多药物递送系统及其用途的制作方法

本

技术实现要素：
是关于一种多药物递送系统及其于治疗疾病的用途。具体来说，本发明内容是关于一种抗聚乙二醇抗体(anti-polyethylene glycol antibody,anti-PEG Ab)及水凝胶的新颖用途，通过将聚乙二醇化药剂(PEGylated therapeutic)多次投予至一罹患疾病的个体，其中该疾病包含，但不限于癌症及血管性疾病。

背景技术：

聚乙二醇化药剂(即将聚乙二醇接合至诸如化合物、胜肽或蛋白等治疗性药物)已成为一种新颖的药物投予方法；其具备多种治疗优势，其中又以与双效抗聚乙二醇抗体共同使用时，所产生的目标专一性最为独特。举例来说，在治疗癌症时，若同时注入聚乙二醇化的纳米粒子(例如艾霉素微脂体(doxorubicin liposome))及双效抗体，则双效抗体的一端可辨识聚乙二醇分子的骨架，另一端则可辨识肿瘤细胞的受器；通过双效抗体的作用，可将聚乙二醇化的纳米粒子目标至肿瘤细胞上。然而，在投予后，抗聚乙二醇抗体极易被血液循环所清除，因而减少聚乙二醇化药剂的治疗功效。

有鉴于此，相关领域亟需一种试剂及一种递送系统，通过延长抗聚乙二醇抗体于个体体内的作用时间，使聚乙二醇化药剂可多次投予并持续目标至目标位置，进而改善或增强聚乙二醇化药剂的治疗功效。

发明内容

本发明内容部分是基于发明人首次发现诸如玻尿酸(hyaluronan,HA)等水凝胶可将抗聚乙二醇抗体及/或聚乙二醇化药剂维持于个体体内的目标位置，通过对有需要的个体投予多剂的聚乙二醇化药剂来进行治疗。本研究是利用小鼠后肢缺血模式来检测在治疗癌症或血管缺血时，水凝胶于维持抗聚乙二醇抗体及/或聚乙二醇化药剂的功效；结果显示，水凝胶或可形成一胶状结构的化合物可与抗聚乙二醇抗体共同使用，作为一种用以辅助聚乙二醇化药剂(例如聚乙二醇化的抗缺血性药物)的佐剂，以治疗有需求的个体。

因此，本发明内容的第一实施例提供了一种递送系统，通过该递送系统将聚乙二醇化药剂多次投予至个体体内的目标位置。该递送系统包含：

一用以将聚乙二醇化药剂目标至目标位置的抗聚乙二醇抗体；以及

一用以将抗聚乙二醇抗体及/或聚乙二醇化药剂维持于目标位置至少3天的水凝胶；

其中，水凝胶选自玻尿酸(hyaluronan,HA)、玻尿酸衍生物、胶原(collagen)、明胶(gelatin)、纤网蛋白(fibronectin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、藻酸盐(alginate)、几丁聚醣(chitosan)、纤维蛋白胶(fibrin glue)或合成生物兼容性聚合物。

依据某些实施方式，合成生物兼容性聚合物可以是聚乙醇酸(poly(glycolic acid),PGA)、聚乳酸(poly(lactic acid),PLA)、聚氨酯(polyurethane,PU)、聚ε-己内酯(poly(ε-caprolactone))、聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol),PVA)、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate,PCA)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、共聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚三亚甲基碳酸酯(poly(trimethylene carbonate),PTMC)、聚二甲基硅胶(polydimethylsiloxane,PDMS)、共聚乙烯-乙酸乙烯酯(poly(ethylene-co-vinyl acetate,PEVA)、共聚乙交酯-己内酯(poly(glycolide-co-caprolactone),PGCL)或共聚丙交酯-己内酯(poly(lactide-co-caprolactone),PLCL)。

依据其他实施方式，水凝胶是玻尿酸或玻尿酸衍生物，其中玻尿酸的分子量约为20千道耳顿(kDa)到2,000千道耳顿；较佳的情况是，玻尿酸的分子量约为1,500千道耳顿。

依据本发明内容实施方式，玻尿酸衍生物可以是玻尿酸(hyaluronic acid)、经己二酸二酰肼修饰的玻尿酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、玻尿酸酰胺(amides of hyaluronan)、交联玻尿酸(crosslinked hyaluronic acid)、玻尿酸的重金属盐类(heavy metal salts of hyaluronic acid)、硫化玻尿酸(sulphated hyaluronic acid)、N-硫化玻尿酸(N-sulphated hyaluronic acid)、经胺类修饰的玻尿酸(amine-modified hyaluronic acid)、经双胺修饰的玻尿酸(diamine-modified hyaluronic acid)或玻尿酸组合物的部分酯类或全酯类。

本发明内容的第二实施例提供了一种将聚乙二醇化药剂投予至有需要的个体体内目标位置的方法。该方法包含：

在对该个体投予聚乙二醇化药剂之前、同时或之后，投予一足够量的混合物，该混合物包含一抗聚乙二醇抗体及一水凝胶；

其中，水凝胶系选自玻尿酸、玻尿酸衍生物、胶原、明胶、纤网蛋白、纤维蛋白原、藻酸盐、几丁聚醣、纤维蛋白胶及合成生物兼容性聚合物所组成的群组；

抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合比例约为1:1(体积/体积)到1:100(体积/体积)；以及

至少对该个体投予二剂的聚乙二醇化药剂，且每剂间隔时间约为1小时到1周。

依据本发明内容的实施方式，将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物与聚乙二醇化药剂投予至不同的位置。在某些实施例中，将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物投予至特定的目标位置(例如肿瘤或缺血区域)，而将聚乙二醇化药剂投予至远程位置(例如肢体处)。另外，可以肌肉注射的方式投予包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，而以静脉注射的方式投予聚乙二醇化药剂。

在某些实施方式中，是在投予包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物后，对该个体投予至少二剂的聚乙二醇化药剂。在其他实施方式中，是对该个体投予至少三剂的聚乙二醇化药剂。

依据本发明内容较佳的实施方式，抗聚乙二醇抗体可以是免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)或免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)；较佳的情况是，抗聚乙二醇抗体是人类化(humanized)免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。水凝胶为玻尿酸或玻尿酸衍生物，其中玻尿酸的分子量约为20千道耳顿到2,000千道耳顿；较佳的情况是，约为50千道耳顿到1,800千道耳顿；最佳的情况是，约为1,500千道耳顿。依据某些实施方式，抗聚乙二醇抗体是免疫球蛋白G，而水凝胶是玻尿酸或玻尿酸衍生物，其中玻尿酸的分子量约为20千道耳顿到2,000千道耳顿；较佳的情况是，约为50千道耳顿到1,800千道耳顿；最佳的情况是，约为1,500千道耳顿。玻尿酸衍生物则可以是玻尿酸、经己二酸二酰肼修饰的玻尿酸、玻尿酸酰胺、交联玻尿酸、玻尿酸的重金属盐类、硫化玻尿酸、N-硫化玻尿酸、经胺类修饰的玻尿酸、经双胺修饰的玻尿酸或玻尿酸组合物的部分酯类或全酯类。

依据某些实施方式，本发明混合物中抗聚乙二醇抗体及玻尿酸或玻尿酸衍生物的比例约为1:3(体积/体积)到1:5(体积/体积)。在一实施方式中，混合物中抗聚乙二醇抗体及玻尿酸或玻尿酸衍生物的比例约为1:3(体积/体积)。在另一实施方式中，混合物中抗聚乙二醇抗体及玻尿酸或玻尿酸衍生物的比例约为1:4(体积/体积)。在再另一实施方式中，混合物中抗聚乙二醇抗体及玻尿酸或玻尿酸衍生物的比例约为1:5(体积/体积)。

