具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制作方法

本发明涉及一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物及制备方法，属于医药保健品技术应用领域。

背景技术：

肝癌是一类常见的癌症，有极高的发病率和致死率。手术治疗法和放化疗法是目前治疗肝癌的主要手段。然而手术治疗预后差，易复发；化学药物因其对正常细胞的杀伤作用会带来较大的毒副作用，给病人带来极大的痛苦。因此，科学家们努力从天然产物中寻找更加高效低毒的抗癌剂。研究表明，抗氧化水平和免疫水平的提高是肿瘤治疗的两类关键手段。自由基会攻击体内器官或组织进而导致癌症的发生，长期的免疫力低下也是癌症产生的重要原因之一，因此寻找同时拥有抗氧化和提高免疫力水平作用的抗癌药物是非常必要的。

茶多酚又名茶鞣质，是茶叶中所含的一类多羟基酚类化合物的总称，包括儿茶素、黄酮醇、茶黄素、茶褐素等成分，其中儿茶素类占多酚总量的65％～80％。研究表明，儿茶素具有增加血液的抗氧化活性、清除机体自由基等药理作用。茶多酚强大的抗氧化活性可作为治疗癌症的潜在药物。然而，茶多酚的水溶性低、易经上消化道和肝脏迅速分解代谢并通过泌尿系统快速排泄，这使得茶多酚的生物活性得不到最大的发挥。另外，尽管茶多酚有一定的抗癌活性，但由于其小分子的特性，会不加选择地穿透所有类型的细胞，从而带来一定的毒副作用。

茶多糖在癌症治疗中发挥强大的免疫调节功能，但是单独、短期用药疗效不显著。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有增效减毒抗肝癌的茶多酚茶多糖组合物。

本发明的第二个目的是提供一种具有增效减毒抗肝癌的茶多酚茶多糖组合物的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物，重量包括：0.5～2份的茶多酚，1份的茶多糖，所述茶多酚的纯度大于90％；所述茶多糖分子量为80-100kDa。

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)茶多酚的制备：取茶叶，粉碎，加入10～20质量倍的体积浓度为75％～99.7％的乙醇水溶液；静置24～72h，减压抽滤，得到滤液和茶渣；滤液用1～3倍的乙酸乙酯萃取3～7次，静置分层，合并上层，合并液减压浓缩至干，得到茶粗多酚；将茶粗多酚加乙醇溶解，加于已处理好的大孔吸附树脂柱上，树脂柱径高比为1:10～15，先用水洗脱，至洗脱液无色，然后以3～5个柱装体积的质量浓度为0.2％～0.4％的NaOH水溶液洗脱除去色素，最后用10～12个柱装体积的体积浓度为50％～90％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得纯度大于90％的茶多酚；

(2)茶多糖的制备：将步骤(1)所述茶渣，加入10～20质量倍的去离子水，70～90℃热浸提2～3次，抽滤，得浸提液，浸提液浓缩至浸提液体积的10％-20％得浓缩液，加浓缩液2.5～4体积倍的体积浓度为95～99.7％的乙醇水溶液，静置12～24h，在3000～5000rpm，离心3～10min，将沉淀物溶于水并依次经分子量为100kDa和80kDa的中空纤维素膜超滤得到分子量80kDa-100kDa的组分，浓缩干燥，得茶多糖；

(3)将所述茶多酚和所述茶多糖按质量比为0.5～2:1的比例混合均匀，得具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物。

大孔吸附树脂的型号优选为：AB-8、D-101、DM-130、HPD-100或H103。

含有上述组合物的药物制剂，将具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物与药学上可接受的辅料制成。

本发明的优点：

(1)将茶多糖作为低毒性的药物载体和功能材料，与茶多酚结合，不仅增强了茶多酚的靶向性、降低毒性、提高茶多酚在体液中的溶解性，提高了茶多酚的生物利用度，在充分发挥茶多酚的抗氧化活性、清除体内自由基的同时又联合了茶多糖免疫作用，二者协同，从而达到显著的抗肝癌效果。

