经呼吸道递送的纳米1H‑19F‑31P多核磁共振分子成像探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种纳米分子成像探针及其制备方法，特别涉及一种用于肺癌诊断及分型的多核磁共振分子成像探针及其制备方法。属于医学诊断技术领域。

背景技术：

肺，位于胸腔内，是用来呼吸的内脏，是气体交换的场所。肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。肺癌位置深在，处于含气肺组织之中。以分子靶点(基因、蛋白)多态性及细胞表观遗传学差异为依据的肿瘤分子分型，直接关系到肿瘤分子靶向治疗方案的选择，可以减少盲目性，增加针对性。经呼吸道途径递送分子成像探针进行肺癌分子成像具有众多优势：①能够通过呼吸系统使探针直接作用到肺部，可避免许多生物屏障对其的阻碍、降解、代谢等作用，给药直接。可以直接进入肺癌微小病灶。②给药方便，能随时停止，避免探针注入过量。而且，③探针能够透过黏膜下毛细血管直接进入体循环，避免胃肠道酶和酸的降解作用及肝首过效应。此外，④肺黏膜上的酶活性低，探针所携载的生物分子或药物等不易被降解破坏。而目前传统的成像对比剂及分子成像探针主要是以静脉注射型为主，因此，如能根据肺癌所在的解剖结构位置特点开发出可通过呼吸道途径递送的分子成像探针将为改变肺癌的诊疗现状带来希望。

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)有极好的软组织穿透力、软组织对比分辨率高、可多参数成像、无需重建的任意断面成像、无骨伪影、无放射线损伤，MRI对叶及叶以上支气管管壁增厚及官腔狭窄可以做出明确诊断。对于CT平扫较难区分的肿块和继发性肺不张，MR在鉴别肺癌与继发性改变方面有较大优势。而对于较大结节或肿块，MRI能较好的显示病灶的形态学特征，对于病灶内部结构如空泡、空洞、细支气管的显示也与CT相仿，在判断胸膜凹陷是否存在、位置、形态及内容物方面都明显优于CT，重要的是MRI除常规扫描方法外，尚具备弥散成像、波谱分析、功能成像等技术可用于显示病变的功能信息。综上，MRI用于肺实质成像具有众多优势，MRI优秀的软组织显示能力，多序列以及功能成像的特点 可以帮助更好的捕获肺癌病变的组织学特性，但是在临床实际检查中，对于肺部疾病的诊断，往往倾向于使用PET、CT或PET-CT联用，较少使用MRI，究其原因，以往因受肺实质质子密度低，呼吸运动及心脏搏动伪影等因素影响，早期仅局限于对纵膈淋巴结，胸壁和胸膜病变的研究，肺部成了磁共振成像的“禁区”。但是，随着MRI成像技术的发展，快速成像序列的开发，联合并行采集技术，呼吸和心电门控的应用，磁共振肺部成像质量得以稳定的提高，国内外研究已越来越关注MRI在肺实质成像方面的应用。但MRI的不足之处在于其检测灵敏度低，因此，开发新型经呼吸道途径递送的MRI分子成像探针，直接作用于肺癌病灶，可提高MRI检测灵敏性，充分发挥MRI的高分辨解剖学特性，将成为肺癌分子影像领域研究有力和强大的工具。

全氟化碳(Perfluorocarbon,PFC)是一种优异的MRI成像对比剂。F是位于氢后最适于MR成像的原子核，尽管其灵敏性相当于氢的83％，但生物体中大量氢质子的存在使得¹H-MRI的本底信号高，而正常体内含氟成分很少，在体内研究中引进氟成像探针测定时无本底信号干扰，这使得¹⁹F-MRI技术灵敏度高并可直接测定目标组织或器官中的探针及其代谢产物水平，并能对代谢过程进行无损动态观察。全氟化碳安全无毒，可被用作血液替代品，因此具有良好的安全性、高度的特异性(探针本身本底信号低)、适宜的半衰期，代谢途径为通过肺排除体外，因此，适宜于肺部磁共振成像研究。特别地，全氟化碳沸点低，化学性质稳定，具有良好的呼吸气体运载能力，每100mL PFC中O₂的溶解量约为49～55mL，是血液溶解量的2倍；CO₂溶解量为160～210mL。PFC对气体溶解和释放快，对O₂、CO₂的溶解和释放时间分别是血红蛋白的1/3和1/7。PFC的上述特性对改善氧合和肺内气体交换具有直接的促进作用，显示了其用作经呼吸道递送成像对比剂和分子成像探针的良好潜力。