聚乙二醇化药剂可以是任何聚乙二醇化药物；较佳的情况是，聚乙二醇化药剂为适用于治疗癌症或缺血性疾病的聚乙二醇化药物，其中该缺血性疾病包含，但不限于，中风、心肌梗塞或肢体缺血。肢体缺血可以是严重肢体缺血、急性肢体缺血或伯格氏病(Buerger's Disease)。

因此，本发明内容的第三实施例提供了一种上述混合物(即包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶)的用途，其可用以制备一种用以辅助聚乙二醇化药剂的佐剂，进而治疗罹患癌症或缺血性疾病的个体。

可在投予聚乙二醇化药剂之前、同时及/或之后，投予本发明包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，以此直接辅助聚乙二醇化药剂目标至诸如肿瘤或缺血等特定位置。

依据本发明内容的实施方式，将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物与聚乙二醇化药剂投予至不同的位置。在某些实施例中，将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物投予至特定的目标位置(例如肿瘤或缺血区域)，而将聚乙二醇化药剂投予至远程位置(例如肢体处)。另外，可以肌肉注射的方式投予包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，而以静脉注射的方式投予聚乙二醇化药剂。

较佳的情况是，至少投予2剂(例如2、3、4或5剂)的聚乙二醇化药剂，且每次投予的间隔时间约为1小时到1周(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或是2、3、4、5、6或7天)。在某些实施例中，投予3剂的聚乙二醇化药剂，且各剂的间隔时间约为8小时。在其他实施方式中，投予3剂的聚乙二醇化药剂，且各剂的间隔时间约为1周。依据某些实施方式，各次投予的聚乙二醇化药剂可以是相同或不同的聚乙二醇化药剂。

该个体可以是一哺乳类动物，例如人类。癌症可以是乳癌(breast cancer)、子宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、黑色素瘤(melanoma)、葡萄膜黑色瘤(uveal melanoma)、脑瘤(brain tumor)、肺癌(lung cancer)、肝癌(liver cancer)、淋巴癌(lymphoma)、神经上皮细胞瘤(neuroepithelioma)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胃癌(stomach cancer)、大肠直肠癌(colon cancer)、子宫癌(uterus cancer)、淋巴系统造血器官肿瘤(hematopoietic tumors of lymphoid lineage)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、甲状腺癌(thyroid cancer)、甲状腺滤泡癌(thyroid follicular cancer)、骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndrome,MDS)、间叶组织肿瘤(tumor of mesenchymal origin)、畸胎瘤(teratcarcinoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经胶质瘤(glioma)、神经胶母细胞瘤(glioblastoma)、角化棘皮瘤(keratoacanthoma)、间变性大细胞淋巴瘤(analplastic large cell lymphoma)、食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma)、滤泡树突状细胞癌(follicular dentritic cell carcinoma)、肠癌(intestinal cancer)、肌肉浸润性癌(muscle invasive cancer)、贮精囊瘤(seminal vesicle tumor)、表皮癌(epidermal carcinoma)、脾脏癌(spleen cancer)、头颈部癌(head and neck cancer)、胃癌(stomach cancer)、骨癌(bone cancer)、视网膜癌(cancer of retina)、胆道癌(biliary cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、子宫肉瘤(uterine sarcoma)、睪丸癌(cancer of testicles)、结缔组织癌(cancer of connective tissue)、前列腺肥大(prostatic hypertrophy)、骨髓增生异常(myelodysplasia)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、鼻咽癌(nasopharyngeal)、神经内分泌癌(neuroendocrine cancer)、中皮瘤(mesothelioma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、食胃道癌(esophagogastric)、输卵管癌(fallopian tube cancer)、腹膜癌(peritoneal cancer)、乳突浆液性米勒氏癌(papillary serous mullerian cancer)、恶性腹水(malignant ascites)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)、李-佛美尼症候群(Li-Fraumeni syndrome)或希佩尔-林道症候群(Von Hippel-Lindau syndrome,VHL)。

淋巴系统造血器官肿瘤可以是血癌(leukemia)、急性淋巴球白血病(acute lymphocytic leukemia)、慢性淋巴球白血病(chronic lymphocytic leukemia)、B细胞淋巴癌(B-cell lymphoma)、巴克斯淋巴癌(Burkitt’s lymphoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、霍奇金淋巴癌(Hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金淋巴癌(non-Hodgkin’s lymphoma)。骨髓性白血病可以是急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)或慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)。间叶组织肿瘤可以是纤维肉瘤(fibrosarcoma)或横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)。

缺血性疾病可以是中风、心肌梗塞或肢体缺血。肢体缺血可以是严重肢体缺血、急性肢体缺血或伯格氏病。

因此，本发明内容的第四实施例提供了一种用以治疗一罹患癌症或缺血性疾病的个体的方法；该方法包含投予该个体一足够剂量的包含上述抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，以及一有效量的聚乙二醇化药剂，以此减缓由癌症或缺血性疾病所引发的一或多种病症。在某些实施方式中，是投予二剂有效量的聚乙二醇化药剂。在其他实施方式中，是投予三剂有效量的聚乙二醇化药剂。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1是依据本揭示内容一实施例所绘示的结果，其关于抗聚乙二醇抗体AGP4可专一结合至聚乙二醇化的化合物；(A)聚乙二醇化的化合物可结合至以AGP4抗体涂布的孔洞；(B)相较于IgM，PEG-Qd800与AGP4的结合效率，以及Lipo-DOX与AGP4的结合效率；统计差异是与正常IgM组相比较，其中，**代表P<0.005，***代表P<0.001；

图2是依据本发明内容一实施例所绘示的结果，其关于PEG-Qd800于活体小鼠模式中的目标特性；(A)用以阐述皮下及静脉注射位置的示意图；(B)玻尿酸/AGP4及(C)PEG-Qd800的荧光表现量；在投予玻尿酸/AGP4及PEG-Qd800后的第1、4及7天，移除特定器官，(D)为特定器官的荧光表现量；(E)投予1剂玻尿酸/AGP4或玻尿酸至小鼠耳朵，并由静脉注射1剂PEG-Qd655，1.5及4小时后，所观测的活体影像；(F)定量PEG-Qd655的荧光表现量；统计差异是与玻尿酸治疗组(HA组)相比较，其中，*代表P<0.01，**代表P<0.005，***则代表P<0.001；

图3是依据本发明内容另一实施例所绘示的结果，其是关于投予多剂PEG-Qd800后的荧光分析；(A)用以阐述肌肉注射及静脉注射位置的示意图；(B)将玻尿酸/AGP4注入小鼠的右腿肌肉(注射腿)后，定量分析小鼠二腿肌肉组织的玻尿酸/AGP4及PEG-Qd800的荧光表现量；(C)为PEG-Qd800于不同器官的定量结果；(D)及(E)分别为注入PEG-Qd800(红色)及以Alex647标记的玻尿酸/AGP4(橘色)7天后，PEG-Qd800的荧光染色结果及荧光表现量，以肌旋蛋白(tropomyosin，绿色)来标记骨骼肌肉纤维，并以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，蓝色)来标记细胞核；比例尺为20微米；统计差异是与注射一次或非注射腿来相比较，其中，***代表P<0.001；

