本发明涉及如下所述的式i的pde2抑制性化合物、它们作为药物的用途和包含它们的药物组合物。这些化合物可用于例如治疗pde2介导的障碍，例如焦虑、抑郁症、孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder)(asd)、精神分裂症和认知缺损。
发明背景
pde2是在各种组织和细胞类型包括脑(包括海马、纹状体和前额叶皮层)、心脏、血小板、内皮细胞、肾上腺小球区细胞和巨噬细胞中表达的105-kda同型二聚体。虽然cgmp是这种酶的优选底物和效应分子，但pde2水解环腺苷酸(camp)和环鸟苷酸(cgmp)，并被认为牵涉许多生理过程。特别地，已经证实，减少cgmp信号传导的一氧化氮合酶(nos)的抑制减弱了抗焦虑化合物苯二氮
除了有效的行为和认知功能之外，已经观察到，在内皮细胞中，pde2amrna和活性被高度诱导作为体外对肿瘤坏死因子-α刺激的响应。用9-(6-苯基-2-氧代己-3-基)-2-(3，4-二甲氧基苄基)-嘌呤-6-酮(pdp)对pde2活性的选择性抑制显著地改变了内皮细胞的屏障功能，这启示pde2在病理条件下可能对调节循环系统的流体和蛋白质完整性起重要作用。因此，pde2可能是败血症或更局限化炎症应答中的良好药理学靶标。
在最近的一项研究中，pde2抑制也已被证明可引起肺部扩张，预防肺血管重塑，并降低肺动脉高压的右心室肥大特征，这启示pde2抑制在肺动脉高压中的治疗潜力。bubb等人“inhibitionofphosphodiesterase2augmentscgmpandcampsignalingtoamelioratepulmonaryhypertension”，circulation，2014年8月5日，2014，p.496-507，doi：10.1161/circulationaha.114.009751。
尽管存在富有希望的临床前期数据和将pde2鉴定为富有希望的药物靶标，但目前已知尚无pde2抑制剂处于临床研究中，部分原因是现有的pde2化合物的代谢稳定性和脑渗透性差。因此，需要选择性抑制pde2活性、同时显示出优异的生物物理特性的化合物。
发明概述
本公开提供了具有强效和选择性pde2抑制特性与改善的口服生物利用度和脑进入的新化合物。因此，在第一个方面，本公开提供了式i化合物：
其中：
(i)r1和r2与氮原子一起形成杂c3-7环烷基(例如形成氮杂环丁烷-1-基)；
(ii)r3是h或c1-4烷基(例如甲基)；
(iii)r4是杂芳基或芳基(例如苯基)，其任选地被一个或多个选自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7环烷基(例如环丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和卤代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基团取代；
(iv)r6是h或c1-4烷基(例如甲基)；
该化合物为游离或盐形式。
本公开还提供了如下的式i化合物：
1.1式i，其中r1和r2与氮原子一起形成杂c3-7环烷基(例如氮杂环丁烷-1-基)；
1.2式1.1，其中r1和r2与氮原子一起形成氮杂环丁烷-1-基；
1.3式i或1.1-1.2的任一项，其中r3是h或c1-4烷基(例如甲基)；
1.4式i或1.1-1.2的任一项，其中r3是c1-4烷基(例如甲基)；
1.5式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是杂芳基或芳基(例如苯基)，其任选地被一个或多个选自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7环烷基(例如环丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和卤代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基团取代；
1.6式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是被一个或多个选自c1-4烷基(例如乙基)、c3-7环烷基(例如环丙基)、c1-4烷氧基(例如甲氧基)和卤代c1-4烷基(例如三氟甲基)的基团取代的芳基(例如苯基)；
