本发明涉及医学复合性生物制剂领域，尤其涉及一种脂肪组织复合制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
：自体脂肪移植是临床经常使用的一种脂肪移植方案，这种方法的优点是生物相容性好，组织来源丰富，易于塑形，不会产生免疫排斥等不良反应；缺点是注射入面部或乳房部位的脂肪颗粒不能很好的建立起血液供应系统。当大量脂肪堆积到一起时，会因供血不足导致脂肪细胞液化坏死、溶解、吸收，极易引发感染、变形、疼痛等后遗症，常需要再次注射来维持形状。单纯颗粒脂肪组织注射移植后，脂肪组织只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，而这种供应的距离只有150～200μm，超过该距离就需要生成新的血管来提供营养。然而，新生血管生长缓慢，每天只生长十几微米，致使移植脂肪外周部血供重建缓慢，血供延迟，移植脂肪中心长期处于缺血状态。移植脂肪中心部分的脂肪组织由于长时间缺血、缺氧，发生了坏死、液化，继而被巨噬细胞清除，发生纤维囊性变，微囊的出现预示着移植体最终纤维化和被吸收。越来越多的研究逐渐达成了共识，移植早期建立充分和及时的血供，移植物及时地再血管化是影响其成活体积的关键，也是减少其纤维囊性变的关键。技术实现要素：有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种脂肪组织复合制剂及其制备方法与应用。为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：脂肪组织复合制剂，包含血小板衍生生长因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、脐带间充质干细胞(MesnchymalStemCells，MSCs)及脂肪干细胞。优选地，所述脂肪组织复合制剂包含血小板衍生生长因子、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和脂肪组织。优选地，所述脂肪组织复合制剂含有下述体积份的下述组分：进一步优选地，所述脂肪组织复合制剂含有下述体积份的下述组分：一种脂肪组织复合制剂的制备方法，包括以下步骤：将脂肪干细胞、血小板衍生生长因子和脐带间充质干细胞分别用生理盐水配制成悬液，再将脂肪组织、脂肪干细胞悬液、血小板衍生生长因子悬液和脐带间充质干细胞悬液按照比例混匀。优选地，所述脂肪组织复合制剂的制备方法，包括以下步骤：将脂肪组织加入脂肪干细胞悬液，搅拌均匀后转移至一注射器中，并连接至三通管；把血小板衍生生长因子悬液与脐带间充质干细胞悬液搅拌均匀后转移至另一注射器中，并连接至上述三通管上；抽拉一注射器活塞的同时推挤另一注射器活塞，直至各组分充分混匀。上述脂肪组织复合制剂在整形或美容中作为填充制剂的应用。所述整形或美容包括充填颜面部的凹陷畸形、隆乳、丰颞和隆鼻。血小板衍生生长因子是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，可促进纤维母细胞的生成，而且可以促进皮下毛细血管形成，修复皮下血液微循环系统。脐带间充质干细胞分离自脐带组织，其来源广泛，增殖能力强，免疫原性弱，并且取材方便，异体移植不发生免疫排斥，而且具有免疫调节作用，能提高细胞或组织移植的成功率。此外，脐带间充质干细胞在回注后可分化形成新的组织，分泌的多种活性因子，可促进血管形成和组织修复。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，研究发现脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植。本发明通过将脂肪干细胞注入体内自体分化成脂肪细胞的方法，来获取大量的脂肪细胞。本发明复合制剂中输注的异体脐带间充质干细胞，细胞量较大，增殖能力强，可诱导分化为脂肪组织，回注后可分化形成新的组织，并且分泌的多种活性因子，具有免疫调节作用，促进血管形成和组织修复。加入的血小板衍生生长因子及间充质干细胞分泌的多种细胞因子，形成良好的微环境，可以使脂肪干细胞及间充质干细胞分化为成熟脂肪细胞，发挥组织替代作用。同时间充质干细胞可以抑制炎症反应，促进皮下新生毛细血管形成，使移植后的脂肪组织迅速重建血供，提高移植脂肪的存活率，避免组织液化坏死。