图4是依据本发明内容一实施例所绘示的结果，其是关于在缺血小鼠模式中，重复注射聚乙二醇化的类胰岛素生长因子-1(PEGylated Insulin growth factor-1,PEG-IGF-1,PEG-IGF-1)的治疗功效；(A)用以阐述注射时间点及位置的示意图；(B)及(C)分别为后肢缺血(hindlimb ischemia,HLI)外科手术后，经聚乙二醇化类胰岛素生长因子-1或生理食盐水治疗的小鼠的免疫荧光染色结果及其定量分析；以TUNEL染色(红色)来标记凋亡细胞，以麦芽凝集素(wheat germ agglutinin,WGA,绿色)来标记细胞膜凝集蛋白(lectin)，并以DAPI(蓝色)来标记细胞核；统计差异是与生理食盐水治疗组相比较，其中，*代表P<0.01，**代表P<0.005，而***则代表P<0.001。

图5是依据本发明内容另一实施例所绘示的结果，其是关于在缺血小鼠模式中，重复注射聚乙二醇化的颗粒球菌落刺激因子(PEGylated granulocyte colony-stimulating factor,PEG-G-CSF)的治疗功效；(A)用以阐述注射时间点及位置的示意图；(B)及(C)分别为后肢缺血外科手术后，经聚乙二醇化颗粒球菌落刺激因子治疗的小鼠的免疫荧光染色结果及其定量分析；以抗CD34(红色)及抗CD133(绿色)抗体来标记凋亡细胞，以DAPI(蓝色)来标记细胞核；统计差异是与生理食盐水治疗组相比较，其中，*代表P<0.01，**代表P<0.005，***则代表P<0.001；以及

图6是依据本发明内容再另一实施例所绘示的结果，其是关于合并治疗的治疗功效；(A)用以阐述注射时间点及位置的示意图；(B)利用雷射杜卜勒微流仪来侦测第0、1、3、7、14、21及28天各组小鼠的血流状况；(C)在引发后肢缺血后，小鼠于第3到28天的临床评估分析；(D)经后肢缺血外科手术后，投予合并治疗或生理食盐水，小鼠的免疫荧光染色结果；以抗植物凝集蛋白抗体(anti-isolectin antibody，红色)来标记血管，以抗肌旋蛋白抗体(绿色)来标记骨骼肌肉，并以DAPI(蓝色)来标记细胞核；(E)受伤部位的周边组织的血管密度量化图；统计差异是与生理食盐水治疗组相比较，其中，*代表P<0.01，**代表P<0.005，而***则代表P<0.001。

根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。

具体实施方式

为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，还可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

1.定义

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时也涵盖该名词的单数型。

在本说明书中，「治疗」(treatment)一词是指获得一期望的医药及/或生理功效，例如，抑制癌症生长或减缓器官(例如心脏)的缺血性损伤。该效果可以是预防性的，即完全或部分预防一疾病或其病征；及/或是治疗性的，即部分或完全治愈一疾病及/或其所造成的不适。「治疗」(Treatment)在本说明书包含预防、治疗或减缓一哺乳类动物(特别是人类)的疾病；该治疗包含：(1)预防、治疗或减缓一个体罹患一疾病(例如癌症或缺血性疾病)，其中该个体为罹患该疾病的高风险族群，或是已罹患该疾病而尚未确诊断定；(2)抑制一疾病(例如抑制其发生)；或(3)减轻一疾病(例如减轻与该疾病相关的征状)。

「聚乙二醇化」(PEGylated)化合物、治疗及/或药物在本说明书是指与聚乙二醇聚合物接合的化合物、治疗及/或药物。聚乙二醇化的化合物、治疗及/或药物通常包含胜肽、蛋白、抗体及纳米粒子(例如微脂体)等分子。

「抗聚乙二醇抗体」(anti-PEG antibody)一词在本说明书是指一种抗体，特别是一种单株抗体，可用以辨识/结合至聚乙二醇分子；意思是，该抗体可结合至聚乙二醇骨架的重复次单元，以此辅助聚乙二醇化的化合物(例如聚乙二醇化的抗癌药物或聚乙二醇化的抗缺血性药物)的作用。抗聚乙二醇抗体可以是免疫球蛋白G或免疫球蛋白M；较佳的情况是，抗聚乙二醇抗体是人类化的免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。可利用任何普通技术人员所熟知的方法来制备本发明内容的抗聚乙二醇抗体，举例来说，可利用Su等人(Bioconjugate Chemistry(2010)21,1264-1270.)所述的步骤来进行制备。

「投予」(administered、administering或administration)在本说明书中为可互换的词汇，且是指由传递模式来施予本发明的药剂(例如化合物或组合物)，其中该传递模式包含，但不限于，静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、动脉注射、皮下注射及穿皮注射。在本发明内容一实施方式中，是以肌肉注射将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合投予至个体，而利用静脉注射将聚乙二醇化药剂投予至个体。

「有效量」(effective amount)一词于本说明书中是指可对一疾病达到期望功效的剂量。举例来说，在治疗癌症时，可减缓、预防、延迟或抑制癌症相关病症的药剂(即化合物或组合物)即视为一有效药物。一药剂的有效量不必然可完全治愈一疾病或一病征，但可减缓或抑制该疾病或病征所产生的不适。有效量可分为一次、二次或多次投予，并以适当时间间隔。

「足够剂量」(sufficient amount)一词于本说明书中是指可延长一疗程的特定成份(例如抗聚乙二醇抗体)于活体中作用时间的剂量，以此使该特定成份可于活体中作用足够的时间，进而辅助疗程的活性药剂(例如聚乙二醇化的药物)目标至个体中特定部位(例如肿瘤部位或缺血区域)。在本发明内容较佳的实施方式中，投予个体一足够剂量的包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，其中该个体罹患一疾病(例如癌症或缺血性疾病)，且可以聚乙二醇化药剂(例如聚乙二醇化的抗癌药物或聚乙二醇化的抗缺血性药物)进行治疗；在该实施例中，于注射单剂混合物3天后，仍可于该个体体内侦测到抗聚乙二醇抗体的表现。

「佐剂」(adjuvant)一词于本说明书中是指一种药剂，该药剂本身不会产生治疗功效，却可辅助治疗药剂目标至个体的欲进行治疗的特定位置(例如缺血部位或肿瘤)。依据本发明内容较佳的实施方式，包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物可作为一种佐剂，据以辅助聚乙二醇化药剂(例如聚乙二醇化的抗癌药物或聚乙二醇化的抗缺血性药物)的作用，进而达到治疗个体的目的。

「个体」(subject)或「病患」(patient)是指包含人类的动物，其可接受本发明方法的治疗。除非特定指出单一性别，否则「个体」(subject)或「病患」(patient)同时意指雄性及雌性。因此，「个体」(subject)或「病患」(patient)包含任何可接受本发明治疗的哺乳类动物。