1.7式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是被c1-4烷基(例如乙基)取代的芳基(例如苯基)；
1.8式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是被c3-7环烷基(例如环丙基)取代的芳基(例如苯基)；
1.9式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是被c1-4烷氧基(例如甲氧基)取代的芳基(例如苯基)；
1.10式i或1.1-1.4的任一项，其中r4是被卤代c1-4烷基(例如三氟甲基)取代的芳基(例如苯基)；
1.11式i或1.1-1.10的任一项，其中r6是h或c1-4烷基(例如甲基)；
1.12式i或1.1-1.10的任一项，其中r6是c1-4烷基(例如甲基)；
1.13上述式的任一项，其中该化合物选自：
7-(氮杂环丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-环丙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-乙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶；
1.14上述式的任一项，其中该化合物抑制磷酸二酯酶-介导的(例如pde2-介导的)cgmp水解，例如其中在固定化-金属亲和离子试剂pde测定中，ic50小于1μm，更优选小于或等于250nm，更优选小于或等于10nm，例如如实施例5中所述，
所述化合物为游离或盐形式。
在第二个方面，本公开提供了药物组合物，其包含本公开的化合物，即式i或式1.1-1.14的任一项的游离或药学上可接受的盐形式的化合物与药学上可接受的稀释剂或载体。
本公开还提供了使用本公开的化合物治疗pde2介导的障碍、例如如下举出的障碍(特别是焦虑、抑郁症、孤独症谱系障碍(asd)、精神分裂症、认知缺损)的方法。预期该清单不是详尽的，并且可以包括如下举出的其它疾病和障碍。
因此，在第三个方面，本公开提供了治疗pde2介导的障碍的方法，包含向有此需要的个体施用治疗有效量的本文公开的本公开的化合物，即，式i或式1.1-1.14的任一项的为游离或药学上可接受的盐形式的化合物或本文公开的药物组合物。
在第三个方面的另一个实施方案中，本公开提供了用于治疗个体的以下障碍的方法：
神经性障碍(例如偏头痛；癫痫症；阿尔茨海默病；帕金森病；脑损伤；中风；脑血管疾病(包括脑动脉硬化症、脑淀粉样蛋白血管病、遗传性脑出血和脑缺氧缺血)；脊髓性肌萎缩；侧索硬化；多发性硬化；
认知障碍(包括健忘症、老年性痴呆、hiv相关性痴呆、阿尔茨海默病相关性痴呆、亨廷顿病相关性痴呆、lewy体痴呆、血管性痴呆、药物相关性痴呆、谵妄和轻度认知障碍)；与帕金森病和抑郁症相关的认知功能障碍；
心理缺陷(包括唐氏综合征和脆性x染色体综合征)；
睡眠障碍(包括睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍、失眠症、深眠状态和睡眠剥夺)；
精神紊乱(例如焦虑(包括急性应激障碍、广泛性焦虑症、社交焦虑障碍、惊恐障碍、创伤后精神紧张性障碍(ptsd)、强迫性障碍、特异恐怖、社交恐怖症、慢性焦虑症和强迫性障碍)；
造作性障碍(包括急性幻觉性躁狂)；
冲动控制障碍(包括病理性赌博、病理性纵火、病理性偷窃和间歇性暴躁障碍)；
情绪障碍(包括i型双相性精神障碍、ii型双相性精神障碍、躁狂、混合型情感状态、严重抑郁、慢性抑郁、季节病性抑郁症、精神病性抑郁症和产后抑郁症)；
精神运动性障碍(锥体外系病和运动障碍，例如帕金森综合病、lewy体病、震颤、药物诱发的震颤、药物诱发的迟发性运动障碍、l-多巴-诱发的运动障碍和腿多动综合征)；
精神病(包括精神分裂症(例如连续性或发作性、偏执型、青春型、紧张型、分化不良型和残留型精神分裂性障碍)、情感性分裂症、精神分裂症样精神病和妄想症；
药物依赖(包括麻醉品依赖、酒精中毒、安非他明依赖、可卡因成瘾、尼古丁依赖和戒药综合征)；
进食障碍(包括厌食症、食欲亢进、暴食症、摄食过度和食冰癖)；
