一种基于多类细胞3D打印的神经导管及其制作方法与流程

本发明涉及一种神经导管的制作方法，尤其涉及一种基于多类细胞3D打印的神经导管及其制作方法。

背景技术：

神经纤维缺损常由于创伤、挤压、手术等原因导致患者神经纤维直接或者间接受到损伤而造成。典型表现包括运动障碍、感觉障碍和自主神经功能障碍。神经纤维损伤后的修复与多种因素有关，但普遍存在着时间长、预后差等多种问题，甚至部分神经纤维的损伤、断裂、缺损根本无法修复，严重者将导致终身残疾。故神经纤维损伤后的再生和功能恢复一直是神经科学领域的热门课题。目前，自体神经移植作为神经纤维损伤的金标准，是桥接修复神经缺损的经典方法，但这种方法存在一定缺陷，除供体来源有限，会造成供体部位部分功能丧失及永久性神经损伤，还受可修复长度、瘫痕形成等问题的限制。当前研究着重于发展能够通过设计仿生物理结构促使再生神经通过损伤区的神经导管。设计具有良好的生物相容性、生物可降解性和力学性能的神经导管是临床医学的重大需求。

传统人工神经移植物多采用注模方法制备，或采用静电纺技术与生物打印技术相结合的方法生产纳米纤维的人工移植材料。近年来，随着工程技术的发展，喷墨打印技术被成功的运用于医学与生物医学工程中，形成了生物打印技术，这种技术是将生物墨滴喷射到接受体形成图像或文字的非接触性打印技术。生物打印的墨水可以设计为特制的细胞溶液或含有生物活性物质的溶液。生物打印的优势在于一次成型，打印程序精确可控，可用于组织工程中人工组织的定制生产。

以往设计的具备单孔状截面结构的人工神经导管，在神经纤维再生过程中，可提供足够的力学支撑，以确保再生神经纤维不被塌陷或受压迫的导管结构以及体内组织所阻挡。但由于神经纤维是神经元轴突的集合，在神经纤维修复过程中许多轴突的生长速度并不一致，且根据神经元类型的不同可分为运动神经纤维和感觉神经纤维，所以在缺乏神经元轴突导向构造的导管，再生的神经元轴突将失去良好的有序性和方向性，呈混杂生长，大大降低神经再生的效率。而且神经缺损距离越长，再生神经元轴突混杂生长的几率越高，再生神经纤维即便达到远断端，也不能与远端的运动、感觉神经纤维束正确对接，由此导致的神经纤维错接率，严重影响了神经再生的效果。

神经纤维的再生过程中，需要神经断端的雪旺细胞不断增殖、移行至神经纤维缺损局部，作为神经元再生轴突的支持细胞，这就需要神经导管具备较好的细胞亲和力、亲水性和较大的表面积，为细胞提供良好的支持和生长界面。另外，营养物质也要易于到达再生轴突局部，以便于神经再生轴突以及雪旺细胞与局部微环境交换营养物质、进行新陈代谢和生长，这就需要神经导管具备一定的侧壁孔隙率，以便营养物质自由扩散。另外，既往的神经导管往往只能修复3cm以内的神经纤维缺损，因为更长的修复需要的时间更久，远端效应器官失去神经支配时间过久，导致无法恢复相应的功能。故而需要设计既能提高神经纤维的结构修复程度又能提高神经纤维的修复速度的神经导管。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种由高分子丝线采用编织工艺制作成可降解的管状外层编织支架和内部编织支架，并通过常压等离子体处理后，利用3D生物打印技术，将不同类型细胞制作的生物墨水打印在管状编织支架的外表面，并组装而成的神经导管。

为实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：这种基于多类细胞3D打印的神经导管的制作方法，包括如下步骤：

1)用高分子材料制作单丝、并组装成编织线，并制作神经导管的管状外层编织支架和内部编织支架；

2)用常压等离子体对管状外层编织支架和内部编织支架进行表面处理；

3)获取多类细胞，将每种细胞分别用溶于生物溶剂制成生物墨水，置于不同打印墨盒中；

4)调整生物打印参数，将生物墨水打印到编织型管状内部、外层生物支架的外表面；

5)将管状外层编织支架和内部编织支架进行组装，并用高分子胶在神经导管的两端进行粘合固定。

作为优选：步骤1)中，制作单丝采用聚羟基丁酸-羟基戊酸共聚物(PHBV)、聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或几种材料。