「癌症」(cancer)一词在本说明书中是指丧失正常细胞调控的恶性细胞，其具有非调控性生长、缺乏分化能力及可侵袭组织并转移等特性。癌症可生长于任何器官或组织中，且可以是乳癌(breast cancer)、子宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovary cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、黑色素瘤(melanoma)、葡萄膜黑色瘤(uveal melanoma)、脑瘤(brain tumor)、肺癌(lung cancer)、肝癌(liver cancer)、淋巴癌(lymphoma)、神经上皮细胞瘤(neuroepithelioma)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胃癌(stomach cancer)、大肠直肠癌(colon cancer)、子宫癌(uterus cancer)、淋巴系统造血器官肿瘤(hematopoietic tumors of lymphoid lineage)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、甲状腺癌(thyroid cancer)、甲状腺滤泡癌(thyroid follicular cancer)、骨髓增生不良症候群(myelodysplastic syndrome,MDS)、间叶组织肿瘤(tumor of mesenchymal origin)、畸胎瘤(teratcarcinoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、神经胶质瘤(glioma)、神经胶母细胞瘤(glioblastoma)、角化棘皮瘤(keratoacanthoma)、间变性大细胞淋巴瘤(analplastic large cell lymphoma)、食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma)、滤泡树突状细胞癌(follicular dentritic cell carcinoma)、肠癌(intestinal cancer)、肌肉浸润性癌(muscle invasive cancer)、贮精囊瘤(seminal vesicle tumor)、表皮癌(epidermal carcinoma)、脾脏癌(spleen cancer)、头颈部癌(head and neck cancer)、胃癌(stomach cancer)、骨癌(bone cancer)、视网膜癌(cancer of retina)、胆道癌(biliary cancer)、小肠癌(small bowel cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、子宫肉瘤(uterine sarcoma)、睪丸癌(cancer of testicles)、结缔组织癌(cancer of connective tissue)、前列腺肥大(prostatic hypertrophy)、骨髓增生异常(myelodysplasia)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、鼻咽癌(nasopharyngeal)、神经内分泌癌(neuroendocrine cancer)、中皮瘤(mesothelioma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、食胃道癌(esophagogastric)、输卵管癌(fallopian tube cancer)、腹膜癌(peritoneal cancer)、乳突浆液性米勒氏癌(papillary serous mullerian cancer)、恶性腹水(malignant ascites)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)、李-佛美尼症候群(Li-Fraumeni syndrome)或希佩尔-林道症候群(Von Hippel-Lindau syndrome,VHL)。淋巴系统造血器官肿瘤可以是血癌(leukemia)、急性淋巴球白血病(acute lymphocytic leukemia)、慢性淋巴球白血病(chronic lymphocytic leukemia)、B细胞淋巴癌(B-cell lymphoma)、巴克斯淋巴癌(Burkitt’s lymphoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、霍奇金淋巴癌(Hodgkin’s lymphoma)或非霍奇金淋巴癌(non-Hodgkin’s lymphoma)。骨髓性白血病可以是急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)或慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)。间叶组织肿瘤可以是纤维肉瘤(fibrosarcoma)或横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)。

「缺血性疾病」(ischemic disease)一词在本说明书中是指一种因动脉阻塞导致特定区域(例如心脏、肢体或脑部)的血流量减少的疾病。例示性的缺血性疾病包含，但不限于，中风、心肌梗塞或肢体缺血。「肢体缺血」(limb ischemia)一词在本说明书中是指一种会影响个体肢体的血流量的疾病，例如慢性肢体缺血(chronic limb ischemia,CLI)，其会引发严重肢体缺血，进而导致远程肢体截肢的危险；以及急性肢体缺血(acute limb ischemia,ALI)，其是于数小时内，因血流快速流失所引发的组织损伤。严重的肢体缺血常与糖尿病相关，影响血管功能并造成组织损伤。伯格氏病(Buerger's Disease)是一种慢性疾病，会影响血液流动至手部及脚部，因而造成手指及脚趾的损伤。诸如慢性肢体缺血及伯格氏病等肢体缺血通常会导致伤口愈合不良、溃烂及组织坏死，甚至造成非创伤性截肢。

2.实施例的详细说明

本发明内容部分是基于发明人首度发现水凝胶可将抗聚乙二醇抗体及/或聚乙二醇化药剂维持于个体体内的目标位置至少3天，以此对一有需要的个体投予多剂的聚乙二醇化药剂以进行治疗。相较于传统治疗仅能施予单剂的聚乙二醇化药剂，抗聚乙二醇抗体于个体体内持续性地存在/作用，可将聚乙二醇化药剂多次投予至该个体，此外，也可辅助聚乙二醇化药剂被目标至特定位置(即欲进行治疗的位置)，进而改善整体治疗功效。

因此，本发明内容的第一实施例提供了一种对一有需要的个体投予聚乙二醇化药剂以进行治疗的方法。该方法包含在投予聚乙二醇化药剂治疗之前、同时或之后，投予该个体一足够剂量的混合物，该混合物包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶；其中，抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合比例约为1:1到1:100(体积/体积)，水凝胶系选自玻尿酸、玻尿酸衍生物、胶原、明胶、纤网蛋白、纤维蛋白原、藻酸盐、几丁聚醣、由纤维蛋白原及凝血酶(thrombin)所组成的纤维蛋白胶及合成生物兼容性聚合物所组成的群组；且至少对该个体投予二剂的聚乙二醇化药剂，每剂间隔时间约为1小时到1周。

依据较佳的实施方式，水凝胶是一自然产物，例如玻尿酸或玻尿酸衍生物。玻尿酸是一种由N-乙酰葡萄胺糖(N-acetylglucosamine)及D-葡萄醣醛酸(D-glucuronic acid)的重复双醣单元(repeating disaccharide unit)所组成的阴离子、非硫化糖胺聚多糖(glycosaminoglycan)。玻尿酸是细胞外基质(extracellular matrix)不可或缺的必要成份，且被视为是一种免疫中性多醣(immuno-neutral polysaccharide)；因此，生医领域常利用玻尿酸进行各种不同的应用。双醣单元的组成数量会影响玻尿酸的分子量，该分子量可由20千道耳顿(kDa)到2,000千道耳顿；较佳的情况是，由50千道耳顿到1,800千道耳顿；更佳的情况是，由100千道耳顿到1,700千道耳顿。在本发明内容一较佳实施方式中，玻尿酸或其衍生物的分子量约为1,500千道耳顿。

玻尿酸的衍生物包含，但不限于，玻尿酸(hyaluronic acid)、经己二酸二酰肼修饰的玻尿酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、玻尿酸酰胺(amides of hyaluronan)、交联玻尿酸(crosslinked hyaluronic acid)、玻尿酸的重金属盐类(heavy metal salts of hyaluronic acid)、硫化玻尿酸(sulphated hyaluronic acid)、N-硫化玻尿酸(N-sulphated hyaluronic acid)、经胺类修饰的玻尿酸(amine-modified hyaluronic acid)、经双胺修饰的玻尿酸(diamine-modified hyaluronic acid)及玻尿酸组合物(例如玻尿酸及丝的组合物，以及与其他自然或合成物质交联的玻尿酸)的部分酯类或全酯类。可利用本所属领域普通技术人员所熟知的化学方法来修饰玻尿酸及/或与其他分子交联的玻尿酸的一或多功能基(例如羧酸基、氢氧基、还原端基及N-乙酰基)来制备玻尿酸衍生物。

在某些实施例中，水凝胶是由纤维蛋白原及凝血酶所组成的纤维蛋白胶，其中该凝血酶可在短时间内(例如10到60秒)将该纤维蛋白原转换为纤维素单体(fibrin monomer)，据以产生一三维(three-dimension)胶状结构。

依据其他实施方式，水凝胶是一合成产物，例如一合成生物兼容性聚合物；适用于本发明水凝胶的合成生物兼容性聚合物包含，但不限于，聚乙醇酸(poly(glycolic acid),PGA)、聚乳酸(poly(lactic acid),PLA)、聚氨酯(polyurethane,PU)、聚ε-己内酯(poly(ε-caprolactone))、聚乙烯醇(poly(vinyl alcohol),PVA)、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate,PCA)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、共聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚三亚甲基碳酸酯(poly(trimethylene carbonate),PTMC)、聚二甲基硅胶(polydimethylsiloxane,PDMS)、共聚乙烯-乙酸乙烯酯(poly(ethylene-co-vinyl acetate,PEVA)、共聚乙交酯-己内酯(poly(glycolide-co-caprolactone),PGCL)或共聚丙交酯-己内酯(poly(lactide-co-caprolactone),PLCL)。