儿科精神病(包括注意缺陷障碍、注意力不足/活动过度症、行为障碍(例如抽搐性运动障碍，例如暂时性、慢性、运动或发声抽动障碍)、孤独症和孤独症谱系障碍(asd))；
因精神活性物质应用导致的精神和行为失常；
心血管障碍(例如肺性高血压和肺动脉高压)；和
疼痛(例如骨和关节疼痛(骨关节炎)、反复性运动性疼痛、牙痛、癌痛、肌盘膜痛(肌损伤、纤维肌痛)、围手术期疼痛(普通外科手术、妇科)、慢性痛和神经性疼痛)，
所述个体优选哺乳动物，优选人，该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本文公开的本公开的化合物，即，式i或式1.1-1.14的任一项的为游离或药学上可接受的盐形式的化合物或本文公开的药物组合物。
在一个实施方案中，所述疾病或障碍选自焦虑、抑郁症、孤独症谱系障碍和精神分裂症，例如孤独症和/或精神分裂症患者的焦虑和/或抑郁症。在另一个实施方案中，所述疾病或障碍是与精神分裂症或痴呆相关的认知缺损。
在第四个方面，本公开提供了本文公开的化合物，即式i化合物或式1.1-1.14任一项的游离或药学上可接受的盐形式的化合物(用于制备药物)，其用于治疗如本文公开的pde2介导的障碍。
在第五个方面，本公开提供了药物组合物，其包含本文公开的化合物，即游离或药学上可接受的盐形式的式i化合物或式1.1-1.14任一项的化合物与与药学上可接受的稀释剂或载体，该药物组合物用于治疗如本文公开的pde2介导的障碍。
发明详述
如果没有另外指定或从上下文中清楚地指定，则本文中的以下术语具有如下含义：
(a)本文所用的“烷基”是饱和或不饱和的烃部分，优选饱和的，优选具有1至6个碳原子，优选具有1至4个碳原子，其可以是直链或支链的，并且可以任选地被例如卤素(例如氯或氟)、羟基或羧基单取代、二取代或三取代。
(b)本文所用的“芳基”是单环或双环芳族烃，优选苯基，其任选地被取代，例如被烷基(例如甲基)、卤素(例如氯或氟)、卤代烷基(例如三氟甲基)或羟基取代。
(c)本文所用的“杂芳基”是芳族部分，其中构成芳环的一个或多个原子是硫或氮而不是碳，例如吡啶基或噻二唑基，其可以任选地被取代，例如被烷基、卤素、卤代烷基或羟基取代。
本公开的化合物，例如式i化合物或式1.1-1.14任一项的化合物可以以游离或盐形式存在，例如作为酸加成盐。在本说明书中，除非另有说明，否则例如“本公开的化合物”的语言应被理解为涵盖任意形式的化合物，例如游离或酸加成盐形式，或其中化合物含有酸性取代基，为碱加成盐形式。本公开的化合物旨在用作药物，因此优选药学上可接受的盐。不适用于药物用途的盐可能是有用的，例如，用于分离或纯化游离的本公开的游离化合物或其药学上可接受的盐，因此也包括在内。
本公开的化合物在一些情况下也可以以前药形式存在。前药形式是在体内被转化成本公开的化合物的化合物。例如当本公开的化合物包含羟基或羧基取代基时，这些取代基可以形成生理上可水解和可接受的酯类。如本文所用，“生理上可水解和可接受的酯”是指本公开的化合物的酯，它们在生理条件下可水解以产生酸(在具有羟基取代基的本公开的化合物的情况下)或醇(在具有羧基取代基的本公开的化合物的情况下)，其本身在待施用的剂量下在生理学上是可耐受的。因此，如果本公开的化合物包含羟基，例如化合物-oh，则一方面这类化合物的酰基酯前药即化合物-o-c(o)-c1-4烷基可在体内水解形成生理上可水解的醇(化合物-oh)，而另一方面是酸(例如hoc(o)-c1-4烷基)。或者，如果本公开的化合物包含羧酸，例如化合物-c(o)oh，则这类化合物的酸酯前药化合物-c(o)o-c1-4烷基可以水解形成化合物-c(o)oh和ho-c1-4烷基。正如可以理解的，该术语由此涵盖常规药物前药形式。
本公开的化合物包括它们的对映异构体、非对映异构体和外消旋体及其多晶型物、水合物、溶剂合物和复合物。在本发明范围内的一些单个化合物可以包含双键。本发明中双键的表示旨在包括该双键的e和z异构体。此外，本发明范围内的一些化合物可以包含一个或多个不对称中心。本发明包括任意的光学纯立体异构体以及立体异构体的任意组合的用途。