综上，全氟化碳是一种出色的¹⁹F-MRI成像对比剂，其自身的物理化学性质显示了它经呼吸道途径递送的巨大潜力，但是使用全氟化碳作为经呼吸道递送纳米分子成像探针用于肺癌病灶的检出及分子分型在国际上还史无前例。开发出新型经呼吸道途径递送的肺癌成像对比剂和分子成像探针，将有望为肺癌精确成像和新型诊疗模式领域打开一个新的突破口，具有重大的理论和实际意义，极具临床转化价值。

本发明颠覆传统的利用氢质子(单核)成像的磁共振成像对比剂，设计出一种全新的、经呼吸道递送的¹H-¹⁹F-³¹P(多核)磁共振纳米分子成像探针，提出将¹H、 ¹⁹F、³¹P三种与人体活动息息相关的元素整合到一起，成像时不但具备各自的优势， 更能利用这种多核分子成像探针，多角度分析疾病，达到多核同步动态MRI成像目的，为疾病诊断提供丰富的多维信息。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种经呼吸道递送纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明中经呼吸道途径递送的多核磁共振分子成像探针为核壳型结构，尺寸为纳米级，表面为负电性，白色乳液状液体。

首先制备磷脂类表面活性剂的混合物，所述磷脂类表面活性剂可以包括鸡蛋卵磷脂，DPPE，DPPG，DPPC等等，为了提高此纳米探针的多功能特性，还可以在所述的表面活性剂的表面螯合Gd，以及用于光学成像的组件，例如各种荧光染料。准确称量这些脂质表面活性剂，用氯仿或者氯仿与甲醇的混合溶剂进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干。通过机械分散或超声震荡的方式分散于一定量的水中，然后加入全氟化碳物质，甘油，在高压匀质机中混合4min，去除掉未有效包覆的表面活性剂及其他组分后制成 ¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针中的每一种原子核都有其在生理诊断方面独特的优势。

具体的，本发明的一种经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针，是通过以下方法制备得到的：

(1)将一种或几种的磷脂类表面活性剂均匀混合，用氯仿或者氯仿与甲醇的混合溶剂进行溶解，将溶解的磷脂类表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过机械分散或超声震荡的方式分散于水中，得到磷脂类表面活性剂的共混物，备用；

其中所述的磷脂类表面活性剂选自磷脂酰胆碱类脂质体，磷脂酰乙醇胺类脂质体，磷脂酰甘油类脂质体，磷脂酰丝氨酸或卵磷脂中的一种或几种的组合；

(2)将全氟化碳、甘油均匀分散于步骤(1)得到的磷脂类表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的组分，得到所述的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

在本发明中，优选的，所述的磷脂酰胆碱类脂质体包括：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)以及棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)；所述的磷脂酰乙醇胺类脂质体包括：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,3-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(1,3-DPPE)、二植酰磷脂酰乙醇胺(DpyPE)以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

在本发明中，优选的，所述的表面活性剂为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及卵磷脂的混合物，它们之间的摩尔配比是DPPC：DPPE：DPPG：卵磷脂＝75:2:5:18。

在本发明中，优选的，所述的全氟化碳选自溴化全氟辛烷(PFOB)、全氟冠醚(PFCE)、FC-3280(C₈F₁₈)以及FC-77(C₈F₁₆O)中的至少一种。

在本发明中，优选的，步骤(2)得到的含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液中全氟化碳、甘油共占总质量的10-40％、水占总质量的55-85％，磷脂类表面活性剂占总质量的1-5％。更优选的，全氟化碳、甘油共占总质量的20％、水占总质量的78％，磷脂类表面活性剂占总质量的2％。

在本发明中，优选的，全氟化碳与甘油的质量比为10-20:1。

在本发明中，优选的，还包括在所述磷脂类表面活性剂的表面上螯合Gd以及用于光学成像的组件，例如各种荧光染料。

研究表明，经呼吸道递送本发明的纳米¹H-¹⁹F-³¹P探针后，更快更清晰的显示图像，减少探针用量，提高肺癌分子成像在体检测效果。

因此，更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针在制备肺癌分型及诊断的成像对比剂中的用途。

本发明在分子水平上设计并合成能够经呼吸道途径或经静脉途径递送的全氟化碳纳米分子成像探针¹H-¹⁹F-³¹P，以功能化应用为导向，采用层层自组装方式，利用肺泡表面活性物质的双亲性和生物安全特性，将全氟化碳包覆在核层结构中，合理调控组分，并保证这些分子可在复杂的生物体环境下牢固结合。

