丙二烯氧化物合酶用于精液保存和辅助生殖的用途的制作方法

本发明涉及丙二烯氧化物合酶在辅助生殖技术的通用领域的用途。特别是，本发明涉及改善精液(和精子)的稳定性，该精液(和精子)用于辅助受精过程(包括人工授精、体外受精、精子分离)且用于体外操作卵母细胞以改善其生存力和可育性。本发明涉及源自人、牛、马、猪、家禽和其它动物的配子。

背景技术：

丙二烯氧化物合酶(AOS)为细胞色素p450酶家族成员(CYP74A；EC 4.2.1.92)，其首先分离自银胶菊橡胶植物灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(GenBank CAA55025.2)。AOS也已知为银胶菊橡胶颗粒蛋白(RPP)，其已从银胶菊橡胶植物纯化并克隆(US 5,633,433和US 6,132,711)。

AOS为在生物系统中对脂质过氧化物具有特异性的抗氧化酶。如US 6,132,711所报告，AOS快速将游离或酯化的脂肪酸过氧化物或氢过氧化物转化为其对应的环氧化物，然后环氧化物又转化为酮醇。该酶的脂质过氧化物和氢过氧化物底物据称对生物有机体有毒且可通过链增长反应产生另外的过氧化物，以及引起蛋白质和DNA的氧化损伤。在AOS的存在下，这些化合物被快速转化为环氧化物且链反应被破坏。

相比脂质过氧化物，AOS作用产生的酮醇物质为相对生物惰性的，因此US 6,132,711推测AOS的抗氧化作用可在多种应用中有用。这些应用包括保存植物种子、治疗严重失血的创伤患者、在一些疾病的治疗中促进细胞凋亡，包括在烟草植物中对除草剂的抗性、增加用于人工授精或体外受精的精子的寿命，和增加生物有机体的平均和最大寿命。然而，在US 6,132,711中这些用途完全是推测的，没有实验支持。

许多药物，无论是单一化合物还是多组分物质，无论是来源于天然生物源还是合成制备，都已知显示抗氧化剂行为。一些为广谱抗氧化剂，即它们在一系列生物体系中都显示抗氧化作用，而其它的为选择性的且在特定的一组生物参数中具有抗氧化作用。

此外，抗氧化剂可分类为‘自杀’种类(意思是一个抗氧化剂分子在中和一个活性氧化性物质分子时被消耗)或可分类为酶类，其中酶的单一分子可中和许多氧化性分子。

AOS已显示在治疗严重缺血性损伤和局部缺血-再灌注损伤中具有益处(US 7,157,082)。缺血性损伤通过创伤事件(如中风或心脏病发作)引起，其导致血液供给缺乏，引起组织的氧短缺。局部缺血–再灌注是指当在局部缺血或缺氧一段时间后血液供给返回至组织引起的组织损伤。

精液(以及精子和卵子)的稳定性广泛被认为是在动物人工授精和辅助生殖技术阶段非常显著的约束条件。精液不稳定性增加了成本、低效性和逻辑复杂性。对新鲜精液和冷冻精液都是这种情况，且除了牛繁殖情况之外还包括多种物种。冷冻精子在冷冻和解冻步骤中都具有失去生存力的问题，且新鲜精液受到其非常有限的保存期限(～3天)极大的约束。工业上已通过一系列手段处理稳定性问题以改善效率。例如，在稀释组合物和加工中进行了渐进式的改进以改善存活率。尽管这样，仍然广泛认为精液稳定性是主要的问题且存在持续的需求以寻找改善精液性能的方式。此外，更先进的精液处理技术，如涉及基于精子为X或Y(雌性或雄性)的精子分选的技术，由于所使用的方法而对精子生存力提供了另外的挑战。这些本质上通常为氧化性的，其是由于在加工过程中对细胞造成的热、压力、光、化学或生物化学损害所产生。

本申请人目前发现AOS对新鲜和冷冻精液都为有效的稳定性增强剂。因此，本发明一个目的是提供新的方式以延长用于人和其它动物的辅助生殖过程的精液的功能寿命，或至少提供对现有方法的有效替代方式。

技术实现要素：

在一方面本发明提供丙二烯氧化物合酶作为精液的保存剂的用途。该丙二烯氧化物合酶可为源自银胶菊橡胶植物灰白银胶菊的丙二烯氧化物合酶，或可由银胶菊橡胶植物灰白银胶菊的丙二烯氧化物合酶克隆。该丙二烯氧化物合酶优选具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或为其功能等价的变体。

