针对禽类呼肠孤病毒的广谱疫苗的制作方法

禽类呼肠孤病毒在分类学上被划分至呼肠孤病毒科（Reoviridae）中正呼肠孤病毒（Orthoreovirus）属的禽类正呼肠孤病毒种。病毒颗粒没有被膜，但具有双层蛋白衣壳(double-shelled protein capsid)。该衣壳含有存在10个区段的双链RNA基因组。可以将基因组区段分组成三个大小类别：大（L）、中（M），和小（S）；参考这些区段将这些区段编码的病毒蛋白分别标示为：lambda（λ）、mu（μ），或sigma（σ）。在Benavente & Martinez-Costas (Virus Res., 2007, 第105-119页)中给出了禽类呼肠孤病毒结构的综述。

禽类呼肠孤病毒是引起禽类中的严重疾病和商品化家禽养殖业务重大经济损失的重要病原体；大部分的鸡，还有火鸡和其他类型的禽类可能会受到影响。严重疾病，甚至死亡主要发生在幼小禽类中，因为对禽类呼肠孤病毒症状和感染的年龄相关抗性在禽类中从约4周大小才发展。症状包括尤其是肠和呼吸系统疾病、心肌炎和肝炎。最典型的是病毒性关节炎，导致关节和腱中的腱鞘炎（或：呼肠孤病毒关节炎）。所导致的跛行引起走向饲养箱时困难。或者，导致吸收不良的病毒性肠疾病阻碍了饲料的有效转化。两种疾病对于快速生长和较重类型的品种，如肉鸡（肉食型禽类）尤其麻烦。同样，与若干其他病毒和细菌性肠病原体组合，禽类呼肠孤病毒是所谓的‘生长受阻和发育障碍综合征（runting stunting syndrome）’的因素。

所有这些症状导致动物遭受痛苦并导致由于屠宰重量降低的经济损失和指责畜体品质差。

控制禽类呼肠孤病毒感染的主要途径是通过直接接种非常小年龄的小鸡，或通过在其产蛋期之前接种种鸡（为后代产生受精卵的母鸡），以减少蛋传播(egg-transmission)，并经过母体来源的抗体间接保护小鸡。

禽类呼肠孤病毒可以在体外进行培养，并且例如在原代鸡胚肝细胞上良好复制。复制引起典型的细胞病变效应(cpe)，其显示大的细胞-合胞体。

禽类呼肠孤病毒疫苗一般是完整的病毒疫苗，其为减毒活类型，或灭活类型。商品化禽类呼肠孤病毒疫苗的实例（均来自MSD AH，荷兰）是：活疫苗：Nobilis® Reo 1133，或Nobilis® Reo 2177；或灭活的-佐剂化疫苗，如Nobilis® Reo Inac (包含毒株1733和2408)。S1133疫苗毒株的起源回溯到二十世纪八十年代早期(Van der Heide 等, 1983, Avian Dis., 第27卷, 第698-706页)，但其至今仍在使用。

在标准的推荐接种方案中，至少两次针对禽类呼肠孤病毒接种种禽：在非常小的年龄利用活疫苗初次接种（引发），和若干星期后利用灭活疫苗二次接种（加强）。根据田间感染(field infection)压力的严重性，可以在几周后给予另一次加强，并且种禽通常在约16-18周龄，即产蛋开始前4-6周接受进一步的加强接种。事实上，田间禽类呼肠孤病毒的感染压力并非总是高的，因而通过给予小鸡或种鸡仅一次接种可以满足许多家禽农场主。然而在强毒的禽类呼肠孤病毒感染爆发情况下，后代小鸡可能不能充分地被保护免于田间感染。

通过有效的体液免疫应答，针对若干病毒结构蛋白获得针对禽类呼肠孤病毒的免疫保护。然而，主要的病毒免疫原是外衣壳蛋白sigmaB和sigmaC；sigmaB (或：σB)是主要的，并且sigmaC (σC)蛋白是次要的外衣壳蛋白。SigmaC在病毒颗粒附着到宿主细胞上起作用。其由S1基因组区段的3’区编码，并且大小约326个氨基酸。发现sigmaC蛋白比sigmaB在抗原性上变化大得多(WO 2009/093251, 和: Meanger等人, 1995, Avian Pathol., 第24卷, 第121-134页)。

禽类呼肠孤病毒疫苗学领域中一般认为针对禽类呼肠孤病毒的有效接种只能够通过同源疫苗获得，因此针对来自与疫苗抗原相同的血清型组内的病毒(Wood 等, 1986, Comp. Pathol., 第86卷, 第125-129页)。因此，许多年来禽类呼肠孤病毒疫苗已经基于来自不同的单一血清型组的抗原。标准接种程序针对地方性群体中存在的呼肠孤病毒血清型；重复接种随后提供牢固免疫。

当多于一种血清型的禽类呼肠孤病毒在一个区域中占优势时，例如通过利用禽类呼肠孤病毒的‘经典’疫苗毒株，如S1133、1733、2177或2408施用引发接种，并利用针对例如ERS毒株的加强疫苗跟进在引发和加强接种中交替这些疫苗。许多年来，这些是田间盛行的禽类呼肠孤病毒的主要类型。

作为RNA病毒，禽类呼肠孤病毒在其基因组中可以发生突变。事实上，这导致在田间偶然碰到新的变体，其可以是毒力更高或更低的。然而，该方面的问题是有效区分禽类呼肠孤病毒的困难，因为血清学试验可能显示结果的变异性。因而，用于通过在蚀斑减数试验（plaque-reduction assay）中使用多克隆血清测试病毒中和或通过使用一组单克隆抗体测定特定的结合模式来鉴定的禽类呼肠孤病毒毒株，参见2177毒株(EP 687.728)和ERS毒株(EP 1.024.189)的表征。

或者，可以通过病毒诱导的主要疾病症状，如：腱鞘炎、吸收不良或神经学症状来表征禽类呼肠孤病毒毒株(例如，如EP 1.551.961中描述的诱导神经学症状的ERS毒株)。然而，由于病原性的异质性，这并非完全确定的。

最近，在分子诊断学的基础上，通过比较病毒氨基酸或核苷酸序列完成禽类呼肠孤病毒的分类。发现在该方面特别有用的是sigmaC蛋白的氨基酸序列的比较，因为其是禽类呼肠孤病毒蛋白的最大变量：在最小相关的禽类分离株之间显示仅35%的氨基酸序列同一性(J. M. Day, 2009, Inf. Gen. & Evolution, 第9卷, 第390-400页)。

若干科学家已经通过系统发育分析，基于其sigmaC蛋白的氨基酸序列同一性描述了禽类呼肠孤病毒分离株的分组。由于越来越多来自禽类呼肠孤病毒分离株的sigmaC蛋白序列开始可以在公共数据库中获得，所以更精细的分析变得可能。例如：Kant 等 (2003, Vet. Res., 第34卷, 第203-212页)已经描述了将禽类呼肠孤病毒分成5个主要的基因型组。在血清型组和基因型组之间，或在疾病组和基因型组之间没有发现相关性：所有类型的禽类呼肠孤病毒相关疾病可以起因于来自任何基因型组的禽类呼肠孤病毒的感染。

使用不同的参数，基于sigmaC蛋白分析的其他系统发育研究描述了另一种分组：Liu 等 (2003, Virology, 第314卷, 第336-349页)，定义了6个谱系；Lublin 等 (2011, vaccine, 第 29卷, 第 8683-8688页)，定义了4个基因型组。

Kant 等描述的系统（分成5个基因型组）看起来受到了最多的科学支持。在该分类中，‘经典’禽类呼肠孤病毒疫苗毒株均落入Kant的基因型组1中，而ERS毒株落入Kant的基因型组5中。

Lublin 等 (上文)研究了针对不同基因型组的接种。与禽类呼肠孤病毒疫苗主要进行同源保护的共识一致 ，他们发现有效针对禽类呼肠孤病毒所有不同基因型的疫苗必须含有来自这些基因型组各自的抗原物质。

近年来，禽类呼肠孤病毒的突破(break-through)感染数量已经激增。从大约2009 – 2013年，在欧洲和美国发生了若干禽类呼肠孤病毒爆发，由此鸡群出现了腱鞘炎、吸收不良，甚至死亡的严重禽类呼肠孤病毒感染症状；这尽管还是在小鸡已经适当接种了商品化禽类呼肠孤病毒疫苗的事实下。这证明已经发展了强毒的新禽类呼肠孤病毒毒株，并且经典的和ERS类型的疫苗不能总是进行有效保护。

Troxler 等 (2013, Vet. Record, 第 172卷, 第 556页)分析了法国两个区在2011-2012年间的许多爆发。依赖于Kant 等 (上文)描述的通过将SigmaC蛋白的氨基酸序列比较将禽类呼肠孤病毒毒株分到5个基因型组中，Troxler 等将他们从法国分离的爆发毒株分类为Kant的基因型组1的亚类。

因为现在的疫苗看起来不能有效针对这些现代突破毒株，Troxler 等重复了Lublin 等的建议，即广泛交叉保护疫苗需要掺入禽类呼肠孤病毒的所有基因型组。

因此，在家禽饲养领域存在迫切需要以可获得针对禽类呼肠孤病毒的疫苗，所述疫苗具有广泛保护性，并且针对近期强毒突破毒株也有效。

因而，本发明的目标是克服现有技术的缺点，并通过提供这样的疫苗以适应所述领域的这种需要，所述疫苗可以减少广谱禽类呼肠孤病毒，尤其是禽类呼肠孤病毒的近期强毒突破毒株的感染。

令人惊讶的是，发现可以实现该目标，并且因此可以通过提供减少禽类呼肠孤病毒感染的疫苗克服现有技术的缺点，由此所述疫苗包含禽类呼肠孤病毒抗原物质，其基于病毒sigmaC蛋白的氨基酸序列比较来源于禽类呼肠孤病毒的五个基因型组的仅两个。

