一种基于脱钙处理的三维骨组织工程支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种骨组织工程支架及其制备方法，特别是一种具有不同刚度的脱细胞脱钙三维骨支架及其制备方法。

背景技术：

细胞外基质的组成成分、力学特征、孔隙率、孔径值等多种因素在生理病理条件下均被证实可调节细胞的命运。其中，单纯的基质刚度已经被证明可以在二维条件下诱导人的间充质干细胞分别分化为神经细胞(0.1-1kPa)、成肌细胞(8-17kPa)与成骨细胞(25-40kPa)(Engler AJ,Sen S,Sweeney HL,Discher DE.Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.Cell.2006；126:677-689.)。但是，三维条件下制备具有不同基质刚度的支架材料的研究还比较少，主要集中在准三维条件下，很难模拟细胞在体内所处的真实力学微环境。例如，通过改变不同位置的基质密度、调节聚合物的不同交联密度、改变两种或多种混合基质的比例等多种方式改变三维支架材料的力学特征。但是，这些方法在改变了支架力学特征的同时不可避免地改变了三维支架的基本结构(例如支架形态、内部连通、孔隙率和孔径大小等)。例如，利用平板垂直压缩楔形胶原形成具有刚度梯度的生物材料(软：1057±487kPa；中：1835±31kPa；硬：2305±693kPa)(Hadjipanayi E,Mudera V,Brown RA.Brown.Guiding cell migration in 3D:a collagen matrix with graded directional stiffness.Cell Motil Cytoskeleton.2009；66:121-128.)是一种制备基质刚度梯度材料的有效方法，但是胶原支架的内部三维结构随着基质刚度变化的同时也发生了显著的变化。最近，Chen领导的科研小组利用不同高度(0.97μm、6.10μm和12.9μm)的弹性微柱调节基底的硬度(弹性系数:1556nN/μm、18.16nN/μm和1.90nN/μm)，发现这种不同硬度的基底可以影响细胞的形态、粘附以及细胞骨架收缩，可调控人的间充质干细胞的分化方向，高硬度基底更利于促进间充质干细胞的成骨分化，低硬度基底则促进间充质干细胞的成脂肪分化(Fu J,Wang YK,Yang MT,Desai RA,Yu X,Liu Z,Chen CS.Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates.Nat Methods.2010；7:733-736.)。Huebsch等(Huebsch N,Arany PR,Mao AS,Shvartsman D,Ali OA,Bencherif SA,Rivera-Feliciano J,Mooney DJ.Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.Nat Mater.2010；9:518-526.)制备了一种具有不同基质刚度(2.5～110kPa)的合成水凝胶细胞外基质，并检测其对间充质干细胞分化谱系的影响。他们发现间充质干细胞在11～30kPa的支架上主要分化为成骨细胞。前期，我们利用不同配比的胶原/羟基磷灰石包被处理脱细胞化骨，形成了一种具有不同基质刚度的三维骨组织工程支架材料(吕永钢,陈国宝,邹杨.一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料及其制备方法.中国发明专利:ZL 201410153286.7.)。然而，在骨组织工程制备微结构不变而刚度不同的三维骨组织工程支架依然非常困难。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是在三维条件下构建具有不同刚度的骨组织工程支架材料，目的是在不改变三维支架微结构的情况下使支架具有不同刚度。

为解决上述技术问题，本发明的基于脱钙处理的三维骨组织工程支架是由脱细胞骨经过不同程度的脱钙处理获得；其特征在于，利用脱细胞骨来保持支架材料的三维微结构一致，通过不同程度脱钙处理使脱细胞骨支架具有不同的刚度，以利于诱导干细胞的成骨分化。

本发明中，脱细胞骨可采用常规的方法制备，简而言之为，取多个新鲜猪股骨头的松质骨，用4℃的0.9％盐水浸泡后送至清洁条件下，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径为2～20mm、高为2～20mm的圆柱体或者长×宽×高为2～20mm×2～20mm×2～20mm的立方体等形状样品，冲洗，然后浸泡在4℃蒸馏水中过夜。用1％的Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。用DNA酶/RNA酶37℃温育样品2h后，用PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞骨，保存在4℃环境下。

脱细胞骨具有三维微孔结构，孔直径可控制在300～800μm范围内，孔隙率可以达到70％～95％，并具有良好的联通性，刚度范围一般为1-10Gpa。对脱细胞骨进行不同程度的脱钙处理后可以获得具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料。