作为优选：步骤1)中，编织线为2-4股长丝并捻而成，捻度为200-300捻/m；长丝平均细度6-12tex，为2-3股复丝组成，每根复丝中包含6-12根单丝，单丝直径10-18μm。

作为优选：步骤1)中，管状编织外层支架采用赫格利斯编织工艺，管壁孔隙率55％-65％；管状编织内部支架采用二维三轴向编织工艺，管壁孔隙率40％-50％。

作为优选：步骤1)中，制作管状外层编织支架和内部编织支架的编织机锭数：8-16锭，编织环境：温度20±2℃，相对湿度65±2％；编织完成后定型，定型温度65-75℃，定型时间：10-20min；管状外层编织支架和内部编织支架的长度为1-100mm，外层管状支架内径为3-5mm，壁厚为0.5-0.8mm，内部管状支架内径为0.8-1.2mm，壁厚为0.3-0.5mm。

作为优选：步骤2)中，常压等离子体处理所用气体为氦气或氧气，气体温度为90-110℃，流量为6-18L/min，处理时长为3-15min。

作为优选：步骤3)中，生物溶剂为琼脂糖、胶原、甲基纤维素、丝蛋白、角蛋白中的一种和去离子水按照1：1的摩尔比例制成；所述细胞来源为雪旺细胞、血管内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞中的两种或者两种以上的组合。

作为优选：步骤3)中，将每一种生物墨水分别装入打印墨盒，墨水的细胞浓度为5×10⁶～1×10⁸cells/ml。

作为优选：步骤4)中，生物支架在进行多细胞打印时，需套入自转轴，自转轴以3-8°/s的角速度转动，喷嘴以10-100um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为生物支架的长度1-100mm，摆动2-5个来回；打印机的工作环境为0-4℃条件下，喷嘴直径为60-100um，喷嘴数量为2-10个，喷嘴到生物支架表面的距离为5-15mm。

作为优选：步骤5)中，以5-10根管状内部编织支架套入管状外层编织支架中，所用高分子胶为聚乙烯醇、丙烯酸酯或聚氨酯，4-6℃干燥6-8h。

本发明具有以下的特点和有益效果：1)神经导管支架所用材料为高分子可降解材料，材料易得，具备一定的强度且生物相容性好；2)通过编织得到的神经导管支架侧壁具有较多孔隙，且可以通过编织方法的不同，调节导管侧壁的致密疏松程度，利于营养物质的运输和交换；3)常压等离子体处理增加了神经导管编织支架的纤维表面积，提高支架的亲水性，增强生物墨水的附着力；4)神经导管横截面具有的多管道结构仿生度更好，提高再生神经轴突生长的速度和方有利于神经修复；5)打印的细胞可以在局部直接发挥其功能，并且不同类型的细胞之间可发挥协同效应；6)本发明的制备方法机械化程度高，程序化程度高，可以定制生产亦可大批量生产，经济效益高；7)外层管状支架与内部管状支架的外表面打印的细胞类型可以相同或者不同，或者在同一支架的外表面按照先后顺序，打印不同类型的生物墨水。

附图说明

图1为实施例1的再生神经的功能恢复比较图；

图2为实施例2的再生神经的功能恢复比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

实施例1：

1)编织线的制备:制作直径12μm的单丝，8根单丝制作成复丝，2股复丝制作成长丝，将2股平均细度6tex的长丝，在温度25℃、相对湿度70％的大气条件下，按200捻/m将2股长丝并捻成编织线；

2)管状外层编织支架:将编织线在10锭立式锭子编织机上，温度20℃，相对湿度65％环境下，采用赫格利斯编织工艺进行编织，编织角为45°，套管内径为3mm，壁厚为0.5mm，长度为20mm；

3)管状内部编织支架：将编织线在8锭立式锭子编织机上，温度20℃，相对湿度65％环境下，采用二维三轴向编织工艺，编织角为55°，套管内径为0.8mm，壁厚为0.3mm，长度为20mm；