发现该疫苗通过在仅单次接种后几乎完全减少禽类呼肠孤病毒的近期突破分离株的复制而提供广谱保护。

本发明人已经分析了1993到2013年之间并且来自若干国家的禽类呼肠孤病毒爆发的大约150份样品。有趣的是，当比较其sigmaC蛋白的氨基酸序列时，新分离的禽类呼肠孤病毒属于如下详述的所有基因型组。这在Troxler 等的发现基础上进行了扩展，并且显示近期的禽类呼肠孤病毒爆发不是由禽类呼肠孤病毒的任何特定基因型所引起的。而是似乎存在病毒特征的普遍改变，其使得现有的疫苗有效性较低。因此，需要更新禽类呼肠孤病毒疫苗，并且所更新的疫苗将需要针对所有现有病毒基因型进行保护。

对于本发明，基于其SigmaC蛋白的氨基酸序列将禽类呼肠孤病毒毒株和分离株分为5个基因型组，如本文所定义。这给出了所有已知毒株的有效划分，以及划分近期突破毒株的方式。同样，发现如此分成5个基因型组与Kant 等 (上文)描述的基因型划分紧密匹配。

本发明人惊奇地发现基于来自禽类呼肠孤病毒的两个基因型组：基因型组1和4的抗原物质的特定组合的疫苗具有广谱保护作用。相反，含有来自基因型组1和5的禽类呼肠孤病毒抗原物质的类似疫苗不提供该广泛保护。

这种新的疫苗为目标禽类提供针对禽类呼肠孤病毒复制的广谱保护，因为该疫苗可以几乎完全减少目标中禽类呼肠孤病毒的复制。这应用于来自与疫苗中包含的抗原物质相同的基因型组的禽类呼肠孤病毒（同源禽类呼肠孤病毒），和来自不同于疫苗中包含的抗原物质所属的基因型组的基因型组的禽类呼肠孤病毒（即异源禽类呼肠孤病毒）。该接种效果在单次接种后已获得，并且甚至针对禽类呼肠孤病毒的近期强毒爆发毒株也有效。

因此，这种针对禽类呼肠孤病毒新的广谱疫苗在接种的动物中减少了禽类呼肠孤病毒诱导的疾病。同样，通过减少病毒载量，其减少了病毒的传播。

这是未能预料的，并且与本发明时期本领域中的一般观点直接相反，当时一般认为禽类呼肠孤病毒疫苗仅针对同源病毒完全有效，并且不能提供对于不同基因型组的有效异源保护，并且按标准的这种接种会需要至少两次施用才有效。的确，这由Lublin 等 (上文)证实，其基于来自所述基因型组各自的代表的抗原物质测试了广泛的禽类呼肠孤病毒疫苗。

因此，当遵循本领域的该建议时，开发针对禽类呼肠孤病毒的这些现代突破毒株具有广泛保护的有效疫苗会需要包括来自所有所述基因型组的禽类呼肠孤病毒的抗原物质。

为什么来自禽类呼肠孤病毒基因型组1和4的抗原物质的这种特定组合可以提供该有效的广谱接种效果是未知的。尽管本发明人不想受可能解释这些观察的任何理论或模型束缚，但他们推测来自基因型组1和4的禽类呼肠孤病毒的抗原物质的这种特定组合一定为目标禽类的免疫系统呈递了触发免疫应答的抗原组合，所述免疫应答对于不同的禽类呼肠孤病毒基因型组呈递的广泛抗原特异性是交叉保护的。

因而，一方面，本发明提供用于减少禽类呼肠孤病毒感染的疫苗，所述疫苗包含来源于来自多于单个基因型组的禽类呼肠孤病毒的禽类呼肠孤病毒抗原物质和药学上可接受的载体，其中所述禽类呼肠孤病毒抗原物质由来源于来自两个基因型组：基因型组1和基因型组4的各一个的禽类呼肠孤病毒的抗原物质组成。

如本领域技术人员显而易见的，可以基于仅有限数量的抗原的该广谱疫苗提供相对于包含来自所有基因型组的抗原的更广泛组合疫苗的若干明显优势。这些优势主要在于可以以这种方式获得的在人工和资本上的显著节省，这是由于生产、储存和质量控制的提高的效率和简化。

众所周知“疫苗”是具有内在医学效果的组合物，其包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。‘免疫活性组分’是被目标的免疫系统所识别的抗原分子（的组合），所述免疫系统诱导保护性免疫应答。所述应答可能起源于目标的先天和/或获得性免疫系统，并且可能是细胞和/或体液类型。

对于本发明的疫苗，接种的目标动物中诱导的免疫应答具有“减少禽类呼肠孤病毒感染”的效果。这是指例如通过减少病毒载量或缩短宿主动物中病毒复制的持续时间减少感染的水平或程度。

该效果可通过在其目标器官，如腱或肠中防止或减少禽类呼肠孤病毒生产性感染的建立或增殖而获得。继而，这导致目标动物中可能由病毒感染引起的损伤和临床体征的数量、强度或严重性的减少。该疫苗通俗地称为‘针对’禽类呼肠孤病毒的疫苗，或‘禽类呼肠孤病毒疫苗’。

确定本发明的疫苗用于减少禽类呼肠孤病毒感染的有效性完全在一般医师的技能内，并且可以例如通过在接种后或攻击感染后监测免疫应答，例如通过监测目标的疾病体征、临床得分、血清学参数，或通过病原体的再分离，并比较这些结果与模拟接种动物中看到的接种-攻击应答来完成。

将在下文概括本发明疫苗的多个实施方案、优选和实例。

“禽类呼肠孤病毒”为本领域所熟知，并且是属于禽类正呼肠孤病毒种的病毒。例如在众所周知的参考书，像：“The Merck veterinary manual” (第10版, 2010, C.M. Kahn 编辑, ISBN: 091191093X), 和：“Diseases of Poultry” (第12版, 2008, Y.M. Saif 编辑, ISBN-10: 0813807182)中描述了这些病毒及其诱导的疾病。

禽类呼肠孤病毒展示了其分类群-成员的表现特征，如形态学、基因组学和生物化学特征，以及生物学特征，如生理学、免疫学、或病理学行为。如本领域所知，微生物的分类基于这些特征的组合。本发明因而也包括这样的禽类呼肠孤病毒，其以任何方式由此被亚分类为例如亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等。

对技术人员显而易见的是，尽管本发明的禽类呼肠孤病毒目前被分类至特定种或属，但是这只是分类学划分，随着新观点导致重新划分至新的或不同的分类学组中，其可以及时改变。然而，因为这不改变微生物本身，或其抗原所有组成成分，而是仅其科学名称或分类，所以该重新划分的微生物仍然在本发明的范围内。

如本文所用的术语“包含（comprising）”（以及变异，如“包含（comprise）”、“包含（comprises）”和“包含（comprised）”）指所有要素，并且在可能用于本发明的任何可能组合中，其被其中使用该术语的文本部分、段落、权利要求书等涵盖或包括在其中，即使没有明确引用此类要素或组合；并且不是指排除任何此类要素或组合。因此，任何此类文本部分、段落、权利要求书等也可以涉及一个或多个实施方案，其中所述术语“包含（comprising）”（或其变异）被术语如“由…组成（consist of）”、 “由…组成（consisting of）”或 “基本上由…组成（consist essentially of）”所替换。

本发明的“抗原物质”原则上可以是来源于本发明的禽类呼肠孤病毒的任何类型的物质，只要其可以诱导保护性免疫应答（通过自身或与佐剂一起）。抗原物质因此必须具有这样的大小、结构、形式或质量，从而其在接种的目标禽类中诱导的免疫应答具有足够的强度以能够减少禽类呼肠孤病毒的感染。

本发明的抗原物质可以是复制型的禽类呼肠孤病毒（即‘活的（life）’ 禽类呼肠孤病毒）；灭活的（‘杀死的’）禽类呼肠孤病毒；或禽类呼肠孤病毒的部分，如亚基、提取物、级分、匀浆或超声物。

在本发明的抗原物质是禽类呼肠孤病毒的部分时，其可以是蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核酸分子、或这些中的一种或多种的组合。抗原物质可以生物来源或合成来源，并且可以直接或间接来源于本发明的禽类呼肠孤病毒。

对于本发明，“蛋白质”指氨基酸的分子链。蛋白质没有特定的长度、结构或形状，并且需要时，可以在体内或体外例如通过糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、聚乙二醇化，或空间折叠改变而被修饰。蛋白质可以是天然的或成熟的蛋白，前蛋白或原蛋白，或蛋白的部分。蛋白质可以是生物来源或合成来源。尤其是，多肽和肽包括在蛋白质的该定义中。

对于本发明，抗原物质“来源于”本发明的禽类呼肠孤病毒，如果其以任何方式获得自禽类呼肠孤病毒或其部分。为本发明获得的抗原物质可以便利地包含在载体，如缓冲液中，并且优选将是液体形式，以允许使用或操作本发明的抗原物质。技术人员完全能够选择和使用用于该目的的合适载体。

从禽类呼肠孤病毒衍生本发明抗原物质的方式的实例可以是在合适的宿主细胞中增殖本发明的禽类呼肠孤病毒，其后可以收集病毒，并通过本领域所熟知的标准技术进行分离。所收集的复制型病毒可以在具有或不具有宿主细胞或其部分的情况下使用。

也可以通过利用任何合适的技术，如利用热、放射，或利用化学品，如福尔马林、β- 丙内酯、二乙烯亚胺(binary ethyleneimine)或β-乙醇胺处理复制型禽类呼肠孤病毒获得灭活形式的本发明的禽类呼肠孤病毒。

另外，来源于本发明禽类呼肠孤病毒的抗原物质可以是禽类呼肠孤病毒的部分，如亚基、提取物、级分、匀浆或超声物。这些可以通过本领域所熟知的标准技术进行制备，并且可以从复制型病毒或从灭活的病毒开始。所使用的病毒可以来源于病毒培养物，如来源于细胞-沉淀物、培养上清液或完整的培养物。