还预期本公开的化合物涵盖其稳定和不稳定的同位素。稳定的同位素是与相同种类(即元素)丰富的核素相比包含一个额外的中子的非放射性同位素。预期包含这类同位素的化合物的活性将被保留，并且这类化合物也可以具有用于测量非同位素类似物的药代动力学的用途。例如，可以用氘(非放射性的稳定同位素)代替本公开的化合物上某一位置的氢原子。已知的稳定同位素的实例包括、但不限于氘、13c、15n、18o。或者，与相同种类(即元素)的丰富核素相比，包含额外中子的放射性同位素的不稳定同位素，例如123i、131i、125i、11c、18f可以替代相应的i、c和f的丰富的种类。本发明化合物的有用同位素的另一个实例是11c同位素。这些放射性同位素可用于本发明化合物的放射成像和/或药代动力学研究。通常可以通过用同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂来制备同位素标记的式i化合物。
术语“本公开的化合物”或“本公开的pde2抑制剂”涵盖本文公开的任意和全部化合物，例如如上文所述的式i化合物或式1.1-1.14任一项的化合物，其为游离或盐形式。
因此，措词“治疗”应当被理解为涵盖治疗或改善疾病症状以及治疗疾病的原因。在一个实施方案中，本发明提供了治疗本文公开的疾病或障碍的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了预防本文公开的疾病或障碍的方法。
对于治疗方法，措词“有效量”旨在涵盖治疗特定疾病或障碍的治疗有效量。
术语“肺性高血压”旨在涵盖肺动脉高压。
术语“个体”包括人或非人(即动物)。在具体的实施方案中，本发明包括人和非人类。在另一个实施方案中，本发明包括非人类。在另外的实施方案中，该术语包括人。
本公开中使用的术语“包含”旨在是开放式的，并且不排除附加的未示出的要素或方法步骤。
术语“认知障碍”是指包含认知缺陷症状的任意障碍(即相对于同一普通年龄人群中的其他个体而言在一个或多个认知方面例如记忆、智力、学习、逻辑、注意力或执行功能(工作记忆)中的次正常或次优功能)。因此，认知障碍包括、但不限于健忘症、老年性痴呆、hiv相关性痴呆、阿尔茨海默病相关性痴呆、亨廷顿病相关性痴呆、lewy体痴呆、血管性痴呆、药物相关性痴呆、谵妄和轻度认知障碍。认知障碍也可能是主要但不完全与精神病(精神分裂症)、情绪障碍、双相情感障碍、中风、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、脑创伤和药物滥用、阿斯伯格综合征和年龄相关记忆缺陷相关的障碍。
本公开的化合物，例如上文所述的式i或任何式1.1-1.14的任一项的化合物以游离或药学上可接受的盐形式可以用作唯一治疗剂，但也可以组合使用或与另外的活性剂的共同施用。
用于实施本发明的剂量当然会根据例如待治疗的具体疾病或病症、所使用的本公开的特定化合物、施用方式和期望的疗法的不同而改变。本公开的化合物可以通过任意合适的途径施用，包括口服、肠胃外、经皮或通过吸入，但优选口服施用。通常，显示例如用于治疗如上所述疾病令人满意的结果是以约0.01至2.0mg/kg的剂量口服施用获得的。在较大的哺乳动物例如人类中，用于口服施用的指定日剂量由此在约0.75至150mg的范围内，便利地每日1次施用，或以每日2至4次分开剂量施用，或以缓释形式施用。因此，例如，用于口服施用的单位剂型可以包含约0.2至75或150mg，例如约0.2或2.0至50、75或100mg的本公开的化合物与其药学上可接受的稀释剂或载体。
可以使用盖仑领域已知的常规稀释剂或赋形剂和技术制备包含本公开的化合物的药物组合物。药学上可接受的载体可以包含任意常规的药用载体或赋形剂。适合的药用载体包括惰性稀释剂或填充剂、水和各种有机溶剂(例如水合物和溶剂合物)。如果期望，则所述药物组合物可以包含另外的成分，例如矫味剂、粘合剂、赋形剂等。因此，对于口服施用，包含各种赋形剂、例如柠檬酸的片剂可与各种崩解剂例如淀粉、藻酸和某些复合硅酸盐以及粘合剂例如蔗糖、明胶和阿拉伯胶一起使用。此外，润滑剂例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉通常可用于压片目的。相似类型的固体组合物也可用于软和硬填充的明胶胶囊中。因此，材料的非限制性实例包括乳糖或奶糖和高分子量聚乙二醇类。当期望水性悬浮液或酏剂口服施用时，其中的活性化合物可与各种甜味剂或矫味剂、着色剂或染料合并，且如果期望，则可与乳化剂或助悬剂、稀释剂例如水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合合并。例如，所述药物组合物可以适合作为片剂、胶囊、丸剂、粉末、缓释制剂、溶液或悬浮液用于口服施用的形式，作为无菌溶液、悬浮液或乳液用于肠胃外注射的形式，作为软膏或霜剂用于局部施用的形式或作为栓剂的用于直肠施用的形式。