目前，我们已将该纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针应用于非小细胞肺癌荷瘤实验动物中，证明了使用该经呼吸道途径递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针具有独特的优势：探针作用时间长、用量少、检出效果明显，用望对 肺癌诊断实现革命性突破。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

(1)本发明的经呼吸道递送纳米¹H-¹⁹F-³¹P探针，能够提供肿瘤病变位置多核成像信息，更快更清晰的显示图像，减少成像对比剂用量，提高肺癌分子成像在体检测效果。

(2)经呼吸道途径递送分子成像探针进行肺癌分子分型具有众多优势：①能够通过呼吸系统使探针直接作用到肺部，可避免许多生物屏障对其的阻碍、降解、代谢等作用，给药直接。可以直接进入肺癌微小病灶。②给药方便，能随时停止，避免探针注入过量。而且，③探针能够透过黏膜下毛细血管直接进入体循环，避免胃肠道酶和酸的降解作用及肝首过效应。此外，④肺黏膜上的酶活性低，探针所携载的生物分子或药物等不易被降解破坏。而目前传统的成像对比剂及分子成像探针主要是以静脉注射型为主，因此，本发明的可经呼吸道递送纳米¹H-¹⁹F-³¹P探针将为改变肺癌的诊疗现状带来希望。

(3)本发明的探针安全无毒，可被用作血液替代品，因此具有良好的安全性、高度的特异性(探针本身本底信号低)，因此，适宜于肺部磁共振成像研究。特别地，全氟化碳沸点低，化学性质稳定，具有良好的呼吸气体运载能力，每100mL PFC中O₂的溶解量约为49～55mL，是血液溶解量的2倍；CO₂溶解量为160～210mL。PFC对气体溶解和释放快，对O₂、CO₂的溶解和释放时间分别是血红蛋白的1/3和1/7。PFC的上述特性对改善氧合和肺内气体交换具有直接的促进作用，显示了其用作吸入式成像对比剂和分子成像探针的良好潜力。

附图说明

图1为全氟化碳纳米探针尺寸分布测试；

图2为全氟化碳纳米探针表面电位分析；

图3为经呼吸道递送纳米探针透射电镜照片；

图4为经呼吸道递送纳米探针扫描电镜形貌；

图5为经呼吸道递送纳米探针原子力显微镜测试形貌图；

图6为经呼吸道递送纳米探针与纯水比较通氧不同时间点含氧量测试；

图7为全氟化碳纳米探针与BEAS-2B(A)及H520细胞系共孵育后TUNEL荧光显微镜检测图像；

图8为连有光学组件的经呼吸道递送分子成像探针全身分布IVIS光学成像图(A)经呼吸道递送(B)经静脉递送对照研究；

图9为连有Gd组件的经呼吸道递送纳米分子成像探针1H-MRI phantom成像图；

图10为原位荷瘤兔经呼吸道途径递送本发明纳米分子成像探针后T1图像和mapping图像；

图11为原位荷瘤兔经不同途径递送本发明纳米分子成像探针后肿瘤和肌肉区信号定量测试结果；

图12为原位荷瘤兔经呼吸道途径递送本发明纳米分子成像探针后肿瘤区及肺泡正常细胞区H&E组化及荧光显微分析图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备

(1)按照二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及卵磷脂的摩尔配比＝75:2:5:18分别称取各物质，均匀混合，用氯仿进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过超声震荡的方式分散于一定量的水中，得到磷脂类表面活性剂的共混物，备用；

(2)将全氟化碳溴化全氟辛烷(PFOB)以及甘油按照质量比为16:1均匀分散于步骤(1)得到的表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；其中，全氟化碳、甘油共占总质量的20％、水占总质量的77％，磷脂类表面活性剂占总质量的3％；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的表面活性剂等组分，得到所述的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

实施例2经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备

(1)按照二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及卵磷脂的摩尔配比＝55:12:15:18分别称取各物质，均匀混合，用氯仿进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过机械分散的方式分散于一定量的水中，得到磷脂类表面活性剂的共混物，备用；

(2)将全氟化碳全氟冠醚(PFCE)、甘油按照质量比为15:1均匀分散于步骤(1)得到的表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；其中，全氟化碳、甘油共占总质量的35％、水占总质量的60％，磷脂类表面活性剂占总质量的5％；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的表面活性剂等组分，得到所述的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