水凝胶可通过抑制抗聚乙二醇抗体的代谢分解来延长其于个体体内的循环时间，进而将抗聚乙二醇抗体及聚乙二醇化药剂维持于目标位置较长的时间。依据本发明内容的实施方式，抗聚乙二醇抗体会被包覆于由玻尿酸所形成的胶状结构内，据以延长抗聚乙二醇抗体的半衰期(至少3天)；举例来说，可于个体体内延长3、4、5、6或7天。有鉴于抗聚乙二醇抗体的作用时间增加，可将聚乙二醇化药剂的投予次数由单次增加为多次(例如2、3、4、5或6次)，进而改善整体的治疗功效。在某些实施例中，是投予至少2剂的聚乙二醇化药剂。在其他实施例中，是投至予至少3剂的聚乙二醇化药剂。各次投予约间隔1小时到1周；例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或是2、3、4、5、6或7天。依据某些实施方式，投予聚乙二醇化药剂的间隔时间约为4小时，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或是2、3、4、5、6或7天。依据其他实施方式，投予聚乙二醇化药剂的间隔时间约为8小时，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或是2、3、4、5、6或7天。依据其他实施方式，投予聚乙二醇化药剂的间隔时间约为7天，例如7、8、9、10、11或12天。

通过混合抗聚乙二醇抗体及水凝胶来制备包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物，其中抗聚乙二醇抗体及水凝胶的比例约为1:1到1:100(体积/体积)，例如约为1:1到1：50(体积/体积)，或是1:1到1：20(体积/体积)。较佳的情况是，抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合比例约为1:3到1：5(体积/体积)，例如约为1：3(体积/体积)，约为1:4(体积/体积)或约为1:5(体积/体积)。更佳的情况是，抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合比例约为1:4(体积/体积)。一般来说，包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物可作为聚乙二醇化药剂的佐剂，意即，该混合物本身不会对疾病产生任何治疗功效，但会辅助聚乙二醇化药剂被目标至个体内的特定位置。

因此，该混合物可与任何聚乙二醇化药剂共同使用；适当的聚乙二醇化药剂包含，但不限于，佩格西施(Pegasys，一种聚乙二醇化的干扰素-α2A，可用以治疗B型或C型慢性肝炎)、聚乙二醇肽(Peginsatide，一种用以治疗与慢性肾脏疾病相关的贫血的聚乙二醇化药剂)、聚乙二醇重组尿酸酶(Pegloticase，一种用以治疗痛风的聚乙二醇化尿酸酶)、赛妥珠单株抗体(Certolizumab pegol，一种用以治疗中度至重度类风显性关节炎、克罗氏病或发炎型胃肠道疾病的聚乙二醇化单株抗体)、甲氧基聚乙二醇-依泊亭β(Methoxy PEG-epoetin beta，一种用以治疗与慢性肾脏疾病相关的贫血的聚乙二醇化红血球生成素)、派加他尼(Pegaptanib，一种用以治疗与血管新生相关的黄斑部病变的聚乙二醇化药剂)、培非格司亭或倍血添(Pegfilgrastim或Neulasta，一种用以治疗癌症化疗所导致的嗜中性球减少症的聚乙二醇化重组甲硫胺酰基人类颗粒球菌落刺激因子)、培维索孟(Pegvisomate，一种用以治疗肢端肥大症的聚乙二醇-人类生长荷尔蒙突变蛋白(mutein)拮抗剂)、艾霉素微脂体(Doxorubicin liposome，一种包含艾霉素，可用以治疗癌症的聚乙二醇化微脂体)、培门冬酶(Pegasparqase，一种用以治疗急性淋巴细胞性白血病的聚乙二醇化L-天门冬酰胺酶)、培加酶牛(Pegademase bovine，一种用以治疗严重合并性免疫不全病(severe combined immunodeficiency disease,DSID)的聚乙二醇化腺苷去胺酶)及聚乙二醇化的抗缺血性药剂，例如聚乙二醇化机械生长因子(PEGylated Mechano growth factor,PEG-MGF)及聚乙二醇化颗粒球菌落刺激因子(PEGylated granulocyte colony-stimulating factor,PEG-G-CSF)。在一较佳实施方式中，聚乙二醇化药剂是聚乙二醇化艾霉素微脂体。在另一较佳实施方式中，聚乙二醇化药剂是聚乙二醇化机械生长因子与聚乙二醇化颗粒球菌落刺激因子的组合物。

依据某些实施方式，每次投予的聚乙二醇化药剂可以是相同或不同的聚乙二醇化药剂。另外，可将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物与聚乙二醇化药剂投予至个体的不同位置。在一实施例中，系将包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物以肌肉注射方式投予至缺血位置(例如心肌梗塞位置)，而将聚乙二醇化药剂以静脉注射方式投予至肢体部位(例如手臂或腿)。

具体来说，本发明内容提供了一种用以治疗罹患缺血性疾病的个体的方法。该方法包含投予该个体一足够剂量的本发明混合物，及一有效量的聚乙二醇化药剂(例如聚乙二醇化抗缺血性药剂)，其中该聚乙二醇化药剂以至少8至24小时的间隔时间投予至少2次；以此减缓缺血性疾病所造成的一或多种病症。

该个体可以是一哺乳类动物，较佳的情况为一人类；而缺血性疾病可以是中风、心肌梗塞或肢体缺血。在一实施方式中，需进行治疗的缺血性疾病是心肌梗塞。在另一实施方式中，需进行治疗的缺血性疾病是肢体缺血，其中该肢体缺血可以是严重肢体缺血、急性肢体缺血或伯格氏病。

在某些实施方式中，至少对该个体投予2次的聚乙二醇化抗缺血性药剂。在其他实施方式中，至少对该个体投予3次的聚乙二醇化抗缺血性药剂。

本发明内容还包含一种用以治疗一罹患癌症的病患的方法。该方法包含投予该个体一足够剂量的本发明混合物，及一有效量的聚乙二醇化抗癌药物，其中该聚乙二醇化抗癌药物以至少1周的间隔时间投予至少2次；以此减缓癌症所造成的一或多种病症。

该个体可以是一哺乳类动物，较佳的情况为一人类；而癌症可以是乳癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、葡萄膜黑色瘤、脑瘤、肺癌、肝癌、淋巴癌、神经上皮细胞瘤、肾癌、前列腺癌、胃癌、大肠直肠癌、子宫癌、淋巴系统造血器官肿瘤、骨髓性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓增生不良症候群、间叶组织肿瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、神经胶母细胞瘤、角化棘皮瘤、间变性大细胞淋巴瘤、食管鳞状细胞癌、滤泡树突状细胞癌、肠癌、肌肉浸润性癌、贮精囊瘤、表皮癌、脾脏癌、头颈部癌、胃癌、骨癌、视网膜癌、胆道癌、小肠癌、唾液腺癌、子宫肉瘤、睪丸癌、结缔组织癌、前列腺肥大、骨髓增生异常、华氏巨球蛋白血症、鼻咽癌、神经内分泌癌、中皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、食胃道癌、输卵管癌、腹膜癌、乳突浆液性米勒氏癌、恶性腹水、胃肠道间质瘤、李-佛美尼症候群或希佩尔-林道症候群。

淋巴系统造血器官肿瘤可以是血癌、急性淋巴球白血病、慢性淋巴球白血病、B细胞淋巴癌、巴克斯淋巴癌、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴癌或非霍奇金淋巴癌。骨髓性白血病可以是急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。间叶组织肿瘤可以是纤维肉瘤或横纹肌肉瘤。

