、USA)和MRE010(OD：0.65mm、2.5cm、布伦特里、USA)连接而成的两段导管)的前端朝向头侧插入到鞘内，前进至脊髄损伤附近。利用医疗用Aron Alpha胶粘剂(商品名：アロンアルファA“三共”、第一三共株式会社)将导管固定于肌层而留置，进行第1次药液(HGF溶液或溶剂)给药后，使导管末端以适当长度从颈部皮肤露出，缝合创部。利用保温垫进行保温直至动物从麻醉清醒为止，清醒后，返回至饲养笼内。之后，经由留置的导管以3次/周的频率进行4周HGF溶液或溶剂的给药。各次给药中，在给药HGF溶液或溶剂45μL之后，进行10μL生理盐溶液的给药(为了将残留在导管内的HGF溶液或溶剂推入鞘内)。各给药结束后，每次都对导管端进行热处理而使其封闭。

使用BBB评分(满分21分：以0分(完全麻痹)～21分(正常的后肢运动)的21个等级进行评价)(Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC:A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma 12：1-21,1995)经时地对大鼠的后肢运动功能进行评价，研究HGF对脊髄损伤的治疗效果。在脊髄损伤的次日，BBB得分在全部个体中均为0分，但在脊髄损伤4周后，HGF给药组中BBB得分的平均值恢复至10分以上，与溶剂给药组(对照组)的得分(平均值低于10分)相比显著地显示出高值。确认到HGF对脊髄损伤的治疗效果。需要说明的是，在4周的给药期间中，溶剂给药组(对照组)和HGF给药组的大鼠均未显示出脊髄损伤以外的异常症状。另外，在脊髄损伤4周后将大鼠解剖，结果在大鼠的脊髄中除了受到脊髄损伤的部位以外未确认到异常。确认到将实施例2的冷冻干燥制剂再溶解而得到的HGF溶液在脊髄损伤的治疗中是安全且有效的。

产业上的可利用性

根据本发明，能够提供作为药物有用的保存稳定性优良的HGF制剂。另外，本发明的HGF注射液可为了治疗ALS、脊髄损伤等中枢神经系统疾病而给药至鞘内或脑室内、或者脊髄实质内或脑实质内。因此，本发明在医疗领域等中有用。

序列表

<110> 克霖固鲁制药股份有限公司（KRINGLE PHARMA INC.）

<120> 适合神经系统疾病的治疗的HGF制剂（HGF preparation usable for treating a neurological disease）

<130> K12F5359

<150> JP 2014-184475

<151> 2014-09-10

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2187

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320

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tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620

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ttaacatata aggtaccaca gtcatag 2187

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<211> 2172

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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