丙二烯氧化物合酶可为适于使用的任何形式，例如适于在pH-缓冲的水性介质中使用的形式。该丙二烯氧化物合酶可以任何合适的浓度(例如1至10μg/ml)存在于介质中。

在本发明一些实施方案中，所述精液为牛精液。在本发明的一些其它实施方案，该精液为人精液。在其它实施方案中，该精液可源自马、羊、猪或家禽。

在第二方面本发明提供延长精液的寿命的方法，其通过将精液与丙二烯氧化物合酶接触。通常，所述精液在丙二烯氧化物合酶的存在下储存。

在本发明一些实施方案中，所述丙二烯氧化物合酶被添加至精液且将精液冷冻，储存一段时间，然后在使用前解冻。在其它实施方案中，所述精液为新鲜的精液。

优选延长精液的寿命使得精液中至少50％的精子在射精4天后有活力。

在另一方面本发明提供包含丙二烯氧化物合酶的精液。该精液可为冷冻的或新鲜的。

在另一方面本发明提供包含丙二烯氧化物合酶的精液在人工授精过程、体外受精过程或精子分选过程中的用途。该人工授精过程包括人工授精人类女性、母牛、马、猪、羊或家禽的步骤。

在另一方面本发明提供用于保存精液的组合物，其包含有效量的丙二烯氧化物合酶。

附图简述

图1显示使用标准‘新鲜’方法储存4天的稀释的公牛精液中精子的平均相对存活率。

图2显示AOS对冷冻公牛精液的精子活力的作用。

图3显示AOS对精子活力表现的作用。

图4为SEQ ID No.1的氨基酸序列。

发明详述

本发明总体上涉及AOS作为精液的保存剂的用途。本发明还涉及包含AOS作为保存剂的精液；涉及包含AOS的精液在人工授精过程、体外受精过程或精子分选过程中的用途；和涉及包含AOS的用于保存精液的组合物。

应理解本说明书中当提及精液保存时，是指将其功能寿命延长至超过未处理或未加工的精液的功能寿命，且包括保存在该精液中的精子。

本说明书使用的术语“丙二烯氧化物合酶”或“AOS”是指将脂氧合酶-衍生的脂肪酸氢过氧化物转化为丙二烯环氧化物(其为植物中的生长调节剂茉莉酸的前体)的任何酶，且包括例如从橡胶植物灰白银胶菊分离的丙二烯氧化物合酶。该术语还包括AOS的任何功能等价的肽或蛋白质，且包括从任何来源或通过任何方法得到的AOS，例如通过化学合成和/或基因表达或克隆技术。该说明书中当提及AOS时都被认为包括提及其功能等价的变体，除非另有所述。

本说明书使用的术语“功能等价的变体”包括那些具有一个或多个(例如1至50个、1至30个、1至20个、1至10个或1至5个)缺失、添加和/或取代的同时基本上保持AOS所需功能的肽或蛋白质，或涉及通过对选择的氨基酸或总体氨基酸结构的化学修饰而衍生出的变体。氨基酸取代通常为保守氨基酸取代。应理解功能等价的变体可具有比原蛋白质(所述变体为该蛋白质的变体)更高或更低的活性水平。在本发明的多种实施方案中，功能等价的变体具有该蛋白质(所述变体为该蛋白质的变体)的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的活性水平。功能等价的变体将具有抗氧化活性。例如，它们可具有在脂质/细胞膜界面将脂质过氧化物/氢过氧化物转化为脂质环氧化物的能力。

在本发明一些实施方案中，该AOS为Genbank CAA55025.2中所述的AOS或该蛋白质的功能等价的变体。

本领域技术人员基于本说明书的信息并使用已知技术能够容易评价其功能并确定蛋白质活性水平。作为实例，抗氧化活性可使用Pinchuk等人，Chemistry and Physics of Lipids，164(2001)，42-48所述的方法，或使用通过Sigma-Aldrich可获得的可商购测试试剂盒而确定。

本说明书使用的术语“保守氨基酸取代”是指具有相似生物化学性质的氨基酸取代。应理解合适的保守氨基酸取代是基于不同氨基酸之间的相对相似性，包括氨基酸侧链取代基的相似性(例如其尺寸、电荷、亲水性，疏水性等)。作为实例，保守取代包括一个脂族氨基酸取代另一脂族氨基酸，具有含羟基或含硫的侧链的氨基酸被另一具有含羟基或含硫的侧链的氨基酸取代，芳族氨基酸被另一芳族氨基酸取代，碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代，或酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例包括:

-甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸中的一种对另一种的取代；

-丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或蛋氨酸中的一种对另一种的取代；

-苯基丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的一种对另一种的取代；

-组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种对另一种的取代；

-天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺中的一种对另一种的取代。

本发明的AOS可从天然源分离，或通过化学合成衍生(例如，以下所述的fmoc固相肽合成：Fields G.B.，Lauer-Fields J.L.，Liu R.Q.和Barany G.，(2002)Principles and Practice of Solid-Phase peptide Synthesis；Grant G.，(2002)Evaluation of the Synthetic Product.Synthetic Peptides,A User’s Guide，Grant G.A.，第二版，93-219；220-291，Oxford University Press，New York)或基因表达技术。标准重组DNA和分子克隆技术描述于例如Sambrook和Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。也考虑通过合适的转基因动物、微生物或植物制备用于本发明的蛋白质或肽。

AOS可连接至一个或多个其它化合物。例如，其可连接至这样的化合物，其有助于AOS的功能或活性、防止AOS降解、或者改善其半衰期、帮助在制备过程中分离和/或纯化AOS(例如泛素、his-tag或生物素)、或帮助细胞膜易位或细胞特异的靶向。这些其它化合物可包括，例如，肽、核酸、脂质和碳水化合物。

所述其它化合物可连接至AOS，或作为构建体的一部分而合成，其使用任何允许AOS保持至少其所需功能的水平的合适的手段。术语“连接”应被广泛认为包括AOS和化合物之间任何形式的相连、键合、融合或缔合(例如，共价键合、离子键合、氢键合、芳香堆叠相互作用、酰胺键、二硫键、螯合)，且不应被认为是指特定强度的连接。该AOS和化合物可以不可逆或可逆的方式连接，使得在给药后该AOS从化合物释放。

因为AOS为酶抗氧化剂，其相比传统化学/非酶抗氧化剂如维生素E，提供了另外的益处，因为每一个AOS分子能催化数以千计的抗氧化反应。相反，大多数化学/非酶抗氧化剂仅具有参与一个反应的能力。因此，AOS在非常低的浓度时就有效。其它必须以更高浓度(通常高几个数量级)使用的抗氧化剂会具有毒性问题。

而且，几乎所有抗氧化剂酶，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶，也产生次级促氧化自由基物质，其需要第二种酶来将其去除。认为AOS对抗脂质氢过氧化物起作用且能单独作用，即在不存在第二种酶的情况下作用。

本申请人已发现AOS为精液(新鲜精液和冷冻精液二者)的有效保存剂。因此AOS在辅助生殖过程中具有潜在应用，包括用于人和用于动物繁殖工业，特别是牛和马的繁殖。

仅关于新西兰的牛繁殖和乳品工业，据估计在100只人工授精的母牛中，70只不会被退回(return)且约60只怀孕。尽管多种因素(包括母牛本身不育)可用来解释剩余的30只动物，但也广泛认识到精液质量为需要关键考虑的因素，其也许是10-15只不怀孕的动物的原因。在财务术语中，可育性增加1％据估计仅对新西兰的乳品工业就有$4M的价值。因此不育问题的发展尤其与人工授精和相关的精液加工工业(如涉及X/Y分选的那些工业)相关联。除了改善母牛的怀孕成功率，精液质量的改善也可预期能以其它方式导致成本效益，如减少所需的受精剂量同时增加用于每次射精的吸管(straws)。

关于人的辅助生殖技术，AOS可用作体外受精(IVF)过程中的卵子培养介质的添加剂，且用于在胞浆内精子注射(ICSI)之前直到胚胎培养、分选、储存和移植(transfer)过程中稳定精子。

尽管动物精液中精子细胞死亡可能存在多种机理，但显然有两个主要机理，凋亡和氧化应激，其各自以脂质过氧化作为因果途径中的中心步骤。在这些机理中，细胞膜(包括线粒体膜)的脂质成分的氧化损伤导致膜完整性的丧失、细胞功能障碍和坏死。重要的是，这些过程的生物化学涉及膜脂质被氧化为脂质过氧化物，然后其级联反应引起细胞蛋白质、DNA和其它脂质的氧化性损伤。这种细胞死亡的氧化途径在细胞暴露于苛刻环境挑战(包括加热/冷却、冷冻/解冻，剪切力和曝光)的情况下也是重要的。