也可以通过在重组DNA表达系统的细胞中表达禽类呼肠孤病毒基因衍生本发明的抗原物质：可以例如通过离心或过滤，任选地后接浓缩来收集并纯化这些细胞、上清液或完整培养物。或者，当所表达的蛋白留在表达系统的细胞内时，可以收集这些细胞，并且蛋白质可以产生为这些细胞的亚基、提取物、级分、匀浆或超声物。这些在本领域中是众所周知的。便利的表达系统来自细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物来源；例如：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌属种（Lactobacillus sp.），或新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）；酿酒酵母（Sacharomyces cereviseae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）；昆虫细胞/杆状病毒、果蝇；烟草；或Hela或CHO细胞。

获得本发明的禽类呼肠孤病毒抗原物质所需的方法和材料是病毒学、生物化学和分子生物学中的标准技术，其均为技术人员所熟知。例如，从本发明的禽类呼肠孤病毒获得病毒RNA以制备cDNA并操作其用于表达的分子-生物学技术和材料为本领域所熟知，并且例如广泛描述于众所周知的参考书中，如：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989); Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986)；和：Sambrook & Russell, 2001, 于: ‘Molecular cloning: a laboratory manual’, 第3版. New York, USA: Cold Spring Harbour Laboratory Press。

在本发明的禽类呼肠孤病毒的上下文中的“基因型组”指许多禽类呼肠孤病毒分离株，其可以基于它们的Sigma C蛋白的氨基酸序列的比对结果分组到一起，如本文所述。该组中的成员通过共有某一最小水平的其Sigma C蛋白的氨基酸序列同一性而相关。如此定义了5个禽类呼肠孤病毒的基因型组。

该氨基酸序列同一性比较是众所周知的方法来确定蛋白之间的进化亲缘关系或‘系统发育’。其表示为当比较氨基酸序列之间相应位置时相同的氨基酸相对于比对蛋白以氨基酸数目计的长度的百分比。注意：这不能与序列相似性混淆，在所述相似性中不同但相似的氨基酸也被计数。

优选使用计算机程序进行该比对以进行自动化（多重）配对比对。

为了建立本发明的禽类呼肠孤病毒基因型组的目的，决定性测试是通过使用计算机程序：“BLAST 2 SEQUENCES"，其可在NCBI网页上获得（通过选择"bl2seq"，和子程序: “blastP”，其可以见于： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用其默认的参数设置。程序优化了两条序列比对的方式，并且展示了重叠区域，和氨基酸之间相同匹配的数量和百分比。

对于本发明，在sigmaC蛋白的氨基酸1-277上进行氨基酸序列比对，其中来源于起始密码子的甲硫氨酸计数为第一个氨基酸。

多个基因型组中禽类呼肠孤病毒的比对得分列表呈现于所附表中。

为了表示基因型组内和基因型组之间的进化关系，比对结果可以呈现为系统发育树。这也可以例如使用程序PHYLIP (例如可从网址: www.phylogeny.fr获得) 或MEGA (Tamura 等, 2013, Mol. Biol. and Evol., 第 30卷, 第 2725-2729页; 最新版本: MEGA6)由计算机完成。表示为本发明所分析的禽类呼肠孤病毒的基因型组的该系统发育树的图呈现在所附图中。

在公共数据库如GenBank或EMBL中，sigmaC蛋白的超过200条氨基酸序列目前可从多种禽类呼肠孤病毒分离株中获得。这允许进行比较性比对，并将公开的禽类呼肠孤病毒毒株划分至如本文定义的基因型组中。

除了该大量公共序列信息外，本发明人可以获得许多近期爆发毒株的sigmaC蛋白的氨基酸序列。细节描述于下文实施例部分；简言之：将组织样品匀浆，并进行培养以扩增任何病毒。提取病毒RNA，并在RT-PCR中使用SigmaC特异的引物(Liu 等, 上文)，扩增编码SigmaC蛋白的禽类呼肠孤病毒基因组部分，均使用标准技术。然后确定该cDNA的核酸序列，并且DNA序列翻译成推测的氨基酸序列。然后将这与其他SigmaC序列进行比较，用于确定爆发分离株的基因型组。如所述，在爆发分离株中鉴定了所有5个基因型组的代表。

来自所有5个基因型组的许多代表性突破分离株的SigmaC蛋白氨基酸序列呈现在所附序列表中。

从这些分析发现，当复制型禽类呼肠孤病毒含有编码这样的SigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型组1，所述SigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1（禽类呼肠孤病毒分离株SL11A0823-2 BE的SigmaC蛋白的氨基酸序列）的氨基酸序列具有至少57%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

类似地，当复制型禽类呼肠孤病毒含有编码这样的SigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型组4，所述SigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 4（分离株nr. SL11A0823-1 BE的氨基酸序列）的氨基酸序列具有至少66%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

术语“复制型”用于指能够复制的禽类呼肠孤病毒，即为复制型的、非灭活的、或‘活的’病毒。所以，本发明的疫苗使用来源于禽类呼肠孤病毒的抗原物质，所述禽类呼肠孤病毒在一些时间点上是复制型的，并且然后含有编码具有所说明的同一性水平的SigmaC蛋白的遗传信息。然而，这并不表示抗原物质本身仍然需要完全含有该遗传信息或是完整的。

“药学上可接受的载体”是在疫苗的免疫活性化合物的制备、储存或施用中的助剂，其不给施用的目标动物的健康带来（严重的）副作用。该载体可以例如是无菌水，或生理盐水或磷酸盐缓冲盐溶液。载体更复杂的形式可以例如是缓冲液，其可以包含其他添加剂，如稳定剂或防腐剂。细节和实例例如描述于众所周知的参考书，如“Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472),和: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret 等编辑, 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)中。

属于基因型组1或4的禽类呼肠孤病毒因此可以用于制备本发明的疫苗。此类禽类呼肠孤病毒在本文中详细描述于实施例部分，同样它们也为本领域所熟知，并且可以被技术人员容易地获得。

例如，可以从可公开获得的禽类呼肠孤病毒样品使用禽类呼肠孤病毒；这些可能早已划分属于基因型组1或4，或可以如本文所述容易地被划分。此类样品可从许多大学和（家禽）研究机构，以及存储机构如ATCC(Manassas, VA, USA)、CNCM (Institut Pasteur, Paris, France)，或ECACC (Porton Down, UK)获得。

或者，可以从展示禽类呼肠孤病毒感染的临床体征，如病毒性关节炎或吸收不良的鸡的田间样品获得基因型组1和4的禽类呼肠孤病毒。可以从受感染的禽类的器官，如从：腱、跗关节、肝、脾或肠如空肠获得样品。病毒可以在体外进行培养并且可以例如在细胞培养中从其典型的cpe或使用禽类呼肠孤病毒特异性抗体鉴定为禽类呼肠孤病毒。也可以通过RT-PCR，使用文献或本文中描述的引物分析病毒RNA。下一步sigmaC氨基酸序列的计算机分析将指示样品的基因型组。

使用这些方法，本发明人已经分离并分析了大量禽类呼肠孤病毒分离株。本发明的疫苗从这些中的两种中制备，其在2011年从比利时不同的养鸡场中禽类呼肠孤病毒突破株分离；分离株名称是：SL11A0823-2BE 和SL11A0823-1BE。这些分别划分属于如本文定义的基因型组1和4。其SigmaC蛋白的氨基酸序列分别呈现于SEQ ID NO: 1和4中。

使用标准程序制备疫苗，简言之：已经从田间样品中扩增了病毒，并蚀斑纯化（plaque purified）了三次。下一步，在维洛（Vero）细胞上培养病毒，使用福尔马林进行灭活，并浓缩，然后将病毒抗原物质用轻质矿物油和乳化剂配制为油包水乳状液。

通过肌内施用向不同处理组的SPF蛋鸡施用一次单剂量疫苗。从接种后5周开始收集这些接种鸡的受精蛋。将这些蛋孵化，并利用来自不同基因型组的复制型禽类呼肠孤病毒给予后代小鸡攻击接种。通过检测攻击接种后3天获取的血液样品中的攻击病毒确定后代的疫苗效能。

在实施例部分中详细描述了接种结果，但是仅观察到含有来自基因型组1和4的禽类呼肠孤病毒抗原的疫苗具有有效的广谱保护：从接受多次同源或异源攻击接种的小鸡中几乎没有分离到攻击病毒。

相反，接受含有仅来自禽类呼肠孤病毒的单一分离株的抗原物质的疫苗的小鸡组仅针对同源攻击毒株进行保护；未接种的对照对所有样品中的攻击病毒都是阳性的；并且具有来自基因型组1和5的禽类呼肠孤病毒抗原的组合疫苗仅针对来自基因型组1或2的攻击病毒进行保护，与多价基因型1疫苗相同。

在优选的实施方案中，属于本发明的基因型组1的禽类呼肠孤病毒含有编码sigmaC蛋白的（复制型）遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少58%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

在优选的实施方案中，属于本发明的基因型组4的禽类呼肠孤病毒含有编码sigmaC蛋白的（复制型）遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少67%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列具有68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

在本发明疫苗的实施方案中，禽类呼肠孤病毒抗原物质由来源于两种禽类呼肠孤病毒的抗原物质组成；第一种是复制型禽类呼肠孤病毒，其含有编码sigmaC蛋白的遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少57%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且第二种是复制型禽类呼肠孤病毒，其含有编码sigmaC蛋白的遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列具有至少66%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

对于本发明，指示“第一”和“第二”仅用于方便参考，并不说明任何数字顺序或从属关系。

在优选的实施方案中，第一种禽类呼肠孤病毒含有编码sigmaC蛋白的（复制型）遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少58%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

在优选的实施方案中，第二种禽类呼肠孤病毒含有编码sigmaC蛋白的（复制型）遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列具有至少67%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 4的氨基酸序列具有68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

在禽类呼肠孤病毒的近期突破毒株的分析中，本发明人发现划分为基因型组1（如本文定义）的大多数分离株实际上形成这样的基因型亚组，其明显地不同于也属于基因型组1的经典疫苗型毒株。这与Troxler 等 (上文)的发现也一致。本发明人因而将经典的禽类呼肠孤病毒疫苗毒株的基因型组指定为基因型亚组1A，并将突破分离株的这部分的基因型组指定为基因型亚组1B。