本公开的化合物及其药学上可接受的盐可以使用本文所述和本文示例的方法并且通过与之类似的方法和化学领域已知的方法制备。这类方法包括、但不限于下述那些。如果不是商业上可获得的，则用于这些方法的原料可以通过使用与已知化合物的合成相似或类似的技术从化学领域中选择的方法制备。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文作为参考。
实施例1
7-(氮杂环丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
(a)5-氯-1-甲基-4-硝基-1h-吡唑
在25℃将在thf中的双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(1.0m，65ml，65mmol)滴加到1-甲基-4-硝基-1h-吡唑(5.50g，43.3mmol)和六氯乙烷(10.54g，44.5mmol)在二氯甲烷(120ml)中的溶液中。将该反应混合物在25℃搅拌60min，然后用水(1ml)猝灭。将该混合物蒸发至干。依次用水(50ml)、饱和nahco3×2(2×30ml)和盐水(30ml)洗涤残余物，然后真空干燥，得到6.50g产物(93％收率)。ms(esi)m/z162.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.15(s，1h)，3.92(s，3h)。
(b)5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-胺盐酸盐
向5-氯-1-甲基-4-硝基-1h-吡唑(6.50g，40.2mmol)在12nhcl(15ml)和乙醇(15ml)中的混悬液中加入氯化锡(ii)(35.5g，160.9mmol)。将该反应混合物在90℃搅拌至反应完成。将该反应混合物蒸发至干。用12nhcl(25ml)处理残余物，然后在5℃冷却2h。过滤后，用6nhcl(2x25ml)洗涤滤饼，然后真空干燥，得到6.08g产物(收率：90％)。ms(esi)132.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cd3od)δ7.66(s，1h)，3.89(s，3h)。
(c)5-氯-4-肼基-1-甲基-1h-吡唑盐酸盐
在0℃向搅拌的5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-胺盐酸盐(6.08g，36.2mmol)在hcl(12n，35ml)中的溶液中加入nano2水溶液(5.50g，80.0mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌45min，然后加入氯化锡(ii)(22.8g，120mmol)。添加完成后，将该反应混合物在0℃搅拌30min，然后在室温搅拌过夜。用冰浴将得到的混合物冷却2h，然后过滤。用hcl(12n，20ml)洗涤滤饼，然后真空干燥，得到7.77g粗产物(收率：98％)，不经进一步纯化用于下一步反应。ms(esi)m/z147.0[m+h]+。
(d)5-溴-4-氯-6-(1-乙氧基乙烯基)嘧啶
用氩气给5-溴-4，6-二氯嘧啶(5.00g，21.9mmol)和三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(7.92g，21.9mmol)在dmf(20ml)中的混悬液脱气，然后加入四(三苯膦)钯(0)(1.27mg，1.10mmol)。再给该混悬液脱气，然后在110℃在氩气气氛中加热8h。减压除去溶剂后，通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用0-40％在己烷中的乙酸乙酯梯度洗脱，历时30min，得到2.72g产物(收率：47％)。ms(esi)m/z263.0[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.85(s，1h)，4.71(d，j＝3.1hz，1h)，4.60(d，j＝3.1hz，1h)，3.98(q，j＝7.0hz，2h)，2.67(s，0h)，1.42(t，j＝7.0hz，3h)。