在某些实施方式中，至少对该个体投予2次的聚乙二醇化抗癌药物。在其他实施方式中，至少对该个体投予3次的聚乙二醇化抗癌药物。

可利用任何能有效传递本发明混合物(即包含抗聚乙二醇抗体及水凝胶的混合物)及聚乙二醇化治疗的方法，将本发明混合物及聚乙二醇化治疗投予至一哺乳类动物(较佳为一人类)的适当或特定的位置；举例来说，可以通过口服、鼻腔、胸腔、穿皮或非口服(例如直肠、长效制剂、皮下、静脉、肌肉、鼻内、小脑、眼溶液或软膏)等方法投予。此外，可同时或个别地将本发明组合物及聚乙二醇化治疗投予至个体的相同或不同的位置。

较佳地，可将本发明混合物配制为液体医药组合物，其可以是无菌溶液或悬浮液；举例来说，该液态医药组合物可以通过静脉、肌肉、皮下或腹腔注射给予。为给予无菌的注射液或悬浮液，适合的稀释液或溶剂包含却不限于1,3-丁二醇(1,3-butanediol)、甘露醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)及等渗压氯化钠溶液(isotonic sodium chloride solution)。制备可注射物也可使用脂肪酸，例如油酸(oleic acid)及其甘油酯衍生物(glyceride derivatives)，或是自然中药学上可接受的油，例如橄榄油(olive oil)或蓖麻油(castor oil)。该些油溶液或悬浮液也可以包含乙醇稀释剂或羧甲纤维素(carboxymethyl cellulose)或相似的分散剂(dispersing agents)。为配制目的，也可使用常用的表面活化剂(surfactants)，例如聚山梨醇酯(Tweens)、聚山梨糖醇单油酸酯(Spans)、其他相似的乳化剂或常用于施予药学上可接受剂型的生物可利用增强剂(bioavailability enhancers)。若采口服方式投予，则可将本发明混合物配制为液体或固体的形式。

当可想见，本发明混合物的投予剂量会随着病患的不同而有所不同，并因应选用的抗聚乙二醇抗体或聚乙二醇化治疗、投予路径及聚乙二醇化治疗于病患体中所欲产生的治疗功效进行调整；此外，本发明混合物的投予剂量还取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如患者体重、年龄或性别)、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质、特殊的饮食，以及其余普通技术人员所能想见的变因；本发明混合物最终的适用剂量应由主治医师进行判断。可调整疗程剂量以产生期望的治疗反应。较佳的是，投予本发明混合物适当的剂量，并依续投予至少1剂(例如2、3、4或更多剂，只要抗聚乙二醇抗体仍存在于个体体内，且可将聚乙二醇化药剂目标至目标位置)的聚乙二醇化治疗，以改善治疗反应。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些态样，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。根据相关信息本领域普通技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

制备以荧光标记的AGP4及玻尿酸水凝胶(hydrogel)

依据Su,Y.C.等人所述的步骤(Bioconjugate Chemistry,2010,21,1264-1270)，将源自聚乙二醇的蛋白注入雌性BALB/c小鼠体内，藉以产生AGP4抗体(一种可用以辨识/结合聚乙二醇的IgM单株抗体)。将玻尿酸粉末(1,500千道耳顿,Creative PEGworks,Winston-Salem,NC,美国)溶于生理食盐水中，以0.22微米的滤网过滤后，置于4℃以形成2％(重量/体积)的玻尿酸水凝胶。依据操作使用方式，将Alexa Fluor 647(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)与AGP4进行接合，接合比例为40:1(重量/重量)。均匀混合与Alexa Fluor 647接合的AGP4及玻尿酸，混合比例为1:4(体积/体积)；之后将混合物置于4℃，以形成最终产物－2％(重量/体积)的玻尿酸-AGP4水凝胶。

三明治式酵素结合免疫吸附分析法(sandwich enzyme linked immunosorbent assay,sandwich ELISA)

依据Su,Y.C.等人所述的步骤(Bioconjugate Chemistry,2010,21,1264-1270)来进行三明治式酵素结合免疫吸附分析法。简单来说，先将每毫升5微升的AGP4及正常小鼠IgM抗体(Jason Lab,美国)涂布至96孔盘中，再将以序列稀释缓冲液稀释的PEG-Qdot 800及Lipo-Dox(每孔洞50微升)加入盘中，于室温反应2小时。分别以PBS-T(包含0.1％妥文-20的生理食盐水)及生理食盐水洗涤3次及2次后，依序加入每孔洞50微升的侦测抗体(每毫升5微克，3.3-生物素)及每毫升0.5微克的与山葵过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)接合的卵白素，置于室温反应1小时。分别以PBS-T及生理食盐水洗涤6次及2次后，加入每孔洞100微升的ABTS受质(每毫升0.4毫克的2,2′-次偶氮基-双(3-乙基苯-6-磺酸(2,2′-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))、0.003％H₂O₂及100mM的磷酸柠檬酸(phosphate citrate,pH 4.0))，于室温作用30分钟。以微盘分析仪测量各孔洞于405纳米时的吸光值。

实验动物

所有的动物实验皆是依照中央研究院实动物委员会的规范进行操作。由国家实验动物中心购买成年雌性FVB小鼠(6到8周大，平均体重约为25克)，简单来说，在进行外科手术操作及活体试验前，皆先以舒泰(Zoletil,每公斤12.5毫克,Virbac,Carros,法国)及龙朋(Rompun,每公斤0.2毫升,Bayer Healthcare,Kiel,德国)麻醉小鼠。

活体荧光表现及定量

将本发明的2％玻尿酸-AGP4水凝胶以皮下注射方式注入小鼠正面的3个不同的位置(每部位皆为50微升)，或是以肌肉注射方式注入小鼠左腿的3个不同的位置(每部位皆为50微升，总体积为150微升)；之后立即以静脉注射方式投予PEG-Qdot 800。此外，为证实本发明2％玻尿酸-AGP4水凝胶具有重复投予的功效，分3次投予PEG-Qdot 800。以Xenogen IVIS光谱仪(PerkinElmer,Waltham,MA,美国)来过滤检测小鼠影像。计算特定区域(regions of interest,ROI)中光子的数量来分析荧光表现量，再将所得的表现量扣除对照组的自体荧光表现量，以获得最终定量结果。

后肢缺血(hindlimb ischemia,HLI)及治疗的动物模式

将小鼠的左侧股动脉及胯骨动脉进行结扎后切断，以引发肢缺血模式(Limbourg et al.,Nat.Protocols(2009)4,1737-1748)。分别将聚乙二醇化类胰岛素生长因子-1(PEG-IGF-1)、聚乙二醇化颗粒球菌落刺激因子(PEG-G-CSF)及合并治疗投予至实验动物。各治疗组包含：对照组、生理食盐水治疗组、2％玻尿酸治疗组、AGP4治疗组及玻尿酸-AGP4治疗组，各治疗皆系以肌肉注射方式投予至4个不同的缺血部位(每部位皆为50微升，总体积为200微升)；之后，注入治疗药物。

血流测试

利用雷射杜卜勒显像仪(laser Doppler imager,Moor Instrument,英国)来测量微血管的血流状态。计录双肢于外科手术前后的血流量。以缺血肢体(左侧)与正常肢体(右侧)的血流比例来表示结果。