因而，在本发明疫苗的实施方案中，来源于基因型组1的禽类呼肠孤病毒的抗原物质来源于基因型亚组1B的禽类呼肠孤病毒。

当复制型的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型亚组1B，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少78%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其他实施方案中，属于本发明的基因型亚组1B的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的（复制型）遗传信息，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少79%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

为了正确表征本文所用的禽类呼肠孤病毒的其他基因型组，这些也可以通过其SigmaC蛋白相对于参考氨基酸序列的氨基酸序列同一性水平来定义：

当复制型的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型亚组1A，所述sigmaC蛋白具有与GenBank登录号AAB61607 (禽类呼肠孤病毒毒株1733)中代表的氨基酸序列具有至少79%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与GenBank登录号AAB61607中代表的氨基酸序列具有80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

当复制型的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型组2，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 2 (禽类呼肠孤病毒分离株SL11A0294-12 FR的SigmaC蛋白的氨基酸序列) 的氨基酸序列具有至少58%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

当复制型的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型组3，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 3(禽类呼肠孤病毒分离株SL10A1581-32 ES的SigmaC蛋白的氨基酸序列) 的氨基酸序列具有至少57%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 3的氨基酸序列具有58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

当复制型的禽类呼肠孤病毒含有编码这样的sigmaC蛋白的遗传信息时，本发明的禽类呼肠孤病毒划分属于基因型组5，所述sigmaC蛋白具有与SEQ ID NO. 5 (禽类呼肠孤病毒毒株ERS的SigmaC蛋白的氨基酸序列) 的氨基酸序列具有至少65%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。更优选的：以优选顺序，与SEQ ID NO. 5的氨基酸序列具有66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或甚至100 %的氨基酸序列同一性。

在实施方案中，来源于禽类呼肠孤病毒的本发明的抗原物质是：复制型禽类呼肠孤病毒、灭活的禽类呼肠孤病毒，或禽类呼肠孤病毒的部分，如禽类呼肠孤病毒的亚基、提取物、级分、匀浆或超声物。更优选的是灭活的禽类呼肠孤病毒。

当抗原物质是灭活的禽类呼肠孤病毒，或是禽类呼肠孤病毒的部分时，所述抗原物质仍然含有促成免疫应答的禽类呼肠孤病毒的（全部）组分。

当抗原物质是灭活的禽类呼肠孤病毒，或是禽类呼肠孤病毒的部分时，本发明疫苗中包含的禽类呼肠孤病毒抗原物质的量在约1-约1000µg/动物剂量之间。禽类呼肠孤病毒抗原物质的优选量在约10-约500µg/剂量之间；更优选地在10-250µg/剂量之间，和25-100µg/动物剂量之间。

对于本发明，禽类呼肠孤病毒抗原物质/动物剂量的优选量可以分别与来自两个基因型组1和4各自的抗原物质的量相关，或两者组合的量相关。同样，来自一种基因型组的抗原物质/动物剂量的量不需要与其他基因型组的抗原物质的量相同。该最后的实施方案允许通过在绝对和相对意义上调整抗原的量来进一步优化本发明的疫苗效能。

当来源于本发明的禽类呼肠孤病毒的抗原物质是灭活的禽类呼肠孤病毒形式或禽类呼肠孤病毒的部分时，那么可以参考用于灭活或提取、分级分离(fractionation)、匀浆等的复制型病毒的量来表示量/动物剂量。或者，可以以生物化学术语，例如蛋白的量，或相对于已知的标准，以任意的 Elisa单位表示量/动物剂量。所有这些均为技术人员所熟知。

当来源于本发明的禽类呼肠孤病毒的抗原物质是复制型禽类呼肠孤病毒时，那么本发明的疫苗的病毒的量/动物剂量不如当疫苗基于灭活的禽类呼肠孤病毒或其亚基时严格。这是因为复制型禽类呼肠孤病毒将在目标禽类中繁殖高至生物可承受的病毒血症（vireamia）水平。然而，必须给予最小剂量以实现‘活’疫苗的有效‘获取’。在该方面，存在不同的方式来定量复制型禽类呼肠孤病毒；方便的是这样的一种，其在如组织培养滴定实验，或在易感细胞层上的蚀斑测定中计数实际的活病毒颗粒。本发明的禽类呼肠孤病毒的量然后可以表示为以组织培养感染剂量50% (TCID50)计的单位数或蚀斑形成单位(pfu)。同样，构成有效接种物剂量取决于用于本发明的特定呼肠孤病毒的活力和复制强度。

当来源于本发明的禽类呼肠孤病毒的抗原物质是复制型禽类呼肠孤病毒时，本发明疫苗的复制型禽类呼肠孤病毒的优选量以这种优选顺序，在约10-约1x10^7 TCID50的禽类呼肠孤病毒/动物剂量之间，更优选在1x10^2-1x10^6、1x10^2-1x10^5、1x10^2-1x10^4之间，甚至在500-5000 TCID50/剂量之间。

本发明的疫苗可以以目标动物可接受的体积施用，并且体积可以例如在约0.1-约10ml之间。优选地，一种剂量是在约0.2-约3ml之间的体积。

在实施方案中，本发明的疫苗额外包含稳定剂。这可以作用于保护易降解的组分，和/或增强疫苗的贮存期。一般地，此类稳定剂是高分子量的大分子，如脂类、碳水化合物或蛋白质；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、蔗糖、海藻糖、亚精胺、NZ胺、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液，如碱金属磷酸盐。

优选地，稳定剂没有动物来源的化合物，或甚至：是化学上确定的，如WO 2006/094.974中所公开。

同样可以添加防腐剂，如硫汞撒(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物和/或庆大霉素。

疫苗学中的一般技术和方法为本领域所熟知并例如描述于政府规程，如Pharmacopoeia中，和众所周知的参考书如“Remington” 和“Veterinary vaccinology” (上文)中。

用于本发明疫苗的目标动物是易受禽类呼肠孤病毒感染的禽类。优选的禽类目标是与人或兽医领域有关的禽类物种，例如：鸡、火鸡、鸭、鹅、鹧鸪、孔雀、鹌鹑、鸽子、雉、珍珠鸡、雀、乌鸦、长尾鹦鹉、鹦鹉(parrot)、鹦鹉(ara)、金刚鹦鹉、凤头鹦鹉、雀、猎鹰、鹰、鸸鹋、鹤鸵或驼鸟。

优选的是选自：鸡、火鸡、鸭和鹅的禽类目标物种。更优选的是：鸡，因为对于该禽类目标物种，禽类呼肠孤病毒感染和疾病的经济影响是最显著的。

对于本发明，禽类可以任何类型、品种或变种，如：蛋鸡、种鸡、肉鸡、混合品种，或任何此类品种的亲本品系。优选类型是：肉鸡、种鸡和蛋鸡。最优选的是种鸡，因为对于该类型的禽类，其接种导致它们的后代受到保护，所述后代最易受禽类呼肠孤病毒的感染。

对于本发明，作为接种目标的禽类种类不必与禽类呼肠孤病毒从中分离的禽类种类相同，所述禽类呼肠孤病毒用于衍生抗原物质用于本发明的疫苗。

在优选的实施方案中，从鸡中分离的禽类呼肠孤病毒用于本发明的疫苗。

本发明的疫苗可用作有效的引发接种，其稍后可以是加强接种并被加强接种放大。

用于本发明疫苗的目标动物原则上可以是健康的或生病的，并且对禽类呼肠孤病毒的存在，或对于针对禽类呼肠孤病毒的抗体可以是阳性的或阴性的。同样，所述目标可以是对接种易感的任何年龄。然而，接种健康的、未受感染的目标并且尽可能早接种以防止任何田间感染是明显有利的。

本发明的疫苗因此可用作预防性或治疗性治疗，或两者，因为其干扰禽类呼肠孤病毒感染的建立和进展。

在该方面，本发明疫苗减少病毒载量的其他有利效果是防止或减少脱落并由此防止或减少病毒垂直对后代及水平在群体或种群内和地理区域内的扩散。因此，本发明疫苗的使用导致禽类呼肠孤病毒盛行的减少。

因而，本发明的其他方面是：

-本发明的疫苗用于减少种群或地理区域中禽类呼肠孤病毒盛行的用途，和

-本发明的疫苗，其用于减少种群或地理区域中禽类呼肠孤病毒的盛行。

用于向目标禽类施用本发明的疫苗的方案可以是单次或多次剂量，其可以以与预期剂量和制剂相容的方式，并且以将在免疫学上有效的这样的量同时、并行或连续给予。

将用于施用本发明疫苗的方案理想地整合到目标禽类可能需要的其他疫苗的现有接种程序中，以减少对禽类的应激并减少劳动成本。

原则上可以通过不同的应用途径，并在其生命中的不同点给予禽类目标本发明的禽类呼肠孤病毒疫苗，只要所施用的疫苗可以建立有效的免疫应答。

在实施方案中，在孵化当天或其后不久，即第1-3天龄向小鸡施用本发明的疫苗。或者，在孵化之前不久蛋内(in ovo)施用本发明的疫苗；对于小鸡而言，这是胚胎发育的约第18天。

优选在预期的产蛋开始之前不超过4周向禽类目标动物施用本发明的疫苗。

这样，后代可以有效地受到母体来源抗体的保护，和/或减少或防止通过垂直传播的感染。

向目标禽类施用本发明疫苗的优选途径是：通过注射作为肠胃外应用，例如肌内或皮下；通过粗滴剂(coarse drop)，例如作为喷剂、滴眼剂或口鼻应用；或经过饮食途径。

优选的应用途径是通过肌内或皮下注射；优选在大腿肌肉或胸肌中肌内注射，或在颈部皮下注射。这同样应用于当本发明的禽类呼肠孤病毒的抗原物质是复制型病毒、灭活病毒或亚基时。