(e)5-溴-4-氯-6-(1-(2-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)腙基)乙基)嘧啶
将5-溴-4-氯-6-(1-乙氧基乙烯基)嘧啶(1.60g，6.07mmol)和5-氯-4-肼基-1-甲基-1h-吡唑盐酸盐(3.11g，12.1mmol)在乙酸(32ml)中的混悬液在60℃搅拌6h。减压除去溶剂后，用饱和nahco3(40ml)处理残余物，然后用乙酸乙酯(3×100ml)萃取。用盐水(70ml)洗涤合并的有机相，然后蒸发至干。真空干燥残余物，得到1.0g粗产物(收率：45％)，将其不经进一步纯化用于下一步。ms(esi)m/z362.9[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.79(s，1h)，7.66(s，1h)，7.05(s，1h)，3.83(s，3h)，2.32(s，3h)。
(f)7-氯-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
将5-溴-4-氯-6-(1-(2-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)腙基)乙基)嘧啶(334mg，0.92mmol)、1，10-菲咯啉(497mg，2.76mmol)和k2co3(127mg，0.92mmol)在甲苯(4ml)中的混合物在密封试管中在100℃加热1.5h。冷却至室温后，用甲苯(3ml)稀释该反应混合物，然后过滤。用甲苯将固体洗涤2次(2×3ml)。用饱和feso4·7h2o洗涤合并的滤液3次(3×4ml)，然后蒸发至干。再真空干燥得到的残余物，得到147mg粗产物(收率：57％)，将其不经进一步纯化用于下一步。ms(esi)m/z283.0[m+h]+。
(g)7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
将7-氯-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶(147mg，0.52mmol)、氮杂环丁烷盐酸盐(64mg，0.68mmol)和et3n(105mg，1.04mmol)在甲苯(1.5ml)中的混合物在密封试管中在室温加热至反应完成。将该混合物倾入2nnaoh(18ml)，然后用ch2cl2萃取3次(3×25ml)。用盐水(20ml)洗涤合并的有机相，然后蒸发至干。再真空干燥得到的残余物，得到181g粗产物，将其不经进一步纯化用于下一步。ms(esi)304.1[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.51(s，1h)，7.66(s，1h)，3.95(s，3h)，3.87(t，j＝7.8hz，4h)，2.61(s，3h)，2.33-2.25(m，2h)。
(h)7-(氮杂环丁烷-1-基)-3-甲基-1-(1-甲基-5-(4-(三氟甲基)苯基)-1h-吡唑-4-基)-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
将7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-氯-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶(58mg，0.19mmol)、4-(三氟甲基)-苯基硼酸(51mg，0.27mmol)和磷酸三钾(92mg，0.43mm0l)在乙醇(0.70ml)和水(0.080ml)中的混悬液在70℃在氩气气氛中加热10min，然后加入四(三苯膦)钯(0)(19mg，0.017mmol)。再次给该混悬液脱气，然后在微波中在130℃加热2h。