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供一种含脂肪干细胞、脐带间充质干细胞及血小板衍生生长因子辅助脂肪移植用于组织填充的复合生物制剂。此复合制剂具有注射后易于再血管化、成活率提高的优点，安全可靠，适用于软组织填充、修复软组织缺损造成的凹陷畸形、面部及身体美容塑形，如可以用于充填颜面部的凹陷畸形等，也用于隆乳、丰颞和隆鼻等，在美容充填中可促进外形恢复、防止液化坏死。(2)本发明复合制剂在人体内存活率高。通过实验观察，移植后具有大量正常脂肪细胞，脂肪细胞清晰，仅有少量坏色、炎性反应现象和纤维间隙；移植2-3个月后，脂肪组织颜色淡黄，柔软，有光泽，仅少许纤维包裹；本发明脂肪组织制剂回注填充后，移植脂肪中心部位的微血管密度正常，血管再造化明显。本发明脂肪组织制剂的制作方法简单，可以大量制备。附图说明图1为实施例1流式检测中对照组FSC-SSC图。图2为实施例1流式检测中对照组CD73、CD45的流式检测结果图。图3为实施例1流式检测中对照组CD19、CD11b的流式检测结果图。图4为实施例1流式检测中对照组CD34、CD90的流式检测结果图。图5为实施例1流式检测中对照组CD105、HLA-DR的流式检测结果图。图6为实施例1流式检测中实验组FSC-SSC图。图7为实施例1流式检测中实验组CD73、CD45的流式检测结果图。图8为实施例1流式检测中实验组CD19、CD11b的流式检测结果图。图9为实施例1流式检测中实验组CD34、CD90的流式检测结果图。图10为实施例1流式检测中实验组CD105、HLA-DR的流式检测结果图。图11为实施例1中脐带间充质干细胞成脂诱导分化中对照组染色图片。其中，图11A、图11B和图11C分别是在100×、200×、400×下观察的图片。图12为实施例1中脐带间充质干细胞成脂诱导分化中实验组染色图片。其中，图12A、图12B和图12C分别是在100×、200×、400×下观察的图片。图13为实施例1中脂肪干细胞在倒置显微镜下观察诱导分化结果图。图14为实施例1中脂肪干细胞油红O染色结果图。具体实施方式为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。实施例1、脂肪组织复合制剂本实施例中复合制剂由脂肪组织、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF组成。使用生理盐水将脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF分别配制成悬液。其中，脐带间充质干细胞悬液的密度为5.5×105个/ml，PDGF悬液的浓度为5ng/ml，脂肪干细胞悬液的密度为1×106个/ml。将0.4ml脂肪组织加入0.1ml脂肪干细胞悬液中，搅拌均匀后转移至一注射器中，并连接至三通管；把0.15ml血小板衍生生长因子悬液与0.35ml脐带间充质干细胞悬液搅拌均匀后转移至另一注射器中，并连接至上述三通管上；抽拉一注射器活塞的同时推挤另一注射器活塞，直至各组分充分混匀即得本发明复合制剂。将复合制剂转移至体积较大的注射器中，回注前低温(4℃)保存。采用此种方法直接在注射器内混匀制备复合制剂，制成的复合制剂也存储在注射器中，可以减少操作步骤，减少耗材成本和污染几率，也便于后期医生手术用注射器回填操作。本实施例中各组分的来源或制备方法如下：(1)PDGF选用MCSD002人血小板衍生生长因子，生产厂家为上海麦仓生物科技有限公司，0.5mg/支，保存：2-8℃。(2)脐带间充质干细胞本实施例中脐带间充质干细胞的分离提取及传代培养参考孙国栋等在《人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究》(孙国栋，李志忠，王晶，等.人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究[J].西安交通大学学报：医学版，2010，31(2)，143-147)中报道的相关内容进行。对获得的脐带间充质干细胞进行表面抗原检测和成脂诱导分化，参照王娟等人在《人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定》(王娟，陆琰，何冬梅，等.人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定[J].