理所当然的是最佳的应用途径将取决于所使用的具体疫苗制剂和目标禽类的具体特征。

进一步优化本发明的疫苗完全在技术人员的技术范围内。一般地，这涉及疫苗效能的精细调节，以便其提供足够的免疫保护。这可以通过调整疫苗剂量，或通过使用另一种形式或制剂的疫苗，或通过调整疫苗的其他成分（例如稳定剂或佐剂），或通过经不同途径的应用来完成。

疫苗可以额外地包含其他化合物，如佐剂、额外的抗原、细胞因子等。或者，本发明的疫苗可以有利与药物组分，例如抗生素、激素、抗炎药物或抗寄生物药物组合。

在实施方案中，本发明的疫苗包含佐剂。

这尤其应用于当来源于本发明的禽类呼肠孤病毒的抗原物质是失活的病毒形式，或是本发明禽类呼肠孤病毒的部分时。作为非复制型，此类抗原物质通常需要额外的免疫刺激以能够诱导有效的广谱接种。

“佐剂”是众所周知的疫苗成分，其一般是以非特异性方式刺激目标的免疫应答的物质。许多不同的佐剂为本领域所知。佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、铝组合物，如磷酸铝或氢氧化铝、非离子嵌段聚合物和多胺，如硫酸葡聚糖、Carbopol®、吡喃、皂苷，如Quil A®或Q-vac®。皂苷和疫苗组分可以组合到ISCOM® 中(EP 109.942、EP 180.564、EP 242.380)。

此外，肽如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽经常用作佐剂，和油-乳状液，使用矿物油例如Bayol™或Markol™、Montanide™或轻质矿物（石蜡）油；或非矿物油，如角鲨烯、角鲨烷，或植物油，例如油酸乙酯。同样，可有利地使用组合产品如来自Seppic™的ISA™，或DiluvacForte™。乳状液可以是油包水(w/o)、水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w)，或双油乳状液(double oil-emulsion, DOE)等。

在优选的实施方案中，本发明的疫苗包含油包水乳状液。

此类乳状液在接种动物中提供缓慢释放抗原的储存效应，由此提供目标免疫系统的延长刺激。

在优选的实施方案中，油包水乳状液的油相包含矿物油或油酸乙酯。

在本发明疫苗的实施方案中，抗原物质是在油包水乳状液中配制的灭活的禽类呼肠孤病毒，由此油包水乳状液的油相包含矿物油或油酸乙酯。

理所当然的是，佐剂化、添加媒介物化合物或稀释剂、乳化或稳定本发明的疫苗的其他方式也在本发明范围内。

在实施方案中，本发明的疫苗额外包含寡聚脱氧核苷酸，其是免疫刺激的含非甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸(INO)。优选的INO是禽类Toll样受体(TLR) 21激动剂，如WO 2012/089.800 (X4家族)、WO 2012/160.183 (X43家族)或WO 2012/160.184 (X23家族)中所述。

本发明的疫苗可以有利与其他抗原物质组合成组合疫苗。然而，不需要来源于禽类呼肠孤病毒的其他抗原物质。

因而，在本发明疫苗的实施方案中，所述疫苗包含来源于对禽类致病的微生物而非禽类呼肠孤病毒的额外抗原物质。

“额外的抗原物质”自身可以是复制型或灭活形式、或亚基，并且可以具有或不具有佐剂。额外的抗原物质来源于对目标禽类致病的其他微生物。其例如可以包含生物或合成分子，如蛋白质、碳水化合物、脂多糖、编码蛋白质抗原的核酸。同样，宿主细胞包含该核酸，或活的重组载体微生物含有该核酸可能是向目标禽类递送核酸或额外抗原物质的方式。或者，额外的抗原物质可以包含灭活的微生物，如寄生物、细菌或病毒。

或者，本发明的疫苗自身可以添加到疫苗中。

本发明的组合疫苗的有利效果是其不仅针对禽类呼肠孤病毒，还针对目标禽类的其他病原体诱导免疫应答，同时仅需要单次处理目标动物用于接种，由此减少目标的不适以及时间和劳动成本。

本发明“对禽类致病的微生物”为本领域所熟知。额外的抗原物质因而原则上可以来源于对禽类致病的任何病毒（除了禽类呼肠孤病毒）、细菌、寄生物、真菌、立克次体、原生动物和/或寄生物，所述禽类也是用于减少本发明的禽类呼肠孤病毒感染的疫苗的目标。

在优选的实施方案中，对禽类致病的病毒选自：传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、禽腺病毒、禽星状病毒、禽副黏液病毒、减蛋综合征病毒、鸡腺病毒、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸽痘病毒、马立克（Marek）病病毒、禽类白血病病毒(avian leucosis virus)、传染性喉气管炎病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒和鹅细小病毒。

在优选的实施方案中，对禽类致病的细菌选自细菌属：埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、鸟杆菌属（Ornithobacterium）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、巴斯德菌属（Pasteurella）、博德特氏菌属（Bordetella）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、支原体属（Mycoplasma）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、包柔氏螺旋体属（Borrelia）、肠球菌属（Enterococcus）、禽杆菌属（Avibacterium）、里氏杆菌属（Riemerella）、李斯特菌属（Listeria）、志贺氏杆菌属（Shigella）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、衣原体属（Chlamydia）和梭菌属（Clostridium）。

在优选的实施方案中，对禽类致病的寄生物选自寄生物属：艾美球虫属（Eimeria）和隐孢子虫属（Cryptosporidium）。

在优选的实施方案中，对禽类致病的真菌选自真菌属：曲霉属（Aspergillus）和念珠菌属（Candida）。

在其他方面，本发明涉及用于制备本发明疫苗的方法。

此类方法导致本发明疫苗的可用性，所述疫苗具有减少禽类中禽类呼肠孤病毒感染的有利作用，如上所述。

通过技术人员所熟知的方法进行本发明疫苗的“制备”。此类制造方法一般包括混合和配制来源于本发明禽类呼肠孤病毒的抗原物质与药学上可接受的赋形剂，随后分配到适当大小的容器中的步骤。制造过程的多个阶段需要通过适当测试来监测，例如通过用于抗原的质量和数量的免疫测试；通过用于外来因子(extraneous agents)的无菌性和不存在的微生物测试；和最终通过体外或体内实验来测定疫苗效能和安全性。所有这些为技术人员所熟知，并且描述于参考书和政府规程如Pharmacopoeia中。

可以将本发明的疫苗制备成适合于向禽类目标施用并且与期望的应用途径和期望的效果匹配的形式。

优选地，将本发明的疫苗配制成可注射液体，如：悬浮液、溶液、分散液，或乳状液。通常将此类疫苗制备为无菌的。

在实施方案中，从灭活的禽类呼肠孤病毒抗原物质制备本发明的疫苗。现在可以使用众所周知的技术制造本发明的这种灭活的禽类呼肠孤病毒疫苗。

因而，在其他方面，本发明涉及用于制备本发明的疫苗的方法，其包括灭活来自两个基因型组：基因型组1和基因型组4各一种的禽类呼肠孤病毒的步骤。

可以以许多方式，例如通过使用宿主动物，并从血液和/或器官中收集病毒完成复制本发明的禽类呼肠孤病毒。然而，优选的是使用对禽类呼肠孤病毒易感的宿主细胞的体外培养系统。该培养系统可以比体内生产更好地被监测和控制，并且可以优化病毒产量。通常，体外培养系统使用培养瓶和（半）限定培养基。宿主细胞可以来源于动物，产生原代细胞，或可以是永生细胞，如来自建立的细胞系。在小规模上，培养瓶可以是平底烧瓶或滚瓶烧瓶；对于大规模培养，培养瓶可以是发酵罐，其也允许适当时监测和调节培养的若干严格参数，并且这甚至可以自动化。用于本发明任何规模的体外培养系统的技术、材料和设备是众所周知的并且可容易地从许多生命科学工业的商业供应商获得。

在实施方案中，用于本发明的制备的方法包括以下步骤：

a. 在体外细胞培养中繁殖禽类呼肠孤病毒，

b. 收集并灭活所述禽类呼肠孤病毒，和

c. 使所述灭活的禽类呼肠孤病毒与药学上可接受的载体混合。

在其他实施方案中，本发明的制备方法包括将本发明定义的禽类呼肠孤病毒抗原物质与佐剂混合的步骤。

在其他方面，本发明涉及本发明疫苗、或本发明所述的禽类呼肠孤病毒抗原物质的不同医学用途。这些材料和方法产生在禽类中减少禽类呼肠孤病毒感染的有利效果，如上所述。

因而，在其他方面中，本发明涉及：

-包含由来源于来自两种基因型组：基因型组1和基因型组4的各一种的禽类呼肠孤病毒的抗原物质组成的禽类呼肠孤病毒抗原物质的组合物，其用于疫苗用于在禽类中减少禽类呼肠孤病毒的感染。

-由来源于来自两种基因型组：基因型组1和基因型组4的各一种的禽类呼肠孤病毒的抗原物质组成的禽类呼肠孤病毒抗原物质用于制造在禽类中减少禽类呼肠孤病毒感染的疫苗的用途。

-本发明的疫苗，其用于减少禽类中禽类呼肠孤病毒的感染。

-本发明疫苗或通过本发明方法可获得的疫苗用于减少禽类中禽类呼肠孤病毒的感染的用途。

-用于减少禽类中禽类呼肠孤病毒感染的方法，其包括向禽类施用本发明的疫苗或通过本发明方法可获得的疫苗。

本发明现在将通过以下非限制性实施例进一步进行描述。

实施例

1．禽类呼肠孤病毒分离和样品制备

通过在鸡胚肝细胞(CEL)上培养组织匀浆从鸡器官中分离禽类呼肠孤病毒。简言之：从（可能）被感染的鸡获得组织，如腱、肝、空肠和血液。将血液离心并收集血清。切出组织样品。将这些置于含有约0.5 cc直径约1mm的玻璃珠和1 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)（其含有抗生素和抗真菌化合物的混合物）的6ml试管中。通过在Mixer Mill球磨机(Retsch)中振荡20分钟将样品匀浆，随后通过离心进行澄清。收集上清液并可以将其冰冻储存于-70 ℃以备后用。