本发明还提供了一种制备所述的具有不同刚度三维骨组织工程支架材料的方法，具体步骤如下：

1)获得多个脱细胞骨三维支架；

2)将步骤1)得到的多个支架材料浸入骨组织脱钙溶液中处理不同时间；

3)将步骤2)得到的不同脱钙程度的脱细胞骨支架经过去离子水清洗处理；37℃烘干；

4)将步骤3)得到的具有不同刚度的三维支架材料通过⁶⁰Co(25k Gay)放射消毒后，无菌密封后干燥保存。

优选地，步骤1)所述的脱细胞骨三维支架的制备方法为：取新鲜猪股骨头的松质骨，用4℃的0.9％盐水浸泡后送至清洁条件下，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成所需形状样品，冲洗，然后浸泡在4℃蒸馏水中过夜。用1％的Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。用DNA酶/RNA酶37℃温育样品2h后，PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞骨，保存在4℃环境下。

优选地，步骤1)所述的脱细胞骨三维支架制备成直径为2～20mm、高为2～20mm的圆柱体或者长×宽×高为2～20mm×2～20mm×2～20mm的立方体等形状样品。

优选地，步骤2)所述的脱钙处理时间可根据支架所学刚度值选择为1天～14天。

优选地，步骤2)所述的脱钙处理可选择恒温摇床处理或者微波处理方式。

综上所述，本发明的具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料通过脱细胞骨支架来保证材料的三维微结构一致，利用脱细胞骨的不同脱钙程度来使脱细胞骨支架具有不同的刚度，形成具有不同刚度的三维支架材料。与现有的三维骨组织工程支架材料相比，克服了大多数骨组织工程支架材料在改变基质刚度的同时也改变了微结构的缺陷，这也是本发明提出的关键。本发明提供的三维骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性，可保证骨支架的天然微结构和成分，并具有良好的联通性，有利于细胞的粘附、生长和增殖，利于营养物质的进入以及细胞代谢废物的及时排出。利用不同脱钙程度形成的不同的支架刚度，利于不同干细胞的粘附、增殖与分化，可以促进新骨的生成。用于制备三维骨组织工程支架材料的脱细胞骨可选择不同动物的不同部分的骨作为材料，只要满足所要修复的骨的要求即可。为简洁起见，本发明主要以猪股骨头的松质骨为例加以阐述，其他动物和部分的骨也可以采用相同的原理。

附图说明

图1是在对脱细胞骨进行不同程度脱钙处理后得到的三维骨组织工程支架的压缩杨氏模量；

图2是脱细胞骨在完全脱钙前后的孔径值和孔隙率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

取多个新鲜猪股骨头的松质骨，用4℃的0.9％盐水浸泡后送至清洁条件下，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径为2～20mm、高为2～20mm的圆柱体或者长×宽×高为2～20mm×2～20mm×2～20mm的立方体等形状样品，冲洗，然后浸泡在4℃蒸馏水中4℃过夜。用1％的Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。用DNA酶/RNA酶37℃温育样品2h后，PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞骨，保存在4℃环境下。脱细胞骨具有三维微孔结构，孔直径可控制在300～800μm范围内，孔隙率可以达到70％～95％，并具有良好的联通性，刚度范围一般为1-10Gpa。

将制备得到的多个脱细胞骨支架材料浸入12％的乙二胺四乙酸二钠脱钙溶液，在37℃下用恒温摇床轻轻摇晃不同时长，在处理期间每隔12h更换一次脱钙液。处理时间可根据需要制备的支架的最终刚度值来调整，范围一般在1天～14天之间。例如需要制备刚度为10Mpa左右的三维支架，可选择脱钙处理14天至脱钙终点。将得到的不同脱钙程度的脱细胞骨支架经过去离子水清洗处理后，37℃烘干，得到的具有不同刚度的三维支架材料通过⁶⁰Co(25k Gay)放射消毒后，无菌密封后干燥保存。

脱细胞骨的脱钙处理也可选择微波处理方式。将脱细胞骨支架浸入装有12％的乙二胺四乙酸二钠脱钙溶液的小烧杯中，置入加有200mL冰水的烧杯中，然后放入微波炉中，使脱钙液温度控制在37℃以内，每间隔2min更换一次大烧杯中的冰水，每1h更换一次脱钙液。

为验证所使用的方法的可行性，制备了不同脱钙程度的脱细胞骨支架，然后利用美国Instron公司的电子万能材料动静态实验系统(Electropuls E1000)测试仪器测量支架压缩杨氏模量。如图1所示，随着脱钙率的增加，支架的弹性模量逐渐降低。如图2所示，以完全脱钙的脱细胞骨支架为例，micro-CT实验证实脱细胞骨支架脱钙前后的孔径值和孔隙率均没有发生显著变化。

通过对多个脱细胞骨支架进行不同程度的脱钙处理，在不改变支架微结构的情况下可形成不同刚度的三维多孔支架材料。正是由于这些综合因素，使得本发明提供的三维骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性，利于不同干细胞的粘附、增殖与分化，可以促进新的骨的生成。制备方法简单且成本低，相比以往的三维骨组织工程支架材料有明显的优势。