暨南大学学报(医学版)，2009，30(4)，367-372)中报道的方法进行。①脐带间充质干细胞表面抗原检测的具体方法如下：取P3代脐带干细胞，吸去培养基，用0.25％胰酶溶液常规消化，制成1×105的细胞悬液，分别取抗人CD73、CD45、CD19、CD34、CD90、CD11b、CD105、及HLA-DR的单克隆抗体各5μL，加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μLPBS重悬后上机检测。P3代脐带间充质干细胞流式检测结果如图1-10所示。由图1-10可知，本发明分离培养的脐带间充质干细胞CD73、CD90、CD105≥95.0％；CD45、CD19、CD34、CD11b及HLA-DR≤2.0％，提示了复合制剂中添加的细胞并未出现分化现象，符合间充质干细胞的特点。②脐带间充质干细胞的成脂诱导分化的具体方法如下：取P3代脐带间充质干细胞消化，以106个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，培养24h后，细胞贴壁并伸展，更换成脂分化培养基(含有DMEM-F12培养基、体积份数为10％胎牛血清、10mg/L胰岛素、1μmol/L地塞米松、100μmol/L吲哚美辛、500μmol/LIBMX)，含有10％胎牛血清的完全培养基组作为阴性对照。每3d更换1次培养基，定向分化诱导第21d后即可以使用油红O染色定性观察体外诱导分化的结果。染色图片如图11和图12所示。对照组结果为阴性，实验组结果为阳性，说明获得的脐带间充质干细胞可以被成脂诱导分化。(3)人脂肪组织来源干细胞的分离和培养取人吸脂术中吸出的脂质部分，于超净工作台内PBS清洗组织并切除肉眼可见的小血管。将组织充分剪碎，用0.1％Ⅰ型胶原在37℃消化45min，等量体积DMEM/F12+10％FBS中和酶活性，1300rpm离心5min，弃上清，DMEM/F12+10％FBS重悬沉淀，200um筛网过滤，1300rpm离心5min。DMEM/F12+10％FBS重悬后，细胞悬液用细胞记数板记数，按1×104-2×104个/ml接种于25cm2培养瓶中，培养瓶中加入全培养基，置于37℃，积分数为5％CO2培养箱中培养，48小时换液，后3-4天换液1次，原代细胞培养7-10天即可融合传代。脂肪干细胞定向诱导分化为成熟脂肪细胞参考鲁峰等在《脂肪组织来源干细胞定向分化脂肪组织的体内外实验研究》(鲁峰，高建华，水野博司，等.中华整形外科杂志，2007，23(5)，412-416)报道的相关内容进行，并对脂肪干细胞(ASCs)表面抗原、向脂肪细胞分化能力进行检测。①细胞表面抗原分析流式细胞仪测得干细胞表面标记结果如表1所示。表1、ASCs表面抗原分析(％)种类nCD29CD44CD34HLA-DRASCs650.218.149.01.1由表1可知，表面标记CD29、CD44、CD34阳性表达，说明该细胞具有干细胞特性；HLA-DR几乎无表达，排除除该类细胞是成纤维细胞。②倒置显微镜观察加入成脂诱导液定向分化后6天，胞浆内出现脂滴并逐渐聚集。分化诱导后8天，胞形态发生明显改变，从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变圆，并且开始出现充满脂滴的细胞。分化诱导2周后出现了大量的脂滴(见图13)，15天后大约有35％-50％的ASCs被诱导成为成熟的脂肪细胞。未加成脂诱导剂的阴性对照组则为梭形细胞形态。③油红O染色脂肪分化诱导后进行成脂分化，油红O染色后细胞内出现大量红染颗粒(见图14)，明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴，证实了ASCs具有向脂肪细胞定向诱导分化的潜能。(4)脂肪组织本实施例中脂肪组织按照常规方法制备。实施例2、脂肪组织复合制剂本实施例中复合制剂由脂肪组织、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF组成。使用生理盐水将脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF分别配制成悬液。其中，脐带间充质干细胞悬液的密度为5.5×105个/ml，PDGF悬液的浓度为10ng/ml，脂肪干细胞悬液的密度为1.5×106个/ml。本实施例中脂肪组织、脂肪干细胞、脐带间充质干细胞和复合制剂的制备方法与实施例1相同。