根据标准方案，在使用前新鲜制备原代CEL细胞，简言之：14-16天龄的SPF鸡胚用于获得肝。肝在PBS中洗涤两次以去除血液，然后进行孵育，同时在37 ℃下胰蛋白酶/PBS溶液中搅拌15分钟。用FCS中和胰蛋白酶，并将胰蛋白酶消化的混合物在600xg下离心10分钟。将沉淀重悬浮在标准生长培养基（包含抗生素与5%胎牛血清（FCS）的混合物）中。将其过滤一次以去除凝块，然后计数CEL细胞并直接使用。

以1.5 x 10^6细胞/ml将5ml生长培养基(5 % FCS)中的CEL接种到T25培养瓶中，并在加湿保温箱中于37℃和5 % CO₂中孵育过夜，以允许建立单层。第二天，通过包含2 % FCS的培养基替换培养基，并且利用病毒样品如50 µl血清或组织上清液接种烧瓶，然后将烧瓶孵育4-7天。

第一轮孵育后，CEL细胞层经常看起来被碎片破坏，以致看不见明显的细胞病变效应(cpe)，于是通常给予第二次传代：制备新鲜的CEL、接种并孵育为单层，然后接种来自第一次传代的50 µl培养上清液。将其孵育4天，其后可以在烧瓶中清楚地观察到禽类呼肠孤病毒特异的cpe（CEL细胞看起来变黑并呈颗粒状，具有半透明爆炸（blast）样小囊泡）。对于cpe阴性烧瓶，可以给予第三次传代。最后，收集第二次或第三次传代的培养上清液并冰冻储存(-70℃)以备后用。

命名并计数分离株，由此SL代表‘服务型实验室’，后接分离年份、年代分离株编号的两个数字，和用于分离的供体材料的国家的2字母代码。

分离的病毒样品可以直接用于RNA分离、RT-PCR和序列分析。给予动物实验中使用的分离株进一步处理：直接从第三轮扩增的分离株扩增用于攻击接种的样品，以通过在依次更大的培养容器，如Cellstar™ 平底细胞培养瓶(Greiner Bio-One)中的T75(15 ml培养)或T175 (25 ml培养)、或490 cm²滚瓶烧瓶(150 ml培养) (Corning, Fischer Scientific)中在CEF细胞的CEL上增殖来获得更高的效价和更大的体积，所有均在标准培养基中并在标准培养条件下。这样，由以下制备攻击接种物：

-SL11A823-2 BE (基因型组1): 7.95 Log10 TCID50/ml

-SL11A294-12 FR (基因型组2): 6.32 Log10 TCID50/ml

-SL10A1581-32 ES (基因型组3): 5.95 Log10 TCID50/ml

-SL11A823-1 BE (基因型组4): 7.70 Log10 TCID50/ml

如下所述将用于制备疫苗的禽类呼肠孤病毒突破分离株的样品首先进行蚀斑纯化3次，然后以类似的方式进行扩增。

2．目标动物中病毒分离株的毒力验证

与Koch的假定一致，在鸡实验性感染中证明了禽类呼肠孤病毒分离株的致病性和再分离。从无特定病原体（SPF）的母体，或从呼肠孤病毒接种的母体使用1天龄的小鸡。这些后者小鸡中的测试（其对针对经典呼肠孤病毒毒株的母体来源的抗体(MDA+)呈阳性）用于验证这些病毒分离株的接种-突破能力。用于攻击接种的病毒是分离株：SL11A823-1BE、SL11A823-2BE、SL11A0294-12 FR和SL10A1581-32 ES，其如上所述进行分离和扩增。经口应用接种以模拟天然的感染途径，或者通过肌内途径，其已经观察到是有效得多的攻击-接种途径。

2．1 实验设计

使用翅膀带（wingbands）标记混合性别的200天龄的SPF小鸡，并以20小鸡/组将其置于单独的负压隔离器中。小鸡是白来杭蛋鸡，可以随意获得饲料和水，并且不包括明显弱或小的鸡。此外，将10只孵化配偶放血以提供血清样品来测试抗体状态。

在放置当天施用攻击接种，并且共10个隔离器用于圈养不同的组：2个隔离器用于利用禽类呼肠孤病毒分离株的各自接种物，一个组接受经口接种，另一个组接受肌内接种。作为阳性对照，添加一个隔离器，其中小鸡接受利用活的减毒呼肠孤病毒疫苗毒株1133通过肌内途径的对照接种。同样，一个隔离器圈养接受仅模拟接种的阴性对照组。

对于经口和肌内途径，所有接种均以0.1 ml剂量/小鸡和4.5 Log10 TCID50/小鸡给予。新鲜制备并且在施用前1小时内制备病毒-接种物稀释液，并将其保持在冰上直至使用。剩余的接种物用于反向滴定，以验证已经应用的接种物剂量。

在合格人员的实验过程中每天观察所有小鸡疾病的临床体征或其他异常的发生。显示疼痛或不适的动物进行安乐死并进行尸体剖检。

在接种后3天和10天获取所选小鸡用于取样，由此收集血液和组织样品。从血液中获得血清，其一半用于病毒再分离，一半用于抗体测定。多种组织（腱、肝和空肠）用于匀浆和病毒再分离。

2．2 毒力验证实验的结果

阴性对照小鸡，或任何其样品，以及来自第0天孵化仔(hatchmates)的血清不显示与实验相关的任何疾病或感染的体征。同样，用禽类呼肠孤病毒1133疫苗毒株接种的阳性对照组展示预期的病毒阳性组织（腱、肝）和血清样品（10天p.i.），所以实验是有效的。

接种样品的反向滴定显示所有接种在预期的4.5 Log10 TCID50剂量/小鸡的± 0.2 Log10 TCID50内。

2．2．1 一般观察

-来自血液的病毒再分离仅在3天p.i.，而在10天p.i.不是阳性的

-检测血清应答对于田间分离株在3或10天p.i.证明为阴性，仅分离株1133接种在10天p.i.确实变得Reo抗体阳性。显然，抗体效价在此时仍然不够高来允许通过商业测试来检测所用的禽类呼肠孤病毒抗体(IDEXX REO抗体Elisa)。

-对于所有所测试的病毒分离株并且在3和10天p.i.，肌内接种比经口接种致使多得多的样品对病毒再分离呈阳性

-通过经口和肌内途径所有田间分离株均为强毒的。所观察到的临床体征是抑郁和生长迟缓，接种腿跛行，或完全不动。同样，经常观察到肠炎和肝坏死。偶然地在测试动物中甚至观察到死亡：对于通过经口途径的SL11A823-2 BE (基因型组1)分离株，和通过肌内途径的SL10A1581-32 ES (基因型组3)分离株。

-尽管毒株1133显示对腱的偏好，但是从肝或空肠中以最高量再分离了田间分离株；对于各田间分离株，在7天p.i.从空肠中获得了全部最高再分离。

3．核酸分离、扩增和DNA测序

来自第二次和第三次分离传代的培养上清液用于分离总的病毒禽类呼肠孤病毒RNA。这用于制备并扩增cDNA，其然后可用于DNA测序。标准方法和条件应用于所有程序，其使用商品化试剂盒和自动化的实验室设备。

简言之：使用MagNA Pure™ 96 (Roche)在200 µl培养上清液样品上进行病毒RNA分离。该设备应用于裂解样品，并使用磁珠分离核酸。下一步，根据制造商书的说明，利用SuperScript™ III 第一链合成试剂盒(Invitrogen)通过反转录将洗脱的核酸用于制备第一链cDNA。

对禽类呼肠孤病毒SigmaC基因特异的所用引物是：

REO FW1: 5’- AGTATTTGTGAGTACGATTG - 3’ (SEQ ID NO: 19)

REO REV5: 5’- GGCGCCACACCTTAGGT - 3’ (SEQ ID NO: 20)

由此引物REO FW1结合SigmaC基因的上游（禽类呼肠孤病毒S1基因组区段上的大概位置：核苷酸533-552），和引物REO REV5结合SigmaC基因的3’末端（大概的S1区段位置：1621 - 1605）；这使得不能确定SigmaC基因下游倒数第二位的核苷酸。引物REO FW1用于第一链合成，并且两条引物FW1 和REV5用于PCR扩增和测序反应。这些引物可以用于来自所有基因型组的禽类呼肠孤病毒样品，然而，反向引物偶然不够有效，所以对于一些禽类呼肠孤病毒样品，设计并使用额外的引物，以进一步扩增病毒核酸。

cDNA合成后，通过PCR，使用在具有2 µl cDNA的50 µl样品中0.4 µM 终浓度的FW1 和REV5引物，使用Phusion™ High-Fidelity DNA聚合酶和主混合物(Thermo Scientific)扩增样品。所用的PCR条件是：60秒，98℃；10秒，98℃，30秒，58℃，和30秒，72℃，共35个循环；随后在72℃下10分钟。

通过在含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶(Hispanagar)上通过琼脂糖凝胶-电泳，并通过与Smartladder™ (Eurogentec) 200-10.000 bp标志物泳道比较来验证cDNA制备物。常规获得约1.1 kbp的凝胶条带，说明成功的禽类呼肠孤病毒SigmaC基因扩增。

使用QIAquick™ PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化对1088bp条带呈阳性的PCR样品。下一步，在NanoDrop™分光光度计(Thermo Scientific)中测量DNA浓度。通常，获得10-40 ng/µl的病毒cDNA。

使用自动化循环测序设备完成DNA序列测定并使用计算机软件装配、比对和分析序列读取，所有均根据制造商的说明书。简言之：在20µl/反应中，利用20-70 ng病毒cDNA（通常是1或2µl纯化的PCR扩增病毒cDNA样品），和0.5 µM的FW1或REV5引物，使用Big Dye™ Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行第一个循环测序PCR。测序PCR程序是：10秒，96℃，5秒，50℃，和2分钟，60℃，共25个循环。下一步，将样品保持在15℃直至分析。