实施例3经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备

(1)按照二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1,3-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(1,3-DPPE)、磷脂酰丝氨酸(PS)以及卵磷脂的摩尔配比＝60:15:12:13分别称取各物质，均匀混合，用氯仿与甲醇的混合溶剂进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过超声震荡的方式分散于一定量的水中，得到磷脂类表面活性剂的共混物，备用；

(2)将全氟化碳FC-3280(C8F18)、甘油按照质量比为18:1均匀分散于步骤(1)得到的磷脂类表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有 ¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；其中，全氟化碳、甘油共占总质量的30％、水占总质量的68％，磷脂类表面活性剂占总质量的2％；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的表面活性剂等组分，得到所述的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

实施例4经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针(实施例1制备)在作为成像对比剂中的用途

1、纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的形貌、粒径及其分布

采用多种谱学测试深入表征经呼吸道递送纳米分子成像探针的组成和结构；采用透射电镜、扫描电镜等和动态光散射研究合成工艺对探针形貌、粒径及其分布的影响规律。

结果如图1-图5所示。从形貌表征我们可以看出，合成的经呼吸道递送纳米探针为均匀的球形粒子，粒径均匀。通过激光粒度仪测定全氟化碳纳米分子成像探针的动态光散射Z-Average直径131.4nm，可通过不同的表面修饰调节其表面电荷电位范围在-8mV至-61mV之间。

2、纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针溶液溶氧量的测定

通过溶氧仪测试经呼吸道递送纳米探针溶液中的含氧量。测试原理为将溶氧浓度(氧分压)转换成电信号，再经放大、调整(包括盐度、温度补偿)，由模数转换显示。结果如图6所示，图6测试结果显示，通O₂不同时间，20％体积浓度的经呼吸道递送纳米探针溶液中的氧气含量均高于相同条件下纯水中测试结果，图中绿色的测试点为溶液中溶解氧气的含量已超过仪器的检测上线，无读数，此值仅表示将样本溶液放置一段时间后仪器能检测出的最大读数。说明本发明所合成的纳米 ¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针具有良好的携载氧能力，适于经呼吸道途径进行递送。

3、安全性试验

我们实验验证了纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针对肺正常上皮细胞系Beas-2b和肺癌细胞系H520的毒性，经TUNEL试剂盒检测程序测试后使用荧光显微镜观察其凋亡细胞染色情况。经Image-Pro Plus图像分析软件处理，分析阳性面积和灰度，统计阳性强度。统计学分析用SPSS13.0软件进行统计分析。结果以均数生标准差表示，采用析因分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，P<0.05认为差异有显著意义。

TUNEL测试结果如图7所示：在8.96nmol/μL和89.6nmol/μL不同经呼吸道递送纳米探针浓度下，两种细胞系与探针共孵育24h均未出现明显的凋亡，表明所合成的经呼吸道递送纳米分子影像探针具有良好的细胞学生物应用安全性。

4、生化、血常规分析

肝、肾功能检查是研究肝脏和肾脏功能的实验方法，血液中的某些化学检查等指标可以用来衡量肝、肾功能的变化。一些新型成像对比剂或成像探针等可引起肝脏、肾脏损害，因此肝功能、肾功能检查是一项重要的检测其组织器官毒性的指标。

由表1可以看出，与未打入任何探针的空白对照组小鼠相比，经呼吸道途径和 经静脉途径递送本发明合成的新型纳米分子成像探针24小时和7天后，小鼠肝肾功能指标未见明显大幅度波动和异常。表1中的几项关键指标ALT、AST分别是检测血清中的丙氨酸氨基转化酶和门冬氨酸氨基转化酶。ALT的升高表示肝细胞的损伤，常见于急慢性肝病、药物性肝损害、脂肪肝、肝硬化、心肌梗塞、心肌炎及胆道疾病等，但一般要超过正常的两倍半才有临床意义。AST增高常见于心肌梗塞发病期、急慢性肝炎、中毒性肝炎、心功能不全、皮肌炎等。各种肝病、心肌炎、胸腺炎、肾炎、肺炎等亦可轻度升高。BUN、CREA是衡量肾功能的重要指标，在急慢性肾炎、重症肾盂肾炎、各种原因所致的急慢性肾功能障碍、心衰、失水、大量内出血、肾上腺皮质功能减退症、慢性尿路梗阻等会见BUN增高。尿肌酐增高通常见于饥饿、发热、急慢性消耗等疾病或剧烈运动后。减低见于肾衰、肌萎缩、贫血、白血病等。与空白对照组小鼠相比，实验组小鼠经本发明的产品处理不同时间后，这两个指标的检测数值均变化不大，说明本发明所制备的新型经呼吸道途径递送纳米分子成像探针无明显肝肾组织器官毒性，具有良好的生物安全性。