再加入四(三苯膦)钯(0)(9mg，0.0079mmol)。将该混合物在微波中在140℃加热7h。除去溶剂后，用半-制备型hplc、应用0-33％在包含0.1％甲酸的水中的乙腈梯度纯化残余物，历时16min，得到12mg终产物，为黄白色固体(hplc纯度：98％；收率：15％)。ms(esi)m/z414.2[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.43(s，1h)，7.71(s，1h)，7.63(d，j＝8.1hz，2h)，7.50(d，j＝8.1hz，2h)，3.96(s，3h)，3.81(t，j＝7.8hz，4h)，2.59(s，3h)，2.32-2.21(m，2h)。
实施例2
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-甲氧基-2-甲基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照与实施例1合成中所述方法类似的方式制备标题化合物，其中在最终的步骤中分别加入4-甲氧基-2-甲基苯基硼酸和k2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。得到终产物，为黄白色固体(hplc纯度：99％；收率：32％)。ms(esi)m/z390.2[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)δ8.37(s，1h)，7.77(s，1h)，7.06(d，j＝8.4hz，1h)，6.68(d，j＝2.5hz，1h)，6.64(dd，j＝8.5，2.6hz，1h)，4.04-3.82(m，4h)，3.74(s，3h)，3.71(s，3h)，2.55(s，3h)，2.35-2.26(m，2h)，2.08(s，3h)。
实施例3
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-环丙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照与实施例1合成中所述方法类似的方式制备标题化合物，其中在最终的步骤中分别加入环丙基苯基-硼酸和na2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。ms(esi)m/z386.2[m+h]+。
实施例4
7-(氮杂环丁烷-1-基)-1-(5-(4-乙基苯基)-1-甲基-1h-吡唑-4-基)-3-甲基-1h-吡唑并[4，3-d]嘧啶
按照与实施例1合成中所述方法类似的方式制备标题化合物，其中在最终的步骤中分别加入4-乙基苯基-硼酸和cs2co3，而不是4-(三氟甲基)苯基硼酸和k3po4。ms(esi)m/z374.2[m+h]+。
实施例5
体外pde2抑制的测定
r-hpde2a(登记号nm_002599，人类磷酸二酯酶2a，cgmp-刺激的，转录变体1)具有该基因的重组cdna拷贝的哺乳动物表达克隆载体购自origene。通过瞬时转染hek293细胞表达蛋白质。在转染后48小时收获细胞，用tbs缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5，150mmnacl)洗涤1次，然后通过在冷匀化缓冲液(50mmtris-hcl，ph7.5，5mmmgcl2，1x蛋白酶抑制剂混合物)中超声处理裂解。将匀化物在4℃下以15,000g离心30min以获得可溶性细胞溶质级分。使用以牛血清白蛋白为标准品的bca蛋白测定试剂盒(pierce)测定胞质溶胶的蛋白质浓度。
测定：以fl-camp作为底物测定pde2a。首先进行酶滴定以确定pde的工作浓度。在不存在抑制剂的情况下，提供活性为100δmp的酶的浓度被认为是针对pde适合的工作浓度。
根据滴定曲线，在标准反应缓冲液(10mmtris-hclph7.2，10mmmgcl2，0.1％bsa，0.05％nan3)中稀释pde酶。对于pde2测定，给反应缓冲液补充1μmcgmp以完全活化酶。将99μl稀释的酶溶液加入到平底96-孔聚苯乙烯板中的每个孔中，且然后加入溶解在100％dmso中的1μl测试化合物。混合化合物并且在室温下与酶一起预温育10min。