氧化性损伤的作用已在产业上被认识到了一段时间，这导致用于精液和IVF稀释剂的抗氧化添加剂的开发，并取得了一些成功。一个实例为Caprogen^TM，其为包含过氧化氢酶的牛肝的蛋白质提取物。Caprogen^TM的使用是昂贵的，且作为牛内脏提取物，在出口市场面临着限制。

AOS通常以水性组合物的形式使用，其包含缓冲剂和精液增充剂(extender)。该增充剂通常由稀释缓冲剂、蛋白质和脂质组分组成。该AOS可以任何合适的浓度存在，例如其范围为1至10μg/ml。其它范围包括，但不限于，1至10内的任何整数范围，包括其下限为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/ml且其上限为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μg/ml的任何范围。

申请人已确定AOS能在4天后在新鲜公牛精液中使精子存活率增加～50％。

实施例1显示AOS为新鲜公牛精液的有效保存剂。在浓度为3μg/ml时，AOS在4天后使精子存活率增加约50％。对于多种辅助生殖技术方法该数量级的改善是显著的。应理解新鲜未处理的精液的短‘保存期限’对其应用有显著的限制，尤其是如果例如其首先要求在使用前进行运输的话。由于这个原因，在采集4天后精子存活率增加50％对于牛繁殖在经济上是重要的，因为其显著增加精液用于实现其使母牛受精的预期用途的机会窗口。可以预期其它动物，包括人的精液的功能寿命的类似的改善。

实施例2证实AOS在保持解冻后精子活力方面具有显著的积极作用。检测的参数包括解冻后的存活率和活力，和酶剂量/响应作用。申请人确定在酶浓度为2μg/ml时AOS显著增加解冻后的存活率(P<0.05)且在解冻后24h提高活力达～120％(P<0.01)。此外，发现更多精子为膜完整的且可用于受精。从该研究总体来说，可以认为AOS可有效改善牛精子对稀释、冷冻和解冻后过程的耐受性。在牛繁殖的情况下，这意味着每次射精有更多的吸管(straws)可使用，从而增加每次射精对繁殖工业的价值。

排卵为雌性生物(包括奶牛)中非常分散的生物事件，为了发生受精，卵子必须在其短期的功能寿命中遇到有活力的精液。应理解这在以下情况更可能发生，即如果精子在授精后保持其活力更久以增加其推动自身到达与卵子的接触点的可能性。因此在24h时延长的活力强烈表明可预期AOS处理的精液的总体生存力(可育性)更大。在牛繁殖中，未能受精的动物数量因此更低，这又可预期降低成本并增加AOS处理的精液的价值。

实施例2显示解冻后精子活力(图2)和精子活力表现指数随时间的下降(迁徙效率，图3)。特别是，2μg/ml的AOS的结果显示在整个时程中活力趋向显著。在解冻后24小时，活力超过对照水平的两倍(+120％)且差异为高度显著的(P<0.01)。此外，AOS的作用显示为剂量响应的且最大值发生在酶浓度为2μg/ml时。AOS的积极作用在活力指数分析中更明显(图3)，在24小时后将该精子性能的测量值提升2.9倍。

AOS明显对精子存活率和精子活力的度量具有显著的积极作用，而这两者是已知的精子性能和生育力的关键指示。此外，发现更多精子是膜完整的且可用于在AOS处理后的受精。在高稀释度(2μg/ml)时，发现AOS可有效改善牛精子对稀释、在冷冻的精液方法中的冷冻和解冻后的处理的耐受性以及精液在‘新鲜’过程中的性能。

实施例3显示对发展为胚胎的卵母细胞总数没有影响，但对具有可移植质量(transferable quality)的胚胎的数量具有显著作用，该数量来自变成熟的卵母细胞的数量和裂解的数量。该数据指示AOS对发展为胚胎的卵母细胞没有有害作用且增加了在IVF过程中发展成熟的胚胎的‘产率’。

如本说明书所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应解释为排他或或穷举的含义。换句话说，它们应是指“包括，但不限于”。