免疫荧光染色

将固定的远程小腿及大腿肌肉进行脱蜡及脱水后，置于10mM柠檬酸钠(pH 6.0)中煮沸10分钟；之后，与抗肌旋蛋白抗体(anti-tropomyosin antibody,DHSB,Iowa city,Iowa,美国)、抗麦芽凝集素抗体(anti-WGA antibody)及抗植物凝集蛋白抗体(anti-isolectin antibody,Invitrogen,Grand Island,NY,美国)于4℃作用至隔日；再加入与Alexa Fluor 488-或568-接合的二级抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)。以DAPI(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)染色后，将组织封片，并利用共轭焦显微镜(LSM 700,Carl Zeiss MicroImaging,德国)及荧光显微镜进行观察分析。随机选取各检体中8个缺血的部位，检测并计算其边缘区域的微血管及小动脉的密度及数量(200倍放大)；之后再平均所得数值。

后肢缺血后小鼠的临床分析

依据Lai,C.Y.等人所述的步骤(Biomacromolecules(2013)15,564-573)来分析评估小鼠在接受不同治疗后的临床病征。该评估是基于小鼠每日的活动力及后肢状况来进行分析；评分依序为0(正常)、1-3(肌肉萎缩)、4-5(产生坏疽)及6(肢体截断)。

统计分析

除非另有所指，否则所有的统计皆是以平均值±标准偏差(mean±standard deviation)来表示；在进行活体外光谱分析时，小鼠只数为3；在进行活体荧光表现及定量分析时，小鼠只数为6；在进行后肢缺血模式及治疗的实验时，小鼠只数为8。为多重比较，以变异数ANOVA及Bonferroni调整来进行分析。当所得机率值P＜0.05时，则视为具有统计差异。

实施例1建立可多次投予聚乙二醇化的化合物，并以抗聚乙二醇抗体及玻尿酸进行辅助治疗的动物模式

1.1抗聚乙二醇抗体可专一结合至聚乙二醇化的化合物

在本实施例中，将利用三明治式酵素结合免疫吸附分析法来分析聚乙二醇化化合物(即聚乙二醇化QDot,PEG-Qd800)与抗聚乙二醇抗体(即AGP4)的结合特性(第1A图)及结合效率(第1B图)。

如第1A图所示，PEG-Qd800不会与未涂布的孔洞(●)或以正常IgM涂布的孔洞(■)反应。相较之下，于以AGP4涂布的孔洞则可明显观察到与剂量呈正相关的吸光值。也即，当PEG-Qd800的量增加时，AGP4-PEG-Qd800复合体(▲)的吸光值也会增加。该结果也可见于利用聚乙二醇化的包含艾霉素的微脂体(PEG-Lipo)所进行的测试；唯在该试验中，当浓度到达10nM(▼)后，吸光值即趋于饱和。相较于IgM，可观察到AGP4抗体可以相似的结合效率结合至PEG-Qd800或Lipo-DOX(第1B图)。

此外，不论是于活体外或活体内，AGP4(包覆于玻尿酸水凝胶中)及聚乙二醇化化合物皆会分别发散不同的荧光讯号(结果未显示)；其中，与Alexa 647染剂所标记的AGP4及PEG-Qd800的激发波长分别为605纳米及465纳米。

1.2 PEG-Qd800于活体内的目标特性

本实施例将检测聚乙二醇化化合物(即PEG-QDs)于活体内的目标特性，其中先将单一剂玻尿酸+AGP4以皮下注射的方法投予至小鼠的3个不同位置，10分钟后再由尾静脉注入1剂PEG-Qd800(第2A图)。

相较于对照组及仅投予玻尿酸的组别，可于第1到3天明显观察到由AGP4所发散的荧光讯号，玻尿酸组的荧光讯号则极为微弱。相较之下，投予PEG-Qd800s的小鼠则可于第1到6天观察到逐渐减弱的荧光讯号。此外，不同于玻尿酸组，经皮下投予至3个不同位置的AGP4皆可有效吸引及增加PEG-Qd800s的停留时间。虽然PEG-Qd800s的讯号也可见于1处皮下注射位置，但该讯号仅可持续1天。第2B及2C图分别定量并总结玻尿酸/AGP4或PEG-Qd800的荧光表现量。

由第1、4及7天所分离的器官来分析荧光值，结果显示，相较于其他器官，PEG-Qd800s主要会表现于肝脏(第2D图)。不同天数之间的差异并不明显，且不论在何种器官，玻尿酸组及玻尿酸/AGP4组间也无显著差异。然而，在AGP4注射位置(AGP4_位置)则可观察到显著的差异。相较于玻尿酸组，于第1及4天皆可观察到，注射玻尿酸/AGP4的位置会明显产生较高的PEG-Qd800讯号。也利用活体显微镜来确认该目标特性；如第2E图所示，以静脉注射PEG-Qd6551.5小时后，可利用荧光异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate,FITC)滤片观察到由玻尿酸/AGP4水凝胶或玻尿酸水凝胶所发散的荧光讯号，显示循环的PEG-Qds会穿透血管壁，并停留于玻尿酸/AGP4水凝胶周围。相较之下，于玻尿酸组投予PEG-Qds 1.5到4小时后，PEG-Qds会卡在血管内；结果指出，相较于玻尿酸组，投予玻尿酸/AGP4可显著增加PEG-Qd655的荧光强度(第2F图)。

1.3以抗聚乙二醇抗体及玻尿酸辅助多次投予聚乙二醇化化合物

本实施例将评估在抗聚乙二醇抗体及玻尿酸的辅助下，是否可多次投予个体聚乙二醇化化合物(即PEG-QD800)。因此，在投予抗聚乙二醇抗体及玻尿酸后，多次注入PEG-QD800，藉以观测PEG-QD800的荧光强度。具体来说，于第0天将单一剂玻尿酸+AGP4以肌肉注射方式投予至小鼠的右腿，接着将第1剂PEG-Qd800从静脉注入小鼠体内；于接下来的二天，分别将第2剂及第3剂的PEG-Qd800由静脉投予至小鼠。第3图阐述该些结果。

在将玻尿酸+AGP4注射至小鼠的右腿肌肉后，可观察到即使到了第3天，仍可于右腿肌肉观察到AGP4的讯号。相似地，也可于第3天观察到多次注射的PEG-QD800的荧光表现，唯，于第7天并无法观察到任何讯号值。此外，相较于其他二组，接受3剂注射的小鼠会表现较强的PEG-Qd800s讯号，且于第7天仍可观察到该讯号表现(结果未显示)。将PEG-Qd800讯号定量后可发现，接受3剂注射的小鼠的荧光强度会显著地较其他二组小鼠高出许多(第3B图)。再者，对于接受3剂注射的小鼠而言，于不同天所侦测到的荧光讯号并不具有显著的差异。该结果指出，于不同天投予的PEG-Qd800s，多数会聚集于玻尿酸/AGP4注射位置附近。

接着，通过评估PEG-Qd800讯号于腿肌肉、心脏、肝脏、肺脏、脾脏及肾脏等不同组织器官的表现量，来进一步分析玻尿酸/AGP4的生理功能。由分别接受1或3剂的PEG-Qd800s注射的小鼠分离出特定器官、左腿及右腿后，进行定量分析(第3C图)。相较于左腿肌肉(非注射腿)，右腿肌肉(注射腿)具有较强的玻尿酸/AGP4讯号；也即，注射于右腿肌肉的玻尿酸/AGP4至少会于注射位置停留7天。即使左腿肌肉会因体循环而表现少量的PEG-Qd800s，右腿肌肉仍会具有显著较高量的PEG-Qd800s讯号(第3C图)。除了肝脏及脾脏，测量到的PEG-Qd800讯号与右腿肌肉所发散的讯号并无显著差异。不论是投予1或3剂的PEG-Qd800s的小鼠，在第7天时，于其肝脏皆可观察到强烈的荧光讯号；然而，相较于接受注射的右腿肌肉，其他器官仅具有微弱的聚乙二醇化化合物表现量。因此，该结果指出，投予玻尿酸+AGP4可显著地将由静脉注入的PEG-Qd800s保留于注射位置。此外，在第1剂及第3剂注射间，于右腿肌肉所观察到的PEG-Qd800s讯号进一步指出，初始注入的玻尿酸+AGP4可持续性地将后续注射的PEG-Qd800s保留于注射位置附近。

