本发明涉及一种抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，应用于生物材料领域。
背景技术：
脱细胞基质材料是通过物理、化学和生物的方法处理基质材料，进行脱细胞处理、除去相关的抗原后获得的材料。它除去了天然材料中的细胞成分，保留了基质成分，有效降低了天然材料的免疫原性，同时能够保持基质材料的基本结构和性能（如宏观编织结构、微观孔隙结构、物理机械强度等）。常见的脱细胞基质材料有脱细胞真皮基质、脱细胞角膜基质、羊膜脱细胞基质、猪主动脉脱细胞基质、牛（或猪）心包脱细胞基质、猪小肠黏膜下脱细胞基质、尿道脱细胞基质、脱细胞软骨，可用于皮肤、血管、瓣膜、泌尿道等的修复或组织填充，已广泛应用于医疗领域（张晨，王志军，高景恒. 脱细胞组织基质的研究进展.大连大学学报，2007,28（3）：57-60）。
通过交联可以消除或降低免疫原性、改善物理机械性能、提高耐降解能力，更好地满足使用的需要。物理交联法（如热脱氢）由于局限于材料表面且交联度程度低，未能广泛应用。合成交联剂来源广泛，可以通过分子设计的方法获得特定的分子结构，引入多个化学活性基团到交联剂分子中，因而交联高；但合成交联剂（如戊二醛）由于副产物和纯度不足等原因，容易导致交联后的材料生物相容性差。天然产物及其衍生物交联剂（如京尼平），相对生物相容性好，但往往品种较少，制备和纯化成本相对较高，无法大规模产业化应用。
近年来，随着科学的进步，以氧化天然多糖类为代表的天然产物衍生物交联剂，成为研究热点。该类交联剂以天然糖类为母体，通过氧化形成多个醛基，从而使糖类具有交联性能。由于多糖生物相容性好，引入到生物材料中后，仍能保证交联后材料的具有良好的生物相容性。例如，将海藻酸盐氧化制备得到的氧化海藻酸钠被用作生物医用材料交联剂，取得了较好的效果（ Hu, Y， Lju, L，Gu ZP， Dan, WH et al. Modification of collagen with a natural derived cross-linker，alginate dialdehyde[J]. CARBOHYDRATE POLYMERS，2014，102: 324-332。）此种交联剂拥有较高的交联度，克服了物理交联程度低的缺点；拥有较好的生物相容性，克服了合成交联剂生物相容性差的缺点。由于多糖类相对价廉易得，制备成本相对较低，因而具有广阔的应用前景，是比较理想的生物交联剂。
生物材料在治疗疾病的同时，也存在一些问题。人们发现无论是长期或是短期留置在人体内的生物材料，常会引起各种细菌感染。据报道，美国一年内发生的血管内导管感染病例就有5万至20万例，死亡率高达20%。而且，这些感染一旦发生，即使应用正常剂量上百倍的药物也不能有效治疗，人体自身的免疫系统也不能清除这些细菌。据统计，45%的医院感染与生物材料的使用相关（罗建斌.抗菌生物材料的研究进展[J].高分子通报，2009，3:58-60）。而对于治疗体表创伤、烧伤的生物材料，感染也是最为普遍的并发症之一，它会导致伤口出现大量的渗出液，分解细胞外基质蛋白及多种生长因子，阻碍表皮再生及伤口闭合，从而显著影响康复的进程，甚至有可能导致烧创伤患者死亡（周英，许零.抗菌敷料研究进展. 中华损伤与修复杂志，2012，7（3）：307-310）。可见，无论是应用于体表还是体内的生物材料，具有抗菌抑菌功能是生物材料需要具备的高级功能，生物材料抗菌性能的改善成为保证生物材料使用性能的关键技术之一。
目前广泛使用的抗菌材料包括抗生素、金属离子、季铵盐、天然抗菌材料等。抗生素的使用，容易产生抗药性；金属离子（如银）则可能存在细胞易变质、性能不稳定、成本高等多种问题；普通季铵盐拥有良好的广谱抗菌性，但往往生物相容性不佳；天然抗菌材料（如壳聚糖）生物相容性优良，抗菌性能良好，但溶解性较差，限制了其应用。
壳聚糖季铵盐是将壳聚糖的氨基转变为季铵盐基团或者接枝低分子季铵盐而得到的产物。它属于聚阳离子化合物，具有良好的水溶性、絮凝性、生物相容性、吸湿保湿性和更好的抗菌性等特点，因此其应用范围相当广泛。（钟婧，洪艳，陈勇.壳聚糖季铵盐的最新研究进展. 中国组织工程研究与临床康复，2008，12（6）：1115-1118）。
采用物理共混的方法，将壳聚糖季铵盐加入到生物材料中，能够赋予生物材料以抗菌抑菌功能，是目前普遍采用的方法。然而，壳聚糖季铵盐分子中缺少具有化学反应活性的基团，难以与生物材料形成牢固的共价键结合。物理共混加入的壳聚糖季铵盐容易从生物材料中产生迁移、流失，不能产生长久的抗菌抑菌性能，难以达到预期效果。