实施例3、脂肪组织复合制剂本实施例中复合制剂由脂肪组织、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF组成。使用生理盐水将脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF分别配制成悬液。其中，脐带间充质干细胞悬液的密度为5.5×105个/ml，PDGF悬液的浓度为20ng/ml，脂肪干细胞悬液的密度为2×106个/ml。本实施例中脂肪组织、脂肪干细胞、脐带间充质干细胞和复合制剂的制备方法与实施例1相同。对比例、脂肪组织复合制剂本实施例中复合制剂仅为脂肪组织。本实施例中脂肪组织的制备方法与实施例1相同。为了更好的验证本发明复合制剂的效果，发明人进行了动物实验。选取雌性4～6周裸鼠90只，随机分为6组，每组15只。以2％戊巴比妥钠50ms/ks腹腔注射麻醉，用注射器将各实施例和对比例中的复合制剂分别随机注入每只裸鼠背部皮下，每只裸鼠注射0.5ml(约450mg)。脂肪移植术2个月后考察移植脂肪组织存活率、纤维化及坏死程度和VEGF的基因表达水平。效果实施例1、移植脂肪组织存活率移植3个月后，沿移植物被膜外分离移植物，完整取出移植物对其进行湿重测定。结果如表1所示。表1、移植物湿重统计表分组湿重移植前450±4.0mg对比例组95.20±3.50mg实施例1组190.05±3.10mg实施例2组265.87±4.50mg实施例3组189.05±2.50mg使用统计软件SPSS17.0进行数据处理。采用随机区组设计资料的方差分析，对湿重进行比较。结果表明，实施例2组移植脂肪组织湿重最高，明显高于其他组(P<0.05)，实施例1和3组移植脂肪组织湿重基本相同，但也明显重于对比例组移植脂肪组织湿重。由上述实验结果可知，使用本发明脂肪组织复合制剂可以明显的减少移植脂肪组织液化、坏死及被吸收的现象，脂肪组织可以正常增殖。效果实施例2、纤维化及坏死程度采用Gundersen于1998年提出的“点计数”测量方法。采用网格测试系统，包括20条线及100个交点，测量每张切片的互不重复、随机选择的10个200倍视野(以盲法抽取的两位观测者进行测量，计数l0个视野的纤维化及囊腔的数目)，将各组移植物测量得到的点个数进行纤维化及坏死程度的比较。结果如表2所示。表2、纤维化及坏死程度结果表分组点数法(纤维化和坏死)对比例组(630.5土4.5)个/IOHF实施例1组(200.2土5.8)个/IOHF实施例2组(150.5土7.5)个/IOHF实施例3组(235.5土8.5)个/IOHF使用统计软件SPSS17.0进行数据处理。采用随机区组设计资料的方差分析，对纤维化及囊腔数目行比较。结果表明，对比例组中不添加脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF，其移植物的纤维化和坏死程度最高，约为630.5个/IOHF；实施例1组的纤维化和坏死程度约为200.2个/IOHF，实施例2组的纤维化和坏死程度约为150.5个/IOHF、实施例3组的纤维化和坏死程度约为235.5个/IOHF，三组实施例与对比例相比，实施例1～3组移植脂肪组织纤维化及囊腔数目明显较少，均具有显著性差异，P<0.05。效果实施例3、VEGF的基因表达水平通过ELISA技术检测移植物中VEGF的基因表达水平，结果如表3所示。表3、VEGF的基因表达水平结果表分组VEGF表达水平对比例组(120.0±3.50)pg/mg实施例1组(225.25±3.50)pg/mg实施例2组(295.05±4.50)pg/mg实施例3组(216.00±5.63)pg/mg使用统计软件SPSS17.0进行数据处理。采用随机区组设计资料的方差分析，对VEGF表达水平进行比较。结果表明，对比例组不添加脐带间充质干细胞、脂肪干细胞和PDGF，通过ELISA技术检测移植物中VEGF的基因表达水平最低，约为120/pg/mg；实施例1组约为225.25/IOHF，实施例2组约为295.05pg/mg、实施例3组约为216.05/pg/mg，三组实施例与对比例相比，实施例1～3组检测移植物中VEGF的基因表达水平明显增高，均具有显著性差异，P<0.05。实施例2组移植脂肪组织VEGF表达水平明显高于其他组(P<0.05)。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 2 3