本发明进一步参考以下实施例描述。应理解要求保护的本发明不应以任何方式被这些实施例所限制。

说明书提及的任何现有技术文献不应理解为承认该现有技术是广泛已知或构成本领域公知常识的一部分。

实施例

实施例1-新鲜公牛精液

使用已建立的步骤通过来自5只公牛的射精物而进行该研究。精液在42℃使用人造阴道收集且转移至实验室以用于初始质量保证(体积、活力、精子浓度)。样品然后在37℃使用各实验增充剂稀释至每毫升10X 10 ⁶个精子的标准精子浓度。该实验增充剂包含1.856g/100ml的柠檬酸钠、1g/100ml的葡萄糖、20ml/100ml的卵黄(包含抗生素防腐剂)，且调节至pH 7.0。然后将实验添加剂添加至以下1–5所示的该增充剂基质。稀释的样品(20ml)然后以0.25℃/分钟冷却至5℃且在5℃储存5天。样品在第1天和第4天取出且使用标准步骤确定精子存活率百分比和活力指数。

结果示于图1，其中:

1.对照–仅稀释剂；

2.过氧化氢酶–稀释剂加10μg/ml过氧化氢酶；

3.Caprogen^TM–稀释剂加标准浓度的Caprogen^TM；

4.AOS–稀释剂加3μg/ml AOS；

5.AOS–稀释剂加1μg/ml AOS。

图1显示在有和没有测试添加剂的情况下使用标准‘新鲜’方法储存4天的稀释的公牛精液中精子的平均相对存活率。4天时存活率的总体对照水平为第0天的～55％。相对于对照组将结果归一化。因此，相比于对照，3μg/ml AOS的AOS浓度导致存活率提高～50％。这种差异是高度显著的P<0.01。在AOS浓度为1μg/ml时，该差异达到显著性为0.05的水平。过氧化氢酶和Caprogen^TM得到的结果并不显著。

实施例2-冷冻的公牛精液

进行该研究以确定AOS是否可改善牛精子对冷冻-解冻步骤的耐受性。测量解冻后的活力。将5只公牛的精液样品在介质中稀释至标准浓度且各自分为2等份。将AOS添加至1等份至终浓度为2μg/ml，且各公牛的第二等份作为对照。该精液被分配至吸管(straws)中以进行冷冻。然后使用标准程序降低吸管温度且将吸管储存在液氮中。在室温解冻后，将吸管使用标准程序充氧。然后将吸管在室温储存至多24h，随后评价存活率、活力和活力指数。

解冻后精子随时间的活力示于表1和图2。活力％是指全部显示运动的精子的百分比。对照处理是无AOS的稀释剂和增充剂(系列1)。AOS处理是指具有2μg/ml AOS的稀释剂和增充剂(系列2)。在图2中，1为冷冻前的活力％，2为解冻后0小时的活力，3为解冻后3小时的活力，4为解冻后6小时的活力，且5为解冻后24小时的活力。

表1:精子活力

活力指数(显示向前推进的运动精子的相对比例)示于表2和图3。在图3中，1为冷冻前的活力指数(MI)，2为解冻后0小时的MI，3为解冻后3小时的MI，4为解冻后6小时的MI，且5为解冻后24小时的MI。

表2:精子活力指数

实施例3-体外胚胎培养

该实验检测了3种浓度(0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml)的AOS对体外胚胎生产系统中的胚胎发育和质量的作用。标准体外胚胎生产步骤用于胚胎的成熟、受精和培养。在培养皿中的包含胚胎培养缓冲液或稀释剂的小液滴介质(20-50μL)用矿物油覆盖。在添加卵母细胞、受精卵或胚胎至液滴后调节介质中AOS的初始浓度以得到正确的终浓度。培养后，将胚胎在第7天进行形态学评估，且按照IETS(国际胚胎移植学会)手册记录胚胎的阶段和级别以将胚胎分级。使用Binomial Generalised线性模型分析发育的比例数据。胚胎发育数据总结于表3。

表3:可移植级别IVF胚胎的发育

¹＝μg AOS/ml介质

²p<0.05

在1μg/ml AOS处理组中显著更高比例的卵母细胞发育为可移植质量的胚胎。0.1μg/ml AOS对发育没有影响，而更高水平(10μg/ml AOS)具有不利作用。添加1μg/ml AOS至培养基对胚胎质量具有有利作用，导致所产生的可移植胚胎增加7％。

尽管本发明已通过实施例进行了描述，但应理解可在不偏离权利要求所限定的本发明的范围的情况下进行改变和修饰。而且，当存在特定特征的已知等价物时，如同本说明书具体提及一样掺入这些等价物。