表1本发明的新型纳米分子成像探针对小鼠组织器官水平毒性研究——肝、肾功能指标测试结果

注I.V.为经静脉途径递送本发明的产品，I.T.为经呼吸道途径递送本发明的产品。

血常规测试分析的结果表明，高剂量的本发明产品(2.5mL/kg，体积浓度20％的水溶液)静脉注入小鼠24h后，血常规WBC指标与未经处理的对照组相比，有异常降低，但是7天后的实验组小鼠此指标逐渐提升，说明本发明的产品如经静脉递送对实验动物白细胞会产生移过性影响，经呼吸道途径递送本发明产品无明显差异，结果如表2所示。

表2本发明的新型纳米分子成像探针对小鼠作用不同时间血常规指标检测结果

注I.V.为经静脉途径递送本发明的产品，I.T.为经呼吸道途径递送本发明的产品。

实施例4连有光学组件或Gd组件的经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备及应用

1、连有光学组件的经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备

(1)按照二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及卵磷脂的摩尔配比＝75:2:5:18分别称取各物质，均匀混合，用氯仿进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过超声震荡的方式分散于一定量的水中，得到磷脂类 表面活性剂的共混物，备用；其中在二棕榈酰磷脂酰乙醇胺上连有光学组件罗丹明B；

(2)将全氟化碳溴化全氟辛烷(PFOB)以及甘油按照质量比为16:1均匀分散于步骤(1)得到的表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；其中，全氟化碳、甘油共占总质量的20％、水占总质量的77％，磷脂类表面活性剂占总质量的3％；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的表面活性剂等组分，得到所述的连有光学组件的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

2、连有Gd组件的经呼吸道递送的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针的制备

(1)按照二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)以及卵磷脂的摩尔配比＝75:2:5:18分别称取各物质，均匀混合，用氯仿进行溶解，将溶解的表面活性剂通过旋转蒸发仪蒸干，之后在40℃真空烘箱中过夜烘干，最后通过超声震荡的方式分散于一定量的水中，得到磷脂类表面活性剂的共混物，备用；其中，在二棕榈酰磷脂酰乙醇胺上通过二乙烯三胺五乙酸(DTPA)螯合Gd组件；

(2)将全氟化碳溴化全氟辛烷(PFOB)以及甘油按照质量比为16:1均匀分散于步骤(1)得到的表面活性剂的共混物中，在高压匀质机中混合，制成含有¹H-¹⁹F-³¹P纳米粒子的乳液；其中，全氟化碳、甘油共占总质量的20％、水占总质量的77％，磷脂类表面活性剂占总质量的3％；

(3)步骤(2)得到的乳液采用透析的方式去除掉未有效包覆的表面活性剂等组分，得到所述的连有Gd组件的纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针。

4、纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针通过不同给药方式在活体内的成像对比

取正常昆明小白鼠(20-25g)，随机分成5组，每组三只。经尾静脉注射本发明含有光学组件的多功能¹H-¹⁹F-³¹P纳米分子成像探针(300μL/只)，于注射后不同时间点取主要脏器，包括脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠(清空)；

取正常昆明小白鼠(20-25g)，随机分成5组，每组三只。经呼吸道递送本发明含有光学组件的多功能¹H-¹⁹F-³¹P纳米分子成像探针(75μL/只)，具体方法为：首先使用气溶胶肺部给药系统抽取75μL纳米探针，安装喷雾喷头。实验动物肌肉内注射不含氟的麻醉剂Ketamine/Xylazine，麻醉后俯卧位固定四肢，并将门齿悬挂 在气管插管工作台的钢丝上，选用敷料镊子将实验动物的舌拉出后，从右侧口角置入喉镜，再把压片移至正中，下压舌体沿舌背弧度将镜片稍向前置入咽部，可见到会厌。将其置入会厌的喉片挑起会厌，以显露声门，从正中弧形直插入口中，将喷头(钝头)对准声门后，轻柔地插入气管内约1cm(隆突位置)并注射本发明的纳米分子成像探针，拔出注射器后观察动物呼吸频率及状态。