fl-cnmp转化反应通过加入底物(终浓度为45nm)引发。将酶和抑制剂混合物(16μl)和底物溶液(4μl，0.225μm)在384-孔微量滴定板中合并。将该反应体系在室温下在黑暗中温育15min。通过在384-孔板的每个孔中加入60μl结合试剂(在补充有1∶1800稀释消泡剂的结合缓冲液的结合缓冲液中按1∶400稀释的imap珠粒)停止反应。将板在室温下温育1小时以使imap结合进行完成，且然后置于envision多模式微量培养板读出器(perkinelmer，shelton，ct)中以测量荧光偏振(δmp)。
测量为减少的δmp的camp浓度的降低指示pde活性的抑制。通过在0.00037nm至80,000nm的范围内的8至16个化合物浓度的存在下测量酶活性，且然后绘制药物浓度对δmp的关系的示意图来测定ic50值。将测试孔值归一化以控制在相同板上运行的反应(转化成％对照的值)。使用非线性回归软件估计ic50值，拟合四参数单-点剂量响应模型(xlfit；idbs，cambridge，ma)。曲线下部固定为对照的0％。
质量控制：为了确定抑制剂的ic50，选择给出100-200毫偏振单位的最佳信号范围的酶浓度。测量每个样品孔的总荧光强度以计算平均值和标准偏差。如果任何样品孔的总荧光强度不在平均值±3sd的范围内，则弃去该特定孔的mp值。
使用上述或类似于上述描述的imap方法，我们筛选了专有的以pde为重点的化合物文库，以鉴定具有纳摩尔pde2抑制活性的新化合物。测试本公开的示例性化合物(例如实施例1-4的化合物)并证实它们在纳摩尔浓度下是有活性的，例如如下：实施例1：ic5023.1nm；实施例2：ic5092nm；实施例3：ic509.5nm；实施例4，ic5018.5nm。此外，化合物对pde2具有选择性；测试实施例4的化合物，并证实对pde2的选择性超过对pde1、pde3、pde4d、pde5、pde6、pde7b、pde8a、pde9a、pde10a和pde11a20倍。
实施例6
小鼠中的药代动力学研究
给予小鼠单一口服剂量的待测化合物(10mg/kg，po)，并使用hplc和lc-ms、应用与zhao等人，j.chromatogr.b.analyt.technol.biomed.lifesci.(2005)819(1)：73-80和appels，n.m.等人，rapidcommun.massspec.2005.19(15)：p.2187-92中所述类似的方法测量血浆和脑的利用度(0.25-4h)。本实验表明实施例1化合物具有良好的脑部进入，如图1所示。
实施例7
在目标认知任务中使用pde2抑制剂治疗对wistar大鼠记忆性能的作用
在认知的动物模型即目标认知任务中测试实施例1的化合物的记忆增强作用。参见ennaceur，a.，delacour，j.，1988.anewone-trialtestforneurobiologicalstudiesofmemoryinrats.1：behavioraldata.behav.brainres.31，47-59。在一个小时之后测试它们时，大鼠记得在以前的试验中探索的目标。然而，当使用24小时的试验间隔时，它们不能记住在第一次试验中哪个目标被呈现给它们。测试实施例1的化合物在第一次试验前2小时给予时是否会减弱这种时间诱发的目标记忆缺陷。将所述化合物给予2-3个月龄的雄性wistar大鼠。
在学习前2小时，以0、0.3、1、3和10mg/kg的剂量通过口腔注射实施例1的化合物(2ml/kg)。没有一个测试剂量对探索行为有影响。本研究表明实施例1的化合物能够以1.0mg/kg的剂量完全阻止时间依赖性遗忘。对于0.3和3.0mg/kg，发现中等的记忆改善。
实施例8
新型pde2抑制剂对海马细胞和脑中cgmp信号传导的影响
我们提出，ht-22细胞(从其亲代ht-4细胞亚克隆的无限增殖化小鼠海马-神经元前体细胞)是理解与海马依赖性情绪变化相关的细胞和分子过程的有价值的模型。我们预期在基于细胞的测定中目标1将产生10-20种新型pde2抑制剂用于功能评估。仅在基于细胞的ht-22细胞测定中诱导cgmp蓄积显著性增加的化合物将进入行为评估。基于细胞的测定数据将是对具有潜在用于cns适应征的任意pde2抑制剂的最低要求，并将为行为测试的剂量选择提供指导。