下一步，使用Dye Ex™ Spin试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明书纯化测序-PCR样品，并将样品储存在4℃直至测序运行开始。

通过毛细管电泳，使用ABI 3500 Genetic Analyzer™和相应的软件(Applied Biosystems)进行DNA测序。然后使用Sequencher™ v.54软件(Gene Codes Corp.)分析序列数据。

可以通过使用额外的引物，与SigmaC基因的内部区域杂交来解决装配序列中的一些错读，以提供额外的重叠读取。

4．序列比对和系统发育

从如上所述的测序的田间分离株和公共数据库中分析SigmaC蛋白的禽类呼肠孤病毒氨基酸序列。使用程序的组合比对氨基酸序列，所述程序如：SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html)用于多重配对序列比对，和MEGA6(上文)用于收集结果和系统发育。使用BlastP(上文)的一对一比对验证比对，并且来自该程序的得分在将基因型组归因于病毒序列中起决定性作用。

在若干禽类呼肠孤病毒爆发分离株中，编码SigmaC蛋白的基因的3’区的大约后30个核酸不能被可信地测定，因为这些碱基直接跟着下游PCR引物。同样，对于来自公共数据库的若干序列，SigmaC蛋白的C末端上的信息是缺失的。所以为了优化比对中的重叠，在这些分析中不使用SigmaC蛋白氨基酸序列的C末端。然而，这看起来不影响分组的精确性，如Kant 等 (上文)也已经提出：使用少于完整SigmaC蛋白氨基酸序列仍然可以提供可靠的分组。类似地，偶然的序列错读不妨碍分析。

可能时使用SigmaC蛋白的氨基酸1-277进行比对；短的多的序列不包括在分析中。略微短的序列诸如ISR-5223仍被包括，因为这提供了与现有技术类型基因型分组的联系。

比对得分四舍五入至整数，与BLAST程序提供的得分结果一致。然而，这表示这些数值精确高达0.49%，其在277氨基酸长度上对应于2个氨基酸。

在下文表部分中给出了描述所分析的多条序列及其分组的表，并且在图中呈现五个基因型组的系统发育的图形表示。从所测试的许多田间样品中，此处仅再生了所选数量的相关和代表性样品：表1描述了最相关的这些田间样品，对于其全长氨基酸序列呈现于所附序列表中的那些进行进一步的选择，参见表2。在表3中列出了最相关的公共可得序列，及其相应的数据库登录号，和其先前基因型分组。

表4在若干部分中呈现了不同基因型组的禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列配对多重比对的结果；基因型组的参考毒株的氨基酸序列与所列序列比对。这些结果是百分比氨基酸序列同一性，并且对于基因型（亚）组的代表性成员以及其他基因型组的参考毒株呈现。从这些比对中，扣除截止值，其作用于表征本文定义的不同基因型组。

5．田间分离株的蚀斑纯化

对于两个禽类呼肠孤病毒突破毒株，进行蚀斑分离以获得克隆纯(clonally pure)的病毒分离株用于接种研究。这些是分离株：SL11A823-1BE和：SL11A823-2BE，其分别属于基因型组：4和1。这在组织培养皿中在琼脂下CEL细胞上使用病毒蚀斑的标准分离来完成。简言之：制备两份病毒分离株的稀释液，高达1x10^-8。下一步，利用5x10^6细胞/ml的1 ml CEL细胞、1 ml病毒稀释液和具有FCS和抗生素的3 ml标准生长培养基接种6cm直径的细胞培养皿。过夜孵育所述皿。第二天，去除上清液培养基，并利用PBS洗涤单层两次。下一步，给予培养皿在49℃下以2.25 %溶解于蒸馏水中的bacto琼脂和在37℃下2x培养基的1：1混合物的5ml琼脂糖覆盖。将培养皿孵育4天，并用中性红染色：给予每个培养皿PBS中0.04 % v/v 中性红的2ml 溶液。将其孵育6小时，其后病毒蚀斑可见。

对于每个病毒分离株，从具有来自高稀释液的清晰分开的蚀斑的培养皿挑取若干单独的蚀斑。将蚀斑溶到0.5ml的PBS中。下一步，在T25培养瓶中CEL细胞上给予每个蚀斑分离株一轮扩增。

使用来自前一轮的0.1 ml蚀斑扩增物将蚀斑分离再重复两轮，达到一共三轮蚀斑纯化；也一直包括阴性对照培养皿和烧瓶。

然后在较大的组织培养瓶中原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上扩增第3轮蚀斑纯化的禽类呼肠孤病毒分离株；基本以与CEL细胞相同的方式制备CEF细胞，例外是整个胚用于胰蛋白酶消化。扩增产生大量高滴定的病毒原液用于进一步使用；可以常规获得7 - 8 Log10 TCID50/ml的滴度。

6. 疫苗制备

进一步扩增蚀斑纯化的禽类呼肠孤病毒分离株用于生产实验疫苗。为了该目的，在Vero细胞上繁殖病毒，收集培养上清液，利用甲醛灭活，并将灭活的病毒抗原用于利用矿物油佐剂乳化成油包水乳状液疫苗。简言之：将1x10^5细胞/ml的Vero细胞悬浮液接种到具有FCS和抗生素的500ml标准生长培养基的1750 cm²滚瓶中。用1ml扩增的蚀斑纯化禽类呼肠孤病毒分离株SL11A823-1BE或SL11A823-2BE接种滚瓶，并在滚动的同时于37℃孵育。

5-6天后观察到100% cpe，并收集培养上清液。将稀释的福尔马林加入到培养上清液至0.2% v/v的终浓度。将该混合物在37℃下放置以灭活48小时，同时在200rpm下搅拌。

灭活后，通过超滤将禽类呼肠孤病毒抗原浓缩约20倍。在实验室规模上，这使用具有10 kDa截止膜的Centriprep™离心过滤器设备(Millipore)来进行：将15ml体积的样品在20 ℃下3000xg离心40分钟。将浓缩的病毒抗原在2-8℃冰箱储存直至进一步使用。

通过组合禽类呼肠孤病毒抗原物质与油相制备佐剂化的疫苗。已经通过无菌搅拌注射用水与浓缩的病毒抗原制备了水相。油相含有液体石蜡作为矿物油和乳化剂，（在实验室规模上）使用Ultra Turrax™ (IKA)将所述乳化剂与油匀浆，下一步通过0.2 µm Ultipor™尼龙滤器(Pall)无菌过滤油相。然后使用Ultra Turrax乳化所述油相和水相，运行几分钟以避免加热混合物超过40℃。然后通过光学显微镜检查同质性。重复进行直至所有水泡小于3 µm。

下一步，将准备好的疫苗在无菌条件下分配至标记的无菌瓶中，将瓶用硝基橡皮塞封闭，并用编码的铝盖密封。将最终的疫苗产品冰箱储存直至使用。

以这样的方式制备本发明的禽类呼肠孤病毒疫苗。对于0.5ml/鸡的疫苗剂量，疫苗制备为含有1 % v/v/ml (相对于乳化疫苗的最终体积) 的SL11A823-1BE (以8.32 Log10 TCID50/ml)的病毒抗原和2% v/v的SL11A823-2BE (以6.45 Log10 TCID50/ml)。对照疫苗不含有病毒抗原或含有这两种病毒抗原中的仅一种。

制备类似疫苗以充当可比较实例，其含有其他禽类呼肠孤病毒抗原：‘经典’疫苗毒株1733和2408，作为多体单基因型组疫苗；或毒株1733、2408和ERS的组合，其含有来自基因型组1（两倍）和5的抗原。用于这些比较疫苗的抗原的量与目前商业化疫苗相同，并且针对已知的标准参照以任意Elisa单位进行测量。

7.接种-攻击实验

如上所述制备的油包水疫苗用于动物接种-攻击试验中。在一系列实验中，基于来自基因型组1和4的禽类呼肠孤病毒抗原物质，用本发明的疫苗接种蛋鸡，而它们的后代通过攻击接种经受来自不同基因型组的禽类呼肠孤病毒的严重感染，以证明此类疫苗对同源和异源攻击病毒感染的广谱保护和交叉保护性质。

7.1实验设计

7.1.1 亲代接种

将正常的健康SPF蛋鸡分配到8组中，每组12只。鸡是白来杭蛋鸡，约32周龄，并向每组的12只母鸡中加入一只公鸡。

用一剂量(0.5 ml)的上述油包水疫苗经肌内在右胸肌接种母鸡。不接种公鸡以提供阴性对照血清样品。从接种后5周，每天收集鸡蛋用于对后代的后续攻击-接种实验。将鸡蛋储存在4 ℃直至使用。

在具有Hepa过滤空气进口和出口的防护设备中圈养所有的鸡。可随意获得标准的鸡饲料和自来水。

随着鸡到手上(came to hand)将它们分配至组中，尽管给每组母鸡提供了一只公鸡。使用翅膀带(wing-bands)或吊牌(swift-tags)单独标记鸡。

在接种前将所有的鸡放置一周用于适应，并在实验过程中由合格人员每天观察疾病临床体征或其他异常的发生。

亲代接种程序：

组1：疫苗：SL11A823-1BE抗原

组2：疫苗：SL11A823-2BE抗原

组3：疫苗：SL11A823-1BE抗原和SL11A823-2BE抗原

组4：疫苗：模拟疫苗（不含禽类呼肠孤病毒抗原）

组5：‘经典’禽类呼肠孤病毒疫苗：‘毒株1733和2408抗原

（与商品化疫苗Nobilis® Reo Inac类似的疫苗）

组6：‘经典’禽类呼肠孤病毒疫苗（毒株1733和2408抗原），具有毒株ERS抗原

公鸡：无疫苗

7.1.2后代攻击接种

该实验作用于测试来自接种亲代的后代中的保护，其克服严重的禽类呼肠孤病毒感染的能力，甚至当攻击病毒来自不同于疫苗病毒的基因型组时。由于规模和大小，这在两次连续实验中进行，一次测试利用分离株SL11A294-12 FR (基因型组2)和SL10A1581-32 ES (基因型组3)的攻击接种，并且两周后在来自相同亲代的新生后代上，使用分离株：SL11A823-1 BE (基因型组4)和SL11A823-2 BE (基因型组1)的另一系列攻击接种。

