一种预防和治疗神经系统疾病的猪脑多肽及其制备方法
【专利摘要】一种猪脑多肽，该多肽的分子量在1000～4000道尔顿，多肽中含亮氨酸19％～21％、赖氨酸16％～18％、谷氨酸16％～18％，丙氨酸11％～13％、精氨酸9％～11％，天冬氨酸7％～9％，缬氨酸6％～8％、异亮氨酸6％～8％。本发明的多肽具有良好的自由基清除能力。
【专利说明】一种预防和治疗神经系统疾病的猪脑多肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质多肽领域，具体涉及一种从猪脑中提取的多肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着世界人口老龄化，神经细胞毒性损伤导致的疾病也越来越多。特别是像阿尔 兹海默病（即老年性痴呆）、帕金森病（PD)等类型的疾病，目前尚没有其病理特征治疗的药 物和方法。对于老年痴呆，虽然有些安神、醒脑、镇静的药物具有一定的缓解病症的作用，但 疗效并不显著，美国FDA通过治疗老年性痴呆的药物主要有乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA受 体拮抗剂两类，这两类药物仅对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善和延缓痴 呆进展，并无法治愈。大量研宄资料表明，肽类可增加记忆能力，具有神经保护作用，通过动 物实验证实，在治疗神经损伤方面有良好效果。在神经退行性病变的组织培养中表现出显 著地神经保护作用。
[0003] 神经系统疾病是一个长期慢性疾病，发病过程中特征不明显，常常被忽略导致神 经细胞不可逆的损伤，以至于危及生命。因此研发一种天然健康，具有预防神经系统损伤的 多肽粉就非常有实用意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种猪脑多肽，该多肽的分子量在1000?4000道尔顿，多肽 中含亮氨酸19%?21%、赖氨酸16%?18%、谷氨酸16%?18%，丙氨酸11 %?13%、精 氨酸9%?11%，天冬氨酸7%?9%，缬氨酸6%?8%、异亮氨酸6%?8%。
[0005] 本发明的多肽，是通过以下的方法制备的：
[0006] (1)分离提取：取猪脑，加入5%的乙醇水溶液，5%乙酸调pH值至3?5,捣碎，过 滤，重复上述操作一次，取滤渣，得胶状物；
[0007] (2)水解：取步骤⑴胶状物，控制pH值在7. 0?10. 0,加入胰蛋白酶，37°C保温 5?7小时，90°C加热灭活酶，控制pH值在6. 5?7. 5、温度在50?60°C，加入木瓜蛋白酶， 以速度100?300r/min搅拌0. 5?1. 5小时，进行反应，保温5?10小时，煮沸5?60min， 灭活酶，结束反应，过滤，5000?10000r/min离心，收集上清液，过滤，减压干燥得干粉；。
[0008] (3)纯化：取干粉，置于阴离子交换柱，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱，在波长 238nm处测定吸光度，以吸收峰来收集洗脱液，浓缩，干燥，得猪脑多肽。
[0009] 根据本发明的多肽，所述猪脑为新鲜或冷冻猪脑。
[0010] 根据本发明的多肽，所述步骤（2)中控制溶液pH值具体实施为：0. 1?2. Omol/L 氢氧化钠溶液调pH值至7. 0?10. 0 ;0. 1?2. 0mol/L盐酸溶液调pH值至6. 5?7. 5。 [0011] 根据本发明的多肽，所述步骤（2)中胰蛋白酶占步骤（1)胶状物重量比为0. 3%? 0. 7%，优选0. 5%，木瓜蛋白酶用量为胶状物重量的0. 1 %?0. 5%，优选0. 3%。
[0012] 根据本发明的多肽，所诉步骤（3)中阴离子交换柱填料为DEAE sepharose FF，所 洗脱下来的多肽组分为阴离子交换柱中的第2、3、4吸收峰的洗脱组分。
[0013] 根据本发明的多肽，所诉步骤（3)中氯化钠的浓度为0. 1?I. Omol/L。
[0014] 根据本发明的多肽，所诉步骤（3)中干燥的温度为50°C?55°C。
[0015] 本发明的多肽对神经细胞培养液中NO及NOS的影响试验表明能够明显降低细胞 NO含量及抑制NOS活性。清除自由基试验表明所述多肽有良好的自由基清除能力。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述。
[0017] 实施例1
[0018] 取猪脑，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一 次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物lkg，控制ph值在8. 2,加入5g胰蛋白酶，37°C 保温6小时，90°C加热灭活蛋白酶，控制pH值在7. 1，温度在55°C，加入5g木瓜蛋白酶，以 速度300r/min搅拌1. 5小时，进行反应，保温6小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。 8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换 柱（DEAE s印harose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度， 收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
[0019] 实施例2