4)常压等离子体处理:所用气体为氦气，气体温度为90℃，流量为6L/min，处理时长为8min；

5)取琼脂糖和去离子按照1：1的摩尔比例制成溶液，用该溶液将雪旺细胞、血管内皮细胞分别制成悬液，调整悬液细胞浓度为5×10⁶cells/ml，制成生物墨水；

6)将两种生物墨水分别装入打印墨盒，在2℃工作环境下，以60um直径的2个喷嘴进行打印，喷嘴到生物支架表面的距离为5mm；

7)在外层管状支架的外表面打印含有血管内皮细胞的生物墨水，在内部管状支架的外表面打印含有雪旺细胞的生物墨水；

8)将外层管状支架套入自转轴，自转轴以3°/s的角速度转动，喷嘴以20um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为20mm，摆动3个来回；

9)将内部管状支架套入自转轴，自转轴以3°/s的角速度转动，喷嘴以25um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为20mm，摆动2个来回；

10)神经导管的组装：将5根内部编织小管装入1根外层管状编织套管内，并在两端丙烯酸酯粘合固定，4℃干燥8h。

实施例2：

1)编织线的制备:制作直径14μm的单丝，6根单丝制作成复丝，2股复丝制作成长丝，将3股平均细度8tex的长丝，在温度25℃、相对湿度70％的大气条件下，按250捻/m将2股长丝并捻成编织线；

2)外层管状编织套管:将编织线在12锭立式锭子编织机上，温度20℃，相对湿度65％环境下，采用赫格利斯编织工艺进行编织，编织角为45°，套管内径为5mm，壁厚为0.6mm，长度为80mm；

3)内部编织小管：将编织线在12锭立式锭子编织机上，温度20℃，相对湿度65％环境下，采用二维三轴向编织工艺，编织角为55°，套管内径为0.8mm，壁厚为0.4mm，长度为80mm；

4)常压等离子体处理:所用气体为氦气，气体温度为100℃，流量为10L/min，处理时长为6min；

5)取胶原和去离子按照1：1的摩尔比例制成溶液，用该溶液将雪旺细胞、血管内皮细胞、上皮细胞分别制成悬液，调整悬液细胞浓度为1×10⁷cells/ml，制成生物墨水；

6)将两种生物墨水分别装入打印墨盒，在2℃工作环境下，以80um直径的3个喷嘴进行打印，喷嘴到生物支架表面的距离为7mm；

7)在内部管状支架的外表面打印含有雪旺细胞的生物墨水，在外层管状支架的外表面先打印含有血管内皮细胞的生物墨水再打印含有上皮细胞的生物墨水；

8)将外层管状支架套入自转轴，自转轴以4°/s的角速度转动，喷嘴以25um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为80mm，摆动3个来回；

9)将内部管状支架套入自转轴，自转轴以4°/s的角速度转动，喷嘴以25um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为80mm，摆动2个来回，更换生物墨水和喷嘴后，自转轴再以6°/s的角速度转动，喷嘴以20um/s的速度自支架的一端向另一端横向来回摆动，摆动距离为80mm，摆动2个来回；

10)神经导管的组装：将7根内部编织小管装入1根外层管状编织套管内，并在两端丙烯酸酯粘合固定，6℃干燥6h。

实施例1-2的多细胞3D打印导管性能测试如下：

实施例1所制备的多细胞3D打印导管与普通导管、自体神经修复大鼠神经缺损6周后，再生神经的功能恢复比较如图1所示。用大鼠足印对比法来计算坐骨神经指数(SFI)并进行比较。实施例1所制备的多细胞3D打印导管组与普通导管组、自体组之间均有显著差异(P<0.05)，但多细胞3D打印导管组SFI值要远高于普通材料组(P<0.01)。

实施例2所制备的多细胞3D打印导管与普通导管、自体神经修复大鼠神经缺损6周后，再生神经的功能恢复比较如图2所示。用大鼠足印对比法来计算坐骨神经指数(SFI)并进行比较。实施例2所制备的多细胞3D打印导管组与普通导管组、自体组之间均有显著差异(P<0.05)，但多细胞3D打印导管组SFI值要远高于普通材料组(P<0.01)。