于探针递送后不同时间点取主要脏器，包括脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠(清空)，用IVIS小动物光学成像仪检测本发明产品在小鼠体内的活体分布。图8为连有光学组件的经呼吸道递送分子成像探针全身分布IVIS光学成像图(A)经呼吸道递送(B)经静脉递送。

图9为连有Gd组件的经呼吸道递送纳米分子成像探针¹H-MRI phantom成像图。由图9示斜率计算可得对比增强物质的弛豫率，弛豫率反映对比剂改变组织弛豫时间的能力。由图示数据计算连有Gd组件的经呼吸道递送纳米分子成像探针Gd(Ⅲ)离子弛豫率为3.527s^-1mM^-1，PFC@Gd纳米粒子的弛豫率为20450s^-1mM^-1，表明所合成的经呼吸道递送的纳米分子成像探针具有较好的磁共振弛豫增强能力。

4、纳米¹H-¹⁹F-³¹P多核磁共振分子成像探针在肺癌诊断中的用途

采用VX2肿瘤组织块(1mm³大小)经背部穿刺在新西兰大白兔右肺下叶背段进行VX2原位移植瘤模型建立(6只)。待肿瘤组织长至直径约10mm左右时MR成像。然后分别通过呼吸道(3只)或耳缘静脉(3只)注射本发明合成的连有Gd组件的多功能纳米分子成像探针(～2ml/只)。

首先使用气溶胶肺部给药系统抽取100μL纳米探针，安装喷雾喷头。实验动物肌肉内注射不含氟的麻醉剂Ketamine/Xylazine，麻醉后俯卧位固定四肢，并将门齿悬挂在气管插管工作台的钢丝上，选用敷料镊子将实验动物的舌拉出后，从右侧口角置入喉镜，再把压片移至正中，下压舌体沿舌背弧度将镜片稍向前置入咽部，可见到会厌。将其置入会厌的喉片挑起会厌，以显露声门，从正中弧形直插入口中，将喷头(钝头)对准声门后，轻柔地插入气管内约1cm(隆突位置)并注射本发明的纳米分子成像探针，拔出注射器后观察动物呼吸频率及状态。

在注射探针后的1，2，3，7，12，24，48以及72小时分别用3.0T磁共振成像。T1扫描参数如下：T1WI FSE序列Echo Train Length:2；TE:42；Slice thickness:5mm，TR:50；100；300；500；700；900；1200；1500；1800；2100；2500。mapping扫描参数如下:T1WI FSE序列Echo Train Length:3；TE:Minfull；Slice thickness:1mm TR:50；100；300；500；700；900；1200；1500；1800；2100；2500。每只动物的扫描范围都是从 颈部到膈肌水平(包含种瘤)，共15层图像。MR成像后，兔模型经安乐死后，切除主要脏器、进行显微镜分析。

图10为兔子经呼吸道途径递送本发明纳米分子成像探针后MRI成像图像及mapping图像，由图10可知，本发明的新型经呼吸道途径递送的纳米分子成像探针能够使原位荷瘤兔肿瘤区明显增强。图11为其mapping图像定量检测结果。

T1像特点：组织的T1越短，恢复越快，信号就越强；组织的T1越长，恢复越慢，信号就越弱。即长T1指低信号，短T1高信号。R1对应1/T，更易于直观的比较信号强弱变化。经呼吸道途径递送本发明合成的纳米分子成像探针后，能够使肿瘤信号增强约2.6倍，而且信号持续作用时间长，递送探针后，信号持续增强，大约12h后达到峰值，之后能够基本保持此信号强度变化不大，直至72h测试时间点。经静脉途径递送后，大约2h左右信号最强，与未注入探针时的基线测试值相比较，信号峰值增强约1.2倍。肌肉的磁共振增强信号现象相反，经静脉途径比经呼吸道途径信号增强比例大，经呼吸道途径递送肌肉未见明显的信号增强，说明本发明的经呼吸道途径递送纳米分子成像探针对于检测肺部肿瘤具有巨大优势，背景噪音低，信号增强持续作用时间长，具有临床转化前景。

对实验动物解剖，目标组织区域进行H&E组化及荧光显微图像分析，由图12测试结果可知，本发明所制备的新型经呼吸道途径递送的多功能纳米分子成像探针能够进入肿瘤区域。