[0020] 取猪脑，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一 次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物lkg，控制ph值在8. 2,加入7g胰蛋白酶，37°C 保温5小时，90°C加热灭活蛋白酶，控制pH值在7. 1，温度在55°C，加入3g木瓜蛋白酶，以 速度300r/min搅拌1小时，进行反应，保温5小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。 8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换 柱（DEAE s印harose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度， 收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
[0021] 实施例3
[0022] 取猪脑，加入5 %的乙醇水溶液，5 %的乙酸水溶液调pH值为4、捣碎，过滤，重复一 次，取滤渣，得胶状固形物。取胶状固形物lkg，控制ph值在8. 9,加入3g胰蛋白酶，37°C 保温7小时，90°C加热灭活蛋白酶，控制pH值在7. 1，温度在55°C，加入Ig木瓜蛋白酶，以 速度300r/min搅拌1. 5小时，进行反应，保温9小时；煮沸30min，灭活酶，结束反应，过滤。 8000r/min离心，收集上清液。取离心液，微孔滤膜过滤，减压干燥，得干粉，置于阴离子交换 柱（DEAE s印harose FF)，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在波长238nm处测定吸光度， 收集第2、3、4个吸收峰的洗脱液，浓缩，干燥，得多肽。
[0023] 测试实施例I :N0含量及NOS活性检测
[0024] 采用多肽对神经细胞培养进行干预，对培养液中NO含量及NOS活性进行检测，与 正常对照组和模型组进行对比，
[0025] 实验方法：
[0026] (1)细胞培养
[0027] 取人神经母细胞用0. 25 %的胰蛋白酶2-3ml，置于37 °C恒温水浴箱中振荡消化 10min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹打未消化的组织块，调整细胞密度 约为lX10 5/ml，吸出细胞悬液放入培养瓶中，置于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养。传代 后的细胞接种子96孔培养板中，每孔200 μ 1，待细胞重新长满汇合后，用于以下实验。
[0028] (2) A β 25-35 蛋白前处理
[0029] 将Αβ 25-35蛋白用超纯水配制成浓度为500 ymol/L的溶液，在37°C培养箱中放 置7天，分装至EP管中，-20°C保存备用。
[0030] (3)样品制备
[0031] 将接种于96孔培养板中处于对数生长期的细胞，随机分为3组，设对照组，模型 组，多肽组，对照组添加20 μ 1培养基，模型组加10 μ 1浓度为500 μ mol/L的A β 25-35蛋 白溶液及10 μ 1培养基，多肽组加10 μ 1浓度为500 μ mol/L的A β 25-35蛋白溶液及10 μ 1 培养基配制的多肽溶液。置于培养箱中，收集48小时、72小时两个时间点的细胞培养液， lOOOr/min离心lOmin，取上清液分别用NO试剂盒、NOS试剂盒进行NO、NOS的检测。
[0032] 实验结果：
[0033] 经过多肽干预后，多肽组NO含量及NOS活力与同时间点模型组相比明显降低。特 别是72小时时多肽组NO含量及NOS活力较同时间点模型组明显降低。
[0034] 表1多肽对神经细胞培养液中NO的影响（μ mol/L，η = 3, _x±s )
【权利要求】
1. 一种猪脑多肽，其特征在于，该多肽的分子量在1000?4000道尔顿，多肽中含亮氨 酸19%?21%、赖氨酸16%?18%、谷氨酸16%?18%，丙氨酸11 %?13%、精氨酸9%? 11%，天冬氨酸7%?9%，缬氨酸6%?8%、异亮氨酸6%?8%。
2. 权利要求1所述的猪脑多肽的制备方法，包括以下步骤： (1) 分离提取：取猪脑，加入5%的乙醇水溶液，5%乙酸调pH值至3?5,捣碎，过滤， 重复上述操作一次，取滤渣，得胶状物； (2) 水解：取步骤（1)胶状物，调节pH值在7. 0?10. 0,加入胰蛋白酶，37°C保温5? 7小时，90°C加热灭活酶，控制pH值在6. 5?7. 5、温度在50?60°C，加入木瓜蛋白酶，以速 度100?300r/min搅拌0. 5?1. 5小时，进行反应，保温5?10小时，煮沸5?60min，灭 活酶，结束反应，过滤，5000?10000r/min离心，收集上清液，过滤，减压干燥得干粉； (3) 纯化：取步骤（2)干粉，置于阴离子交换柱，以不同浓度氯化钠溶液梯度洗脱。在 波长238nm处测定吸光度，以吸收峰来收集洗脱液，浓缩，干燥，得猪脑多肽。
3. 根据权利要求2所述猪脑多肽的制备方法，步骤（2)中所述的胰蛋白酶用量为步骤 (1)胶状物重量的0.3%?0.7%。
4. 根据权利要求3所述猪脑多肽的制备方法，步骤（2)所述的胰蛋白酶用量为步骤 (1)胶状物重量的〇? 5%。
5. 根据权利要求2所述猪脑多肽的制备方法，步骤（2)所述的木瓜蛋白酶用量为步骤 (1)胶状物重量的〇? 1 %?0.5%。
6. 根据权利要求5所述猪脑多肽的制备方法，步骤（2)所述的木瓜蛋白酶用量为步骤 (1)胶状物重量的0.3%。
【文档编号】C07K1/18GK104497102SQ201410775835
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】林波, 王欣, 宫晓辉, 于秀玲, 孔新颖, 韩风雨 申请人:内蒙古天奇生物科技有限公司, 内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司, 内蒙古天奇药业投资（集团）有限公司