为定量第7天组织的PEG-Qd800s表现量，将包含玻尿酸/AGP4注射位置的右腿肌肉进行免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)分析。相较于接受3剂注射的小鼠，仅接受1剂注射的小鼠明确具有较低的PEG-Qd800s染色(第3D图)。此外，于小鼠右腿肌肉(对照组，未接受玻尿酸+AGP4的治疗)并无法观察到任何PEG-Qd800s的染色。第3E图进一步定量各组小鼠于注射位置的PEG-Qd800s表现量。

总结上述，该结果确认以静脉注射的PEG-Qd800s会停留于玻尿酸+AGP4注射位置，而不会分散至其他器官。

实施例2多次注射聚乙二醇化的类胰岛素生长因子-1(PEGylated Insulin growth factor-1,PEG-IGF-1)可减少玻尿酸/AGP4注射位置的细胞死亡

为确认多次将聚乙二醇化的抗缺血性化合物注射于玻尿酸/AGP4注射位置是否可改善缺血性损伤(例如增加缺血区域的血流量或减少缺血区域的细胞死亡)，分别对实施例1所述的后肢缺血动物投予玻尿酸+AGP4及聚乙二醇化化合物(即PEG-IGF-1)或对照载体；接着利用雷射杜卜勒或影像来观察血流量，进而分析聚乙二醇化化合物于缺血损伤的疗效。第4A图是用以阐述本实施例的疗程的示意图。具体来说，在产生后肢缺血性损伤后，于第1天投予玻尿酸及抗聚乙二醇抗体(即HA/AGP4)，10分钟后投予第1剂的PEG-IGF-1(30微克)，并于第1天进行HLI后及第2天分别投予第2剂及第3剂的PEG-IGF-1。3剂间的投予均间隔8小时。持续监测缺血区域的血流量，并于小鼠死亡后取出注射腿的肌肉组织，进行染色以分析缺血区域的细胞凋亡程度。第4B及4C图分别阐述该些结果。

外科手术后的血流量结果指出，在第1天或第2天时，相较于正常对照组，玻尿酸组(HA组)或玻尿酸/AGP4(HA/AGP4)+生理食盐水组并不具有显著的改善功效。此外，也可观察到玻尿酸组及玻尿酸/AGP4+生理食盐水组的小鼠，指甲颜色会逐渐转变为黑色。相较之下，于合并治疗组(即玻尿酸/AGP4治疗后投予PEG-IGF-1)则不会看到该现象。因此，即使玻尿酸/AGP4治疗并不会在注射PEG-IGF-1后显著改善缺血部位的血流量，该治疗至少可减少缺血性损伤(结果未显示)。

IGF-1已知可增加细胞存活率，进而利用TUNNEL试验来检测缺血腿部肌肉的玻尿酸/AGP4注射位置的细胞凋亡数量(第4B及4C图)。在缺少AGP4的情况下，投予PEG-IGF-1不会减少玻尿酸组小鼠的凋亡细胞数量。相似地，注入生理食盐水也不会改善玻尿酸/AGP4组小鼠的细胞存活率。相较之下，在投予玻尿酸+AGP4后，以PEG-IGF-1进行治疗的小鼠，其细胞凋亡的数量则会显著地降低；也即，本发明的玻尿酸/AGP4系统可辅助延长PEG-IGF-1的治功效。

本实施例的结果确认了玻尿酸于延长抗聚乙二醇抗体的作用时间的用途，以此对有需要的个体多次投予聚乙二醇化治疗。

实施例3保留于玻尿酸/AGP4注射位置的聚乙二醇化颗粒球菌落刺激因子(PEGylated granulocyte colony-stimulating factor,PEG-G-CSF)可吸引细胞聚集

在本实施例中，是利用PEG-G-CSF作为另一种聚乙二醇化化合物，以评估该化合物于实施例1所述的后肢缺血模式中，在玻尿酸/AGP4注射位置的治疗功效，并利用雷射杜卜勒或影像来观察PEG-G-CSF于缺血区域的作用。

图5A是用以阐述本实施例的疗程的示意图。具体来说，在产生后肢缺血性损伤后，于第1天投予玻尿酸或玻尿酸+AGP4(即抗聚乙二醇抗体)，10分钟后投予第1剂的PEG-G-CSF，并于投予第1剂的24小时后(第2天)，投予第2剂PEG-G-CSF，再于第3天投予第3剂PEG-G-CSF。持续监测缺血区域的血流量，并于小鼠死亡后取出注射腿的肌肉组织，进行染色以分析缺血区域的细胞凋亡程度。第5B及5C图分别阐述该些结果。

相较于正常的腿部组织，可观察到后肢缺血会使缺血区域减少约80％的血流量。在第1天及第4天时，可观察到以玻尿酸或玻尿酸+AGP4治疗并无法有效增加缺血区域的血流量；且可观察到玻尿酸组及玻尿酸/AGP4+生理食盐水组的小鼠指甲颜色的转变，而不会在玻尿酸/AGP4+PEG-G-CSF组中观察到类似的现象(结果未显示)。

还检测PEG-G-CSF于玻尿酸/AGP4注射位置的吸引造血干细胞(haemopoietic stem cell,HSC)及内皮前趋细胞(endothelial progenitor cell,EPC)聚集的能力(第5B及5C图)。相较于玻尿酸组及生理食盐水对照组，投予PEG-G-CSF可增加造血干细胞(CD133)及内皮前趋细胞(CD34)聚集于玻尿酸/AGP4注射位置。

实施例4合并投予聚乙二醇化的药物可增加微血管形成

有鉴于PEG-IGF-1及PEG-G-CSF的治疗作用不同，因此本实施例将检测连续投予二种聚乙二醇化治疗至后肢缺血小鼠的玻尿酸/AGP4注射位置，以此评估整体的治疗功效。

图6A是用以阐述本实施例的实验步骤的示意图，其在不同的时间点分别投予PEG-IGF-1及PEG-G-CSF。相较于正常对照组或生理食盐水对照组，接受二种治疗的玻尿酸/AGP4组的小鼠，在第14天可观察到血流量具有显著的改善(第6B图)。在第21及28天还可观察到生理食盐对照组与接受合并治疗的小鼠的血流量具有显著的差异。此外，在第28天时，可观察到接受合并治疗的小鼠与正常对照组的小鼠具有相似的血流量。生理食盐水对照组在28天的观察期间还可观察到血流量的改善，唯该些小鼠会在第7天出现肌肉萎缩的病症，并于第21天出现脚趾坏死的状况(第6C图)。相较之下，在玻尿酸/AGP4+合并治疗组的小鼠的脚趾外观则与正常对照组相似。

为更进一步确认合并治疗是否可改善玻尿酸/AGP4注射位置的血流量，将包含注射位置的组织进行血管染色(第6D及6E图)。与正常对照组相似，接受合并治疗的小鼠的荧光染色显示缺血组织具有大量的微血管。相较之下，生理食盐水对照组的小鼠仅可于染色组织观察到少量的微血管。

上述实施例的结果确认同时投予玻尿酸及抗聚乙二醇抗体可延长抗聚乙二醇抗体于目标位置的作用时间，据此可对个体投予多次(例如2到3次)聚乙二醇化治疗，进而改善治疗功效。

虽然上文实施方式中公开了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更改与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。