由上可见，目前的生物材料，一方面需要采用生物相容性优良的交联剂进行交联，同时需要赋予生物材料以良好的抗菌抑菌功能。目前的方法往往只能满足其中之一。能否将交联与抗菌合二为一，在交联的同时，赋予生物材料以抗菌性？我们在长期的生物材料交联研究中，提出了“功能化尺度交联”的新观点：即在交联的同时，赋予生物材料以其它功能。该观点为我们寻找和制备新一代功能型交联剂提供了新思路。采用兼具交联性和抗菌性的交联剂，既可以满足交联的需要，又可以赋予材料以抗菌性能。
氧化壳聚糖季铵盐，其母体为壳聚糖，本身具有良好的生物相容性；壳聚糖季铵盐经过选择性氧化后，产生多个化学活泼的醛基，因而能够与生物材料之间形成牢固的交联，提高材料的耐降解能力；同时在生物材料中接入了壳聚糖季铵盐结构，因而具有优良的抗菌抑菌性能，由于交联过程中生成了牢固的共价键，因而有效避免了抗菌剂的迁移和流失，克服了以往方法的缺点。本方法将生物材料的交联与赋予抗菌性能合二为一，同时达到了产生交联效果与赋予抗菌性的双重目的，是一种新型的功能性脱细胞基质材料的制备方法，可以广泛应用于生物材料领域。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，它是由以下技术措施来实现的。
一种抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，其特征是：称取100重量份的脱细胞基质材料，在20～65℃下，加入100～1000重量份的pH值为3.0～10.5的缓冲液，处理10～60min；然后加入1～20重量份的氧化度为1～98%的氧化壳聚糖季铵盐，处理0.5～24.0小时；弃去反应废液，加入200～1000重量份的水，清洗10～30分钟；弃去清洗废液，加入100～1000重量份的pH值为3.0～10.5的缓冲液，加入0.5～2.0重量份的氨基酸，在20～65℃下，处理0.5～4.0小时；弃去废液，加入200～1000重量份的水，清洗20～60分钟；弃去废液，加入100～300重量份的水，加入0.1～1.0重量份的乳酸或乳酸钠，在20～35℃下，处理30～90分钟，将浴液pH调节至中性；弃去废液，加入200～1000重量份的30～42℃的注射水，清洗1～4h；弃去废液，加入200～1000重量份的30～42℃的注射水，清洗1～4h。
根据权利要求1所述的抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，其中所述的氧化壳聚糖季铵盐是指壳聚糖季铵盐经选择性氧化后形成的结构中含有多个醛基的壳聚糖季铵盐。
根据权利要求1所述的抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，其中所述的氨基酸，是指甘氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
根据权利要求1所述的抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，其中所述的pH值为3.0～10.5的缓冲液，该pH是通过使用醋酸—盐酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸—硼砂缓冲溶液、NaHCO3-NaOH缓冲溶液达到的。
权利要求1所述一种抗菌型脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于该方法可用于脱细胞真皮基质、脱细胞角膜基质、羊膜脱细胞基质、猪主动脉脱细胞基质、心包脱细胞基质、猪小肠黏膜下脱细胞基质、尿道脱细胞基质、脱细胞软骨的制备中。
本发明中所用氧化壳寡糖季铵盐为医药级，其它材料均为分析纯或生物试剂。
本交联方法具有以下优点：
（1）交联程度高：由于氧化壳聚糖季铵盐分子含有多个醛基，可以与脱细胞基质材料中的氨基等产生多点结合，形成较高程度的交联。可以降低脱细胞基质材料的抗原性，改善的物理机械性能和耐降解性；
（2）抗菌抑菌性能好：由于壳聚糖季铵盐较强的阳电荷，具有广谱抗菌性，抗菌性能优良，交联后的脱细胞基质材料中引入了壳聚糖季铵盐，因而就赋予了脱细胞基质材料以良好的抗菌抑菌功能；
（3）抗菌抑菌性能持久：通过氧化壳聚糖季铵盐中的醛基与脱细胞基质材料中的氨基等形成牢固的共价键，键能大，稳定性高，因而有效避免了物理共混法易产生的壳聚糖季铵盐的迁移与流失的缺陷，可长期保持其抗菌抑菌性能；