对于这两次实验，从亲代接种实验收集的鸡蛋（通过其亲代处理组分开）在标准的孵化保温箱中孵育直至在第21天孵化。集中一天龄的小鸡（混合性别）并使用翅膀带进行标记。明显弱或小的小鸡不包括在内。将来自每个亲代处理组的10只小鸡放血以提供血清样品来测试小鸡初始的MDA状态。然后通过放置在分离的负压分离器中分开小鸡，于是每个亲代处理组具有一个分离器，含有24-30只小鸡。可随意获得饲料和水。

在放置的当天施用攻击接种：每个分离器使用一种类型的攻击病毒，由此一半的小鸡通过经口途径接受攻击，并且剩余的一半通过肌内途径接受。在3或10天p.i.将小鸡放血用于收集血液样品。

对于所测试的四种攻击病毒的每一种，以4.5 Log10 TCID50/小鸡，0.1ml剂量给予攻击接种，并且通过肌内(i.m.)途径接种。新鲜制备和在施用前一小时内制备攻击病毒稀释液，并将其保持在冰上直至使用。剩余接种物用于反向滴定，以验证已经应用的接种物剂量。

在实验过程中由合格人员每天观察所有小鸡疾病临床体征或其他异常的发生。将显示疼痛或不适的动物安乐死并进行尸体剖检。

7.2 样品分析

在接种后2周和4周，以及接种前1周（第0天）从亲代获取血液样品。在实验开始和3或10天p.i.从后代获取血液样品。

将血液样品室温下转运至实验室。在室温下凝固后，收集血清。对于后代：将一半血清储存在-70 ℃用于病毒分离；剩余的血清样品在56℃下加热灭活30分钟，随后储存在-20℃直至使用。

使用IDEXX REO抗体Elisa，根据制造商的说明书完成血清中禽类呼肠孤病毒抗体的检测。

基于第0天样品和阴性对照样品中针对禽类呼肠孤病毒的抗体在亲代中的缺失确定实验的有效性。

根据其亲代的处理，来自接种的母鸡的后代针对禽类呼肠孤病毒是MDA+。

已经在血液样品凝固后获得了用于病毒再分离的血清，并且在没有进一步处理的情况下将其冷冻在-70℃。当测试这些样品时，已经将CEL细胞以2 ml /孔且1x10^6细胞/ml接种至6孔组织培养板中具有5% FCS和抗生素的标准培养基中。将其过夜孵育以形成单层。第二天，去除培养上清液并用不含FCS的4ml标准培养基替换。用40 µl测试血清接种孔并孵育5天。将100 µl孔的上清液接种至具有CEL单层的新6孔板的孔中，并再次孵育5天。下一步，通过光学显微镜评判禽类呼肠孤病毒特异性的cpe。因为阴性样品即使在第三次传代后仍然保持阴性，所以两次传代用作标准。

7.3 接种-攻击实验的结果

7.3.1对照

由于所有阳性和阴性对照样品如预期得分，因而认为实验是有效的。

7.3.2 评估结果的方法

在评估亲代接种和后代攻击的实验结果中，分析和比较了实验过程中收集的许多样品。获得血清并测试抗体和病毒再分离；对于血清学，发现3-10天测定期不够长来给出清晰的阳性结果。来自血清的阳性病毒再分离是活禽类呼肠孤病毒病毒血症的指示，并且发现从肌内接种后3天收集的血清中的病毒再分离给出了不同处理效果的清楚说明。由此可以确定哪个亲代接种可以减少后代中禽类呼肠孤病毒攻击病毒的感染。

对于接受肌内攻击的处理组，和3天p.i.收集的血清，来自每组5只小鸡（一组仅有4只）的血清可用于病毒再分离。作为截止，认为在3天p.i.获取的血清中具有对病毒再分离呈阳性的3只或多只动物的组不显示攻击病毒感染的减少；认为2只动物阳性是不能确定的；并且认为0只或1只动物阳性显示感染减少。结果示于表5中，显示亲代的不同接种是（YES）或否（NO）诱导了后代中禽类呼肠孤病毒攻击毒株的感染减少。括号内指示通过所测试的总体小鸡的数量得出结论的基础，对其而言，如通过在CEL细胞上两次传代后读取cpe所测定的，在3 d. p.i.获取的血清样品对禽类呼肠孤病毒呈阳性。

7.3.3 结果讨论

如表5中所呈现，对于来源于模拟接种亲代的所有小鸡（接种测试组4），可以从接种后第3天获取的血清中再分离禽类呼肠孤病毒，并且所有应用的攻击病毒均是这种情况。这表示攻击病毒已经在小鸡中不受阻地复制了，因此所述小鸡未曾受到从其（模拟接种）亲代转移的因子的保护。临床体征不十分明显，因为本文所用的小鸡是蛋鸡类型，其不如较重类型的鸡如肉鸡敏感。然而，在接种效率中观察到明显差异。

利用含有来自‘经典’禽类呼肠孤病毒的两个毒株：毒株1733和2408的抗原物质的疫苗给予测试组5中的亲代单次接种，以模拟广泛的基因型组1疫苗。该疫苗在后代中诱导了属于本文定义的基因型组1或2的禽类呼肠孤病毒攻击病毒的感染显著减少。然而，没有诱导针对基因型组3或4的禽类呼肠孤病毒攻击病毒的感染减少。

明显地，测试组6的亲代不为其后代提供相比于如用于接种测试组5的基因型组1抗原物质已提供的保护更广泛的保护。即使用于组6的疫苗具有额外的禽类呼肠孤病毒抗原物质：来自ERS毒株（属于如本文定义的基因型组5的ERS毒株），也是这样的。这表示从使用含有来自多于单个基因型组的禽类呼肠孤病毒抗原物质的疫苗获得的保护明显地没有自动扩宽。

用于测试组1或2的疫苗（分别地）含有来自基因型组1或4的禽类呼肠孤病毒的抗原物质。来自这些测试组的亲代在其后代中针对与疫苗毒株相同的基因型的禽类呼肠孤病毒攻击病毒的复制提供整体保护。然而，没有诱导广谱或异源保护，因为这些疫苗不减少来自不同于其自身基因型组的基因型组的禽类呼肠孤病毒感染。

然而，令人惊讶地发现将来自基因型组1和4的禽类呼肠孤病毒抗原物质组合后获得了强的协同效果：接受测试组3的疫苗的亲代，其组合来自禽类呼肠孤病毒基因型组1和4（如本文定义）的抗原物质，的确为其后代提供广谱保护：来自这些亲代的小鸡能够显著减少所测试的所有禽类呼肠孤病毒攻击毒株的感染，所述攻击毒株对应用的疫苗是同源的和异源的，并且在单次接种后。

表

表1：实施例中提及的禽类呼肠孤病毒田间爆发分离株的列表

表2：序列表中呈现的序列描述

表3：实施例中提及的来自现有技术的禽类呼肠孤病毒列表

表4：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对。

表4（续）：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对

表4（续）：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对

表4（续）：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对

表4（续）：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对

表4（续）：禽类呼肠孤病毒SigmaC氨基酸序列的配对多重比对

附图说明

图1-6：在实施例中分析和比较的所有基因型（亚）组的代表性禽类呼肠孤病毒的SigmaC蛋白的氨基酸序列比对的系统发育树。使用MEGA6绘制树，首先通过计算配对比对得分，然后使用邻接方法绘制无根树(Saitou N. & Nei M., 1987, Mol. Biol. and Evol., 第 4卷, 第 406-425页)。标尺表示相对遗传距离。

图 1: 基因型亚组1 A

图2: 基因型亚组1 B

图 3: 基因型组 2

图 4: 基因型组3

图 5: 基因型组4

图 6: 基因型组5

序列表

<110> Intervet International BV

<120> 针对禽类呼肠孤病毒的广谱疫苗

<130> 23842

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 315

<212> PRT

<213> 禽类正呼肠孤病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (168)..(168)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Met Ala Gly Leu Asn Pro Leu Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Ser Asn Val Thr Thr Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser

20 25 30

Ile His Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu His

35 40 45

Gln Ser Val Ser Gly Met Ser Ala Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ala Asp

50 55 60

Leu Gln Asp Thr Thr Arg Thr Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn

65 70 75 80

Gly Leu Ser Ala Thr Ile Ala Ala Leu Gln Asn Ser Leu Thr Thr Leu

85 90 95

Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu Ala Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly

100 105 110

Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr Ala Val Asn Gly Asn Ser Ser Asp Ile

115 120 125

Ala Asn Leu Arg Ser Asp Val Ser Ala Asn Gly Leu Asn Ile Thr Asp

130 135 140

Leu Gln Asn Arg Ile Lys Ser Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Cys Leu

145 150 155 160

Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Xaa Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp

165 170 175

Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser

180 185 190

Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser

195 200 205

Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Ile Val Asn Ala His Cys His Gly

210 215 220

Arg Arg Thr Asp Tyr Ile Met Ser Ser Thr Gly Ser Leu Thr Val Thr

225 230 235 240

Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met

245 250 255

Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala

260 265 270

Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr

275 280 285

Tyr Gln Ser Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr

290 295 300

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

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<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<210> 12

<211> 306

<212> PRT

<213> 禽类正呼肠孤病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (303)..(303)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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<211> 313

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

<400> 13

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

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<213> 禽类正呼肠孤病毒

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<210> 18

<211> 315

<212> PRT

<213> 禽类正呼肠孤病毒

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (314)..(314)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 18

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<210> 19

<211> 20

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<220>

<223> PCR引物

<400> 19

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<210> 20

<211> 17

<212> DNA

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<220>

<223> PCR引物

<400> 20

ggcgccacac cttaggt 17