（4）生物相容性好：氧化壳聚糖季铵盐中醛基反应后，结构中余下壳聚糖季铵盐基团，而壳聚糖季铵盐来源于壳聚糖，因而继承了壳聚糖良好的生物相容性。采用氨基酸后处理，将可能残留的醛基除去，保证了交联材料的良好生物相容性；
（5）可调控性好：可以通过选择氧化壳聚糖的种类、控制氧化程度、控制交联剂的用量，来控制交联程度和抗菌性能；
（6）可生物降解：由于壳聚糖季铵盐具有生物可降解性，接入到生物材料后，仍然可以保持交联材料的生物降解性，可以通过交联程度来调节其降解性能；
（7）赋予生物材料以良好的亲水保湿性能：在生物材料中引入了壳聚糖季铵盐，将壳聚糖季铵盐的保湿性能赋予给生物材料，从而使交联后的材料具有良好的亲水、保湿性能；
（8）颜色浅淡：经氧化壳聚糖季铵盐交联的胶原，可以保持白色，无戊二醛交联后的深黄色，亦无京尼平交联后的深蓝色；
（9）原料价格低廉，可大规模产业化：氧化壳聚糖季铵盐与京尼平等优良交联剂相比，其价格更便宜，因而，本方法可以应用于工业化大生产，广泛应用于生物材料领域。
综上所述，本发明以氧化壳聚糖季铵盐为原料，将其应用于脱细胞基质材料的交联，一方面可以降低材料的抗原性，提高材料的结构稳定性和耐降解能力；同时能够赋予材料以良好的抗菌抑菌功能，是一种新型的功能性脱细胞基质材料的制备方法，可广泛地应用于生物材料领域。
具体实施方式
下面通过实例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实例只用于对本发明的进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
（1）称取100重量份的脱细胞猪真皮基质，加入到反应器中；
（2） 加入130重量份的pH值为8.5的硼酸—硼砂缓冲溶液，转动30分种；
（3）称取氧化度为8%的氧化N-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖8重量份，溶解于20重量份的蒸馏水中；
（4）将氧化壳聚糖季铵盐的水溶液加入到反应器中，升温到37℃，反应16小时，倒去反应废液；
（5）加入300重量份的纯水，清洗20分钟，倒去废液；
（6）加入100重量份的37℃的pH值为8.5的硼酸—硼砂缓冲溶液，加入1.5重量份的赖氨酸，转动2小时，倒去废液；
（7）加入1000重量份的纯水，清洗30分钟，倒去废液；
（8）加入200重量份的纯水，加入0.5重量份的乳酸，处理1.5小时，弃去废液；
（9）加入500重量份的的37℃的注射水，清洗1小时；倒去清洗液，再加入加入1000重量份的的37℃的注射水，清洗3小时。
实施例2
（1）称取100重量份的牛心包脱细胞基质，加入到反应器中；
（2） 加入200重量份的pH值为4.8的醋酸—盐酸缓冲溶液，转动60分种；
（3）称取氧化度为80%的氧化N，N，N-三甲基壳聚糖季铵盐4重量份，溶解于50重量份的pH值为4.8的醋酸—盐酸缓冲溶液中；
（4）将氧化壳聚糖季铵盐的溶液加入到反应器中，升温到42℃，转动8小时，倒去反应废液；
（5）加入500重量份的纯水，转动20分钟，倒去废液；
（6）加入150重量份的pH值为4.8的醋酸—盐酸缓冲溶液，加入0.5重量份的精氨酸，在42℃下，转动4小时，倒去废液；
（7）加入800重量份的纯水，转动20分钟，倒去废液；
（8）加入100重量份的纯水，加入1.0重量份的乳酸钠，转动90分钟，倒去废液；
（9）加入1000重量份的的42℃的注射水，清洗2小时；倒去清洗液，再加入加入500重量份的的42℃的注射水，清洗4小时。
实施例3
（1）称取100重量份的羊膜脱细胞基质，加入到反应器中；
（2）加入100重量份的pH值为9.4的NaHCO3-NaOH缓冲溶液，转动20分种；
（3）称取氧化度为5%的氧化O-羟丙基三甲基氯化铵N-三甲基壳聚糖16重量份，溶解于50重量份的纯水中；
（4）将氧化壳聚糖季铵盐的溶液加入到反应器中，升温到32℃，转动24小时，倒去反应废液；
（5）加入800重量份的纯水，转动40分钟，倒去废液；
（6）加入150重量份pH值为9.4的NaHCO3-NaOH缓冲溶液，加入2.0重量份的甘氨酸，在32℃下反应1小时，倒去废液；
（7）加入300重量份的纯水，转动15分钟，弃去废液；
（8）加入300重量份的纯水，加入1.0重量份的乳酸，转动40分钟，弃去废液；
（9）加入600重量份的的37℃的注射水，清洗2小时；倒去清洗液，再加入加入1000重量份的的32℃的注射水，清洗4小时；
（10）取出羊膜脱细胞基质，冷冻干燥。