(2)茶多酚和茶多糖组合用药后毒副作用降低，不良反应减少，改善了荷瘤小鼠的生存质量。

(3)茶多酚茶多糖来源于同一种原料，综合提取两种成分组合用药，大大提高了原料的利用率，所采用的溶剂无污染且可以循环使用。另外，采用超滤技术获得分子量80-100kDa的茶多糖，克服了柱层析操作的复杂，不利于工业大生产等缺点，具有效率高、成本低、生产周期短、条件温和等特点，为活性化合物的工业化应用提供新方法。

附图说明

图1为实施例1组合物用药后各组荷瘤小鼠肿瘤体积随观察天数的变化曲线；

图2为实施例1组合物用药后各组荷瘤小鼠的肿瘤照片；

图3为实施例1组合物用药后各组荷瘤小鼠的水食效率；

图4为实施例1组合物用药后各组荷瘤小鼠的肿瘤病理切片图。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。

大孔吸附树脂的处理，采用常规方法，即用体积浓度为95％的乙醇水溶液浸泡后，再经酸、碱处理，最后水洗至中性后使用。

实施例1

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)茶多酚的制备：取茶叶，粉碎，加入15质量倍的体积浓度为80％的乙醇水溶液；静置48h，减压抽滤，得到滤液和茶渣；滤液用3倍的乙酸乙酯萃取5次，静置分层，合并上层，合并液减压浓缩至干，得到茶粗多酚；将茶粗多酚加乙醇溶解，加于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱上，树脂柱径高比为1:12，先用水洗脱，至洗脱液无色，然后以4个柱装体积的质量浓度为0.25％的NaOH水溶液洗脱除去色素，最后用11个柱装体积的体积浓度为75％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得纯度为94.87％的茶多酚；

(2)茶多糖的制备：将步骤(1)所述茶渣，加入17质量倍的去离子水，80℃热浸提2次，抽滤，得浸提液，浸提液浓缩至浸提液体积的15％得浓缩液，加浓缩液3体积倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液，静置24h，在4000rpm，离心6min，将沉淀物溶于水并依次经分子量为100kDa和80kDa的中空纤维素膜超滤得到分子量80kDa-100kDa的组分，浓缩干燥，得茶多糖；

(3)将所述茶多酚和所述茶多糖按质量比为1:1的比例混合均匀，得具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物。

实施例2

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)茶多酚的制备：取茶叶，粉碎，加入10质量倍的体积浓度为75％的乙醇水溶液；静置72h，减压抽滤，得到滤液和茶渣；滤液用1倍的乙酸乙酯萃取7次，静置分层，合并上层，合并液减压浓缩至干，得到茶粗多酚；将茶粗多酚加乙醇溶解，加于已处理好的D-101型大孔吸附树脂柱上，树脂柱径高比为1:10，先用水洗脱，至洗脱液无色，然后以3个柱装体积的质量浓度为0.2％的NaOH水溶液洗脱除去色素，最后用10个柱装体积的体积浓度为50％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得纯度为93.63％的茶多酚；

(2)茶多糖的制备：将步骤(1)所述茶渣，加入10质量倍的去离子水，70℃热浸提2次，抽滤，得浸提液，浸提液浓缩至浸提液体积的18％得浓缩液，加浓缩液2.5体积倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液，静置24h，在3000rpm，离心3min，将沉淀物溶于水并依次经分子量为100kDa和80kDa的中空纤维素膜超滤得到分子量80kDa-100kDa的组分，浓缩干燥，得茶多糖；

(3)将所述茶多酚和所述茶多糖按质量比为0.5:1的比例混合均匀，得具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物。

实施例3

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)茶多酚的制备：取茶叶，粉碎，加入20质量倍的体积浓度为99.7％的乙醇水溶液；静置24h，减压抽滤，得到滤液和茶渣；滤液用3倍的乙酸乙酯萃取3次，静置分层，合并上层，合并液减压浓缩至干，得到茶粗多酚；将茶粗多酚加乙醇溶解，加于已处理好的DM-130型大孔吸附树脂柱上，树脂柱径高比为1:15，先用水洗脱，至洗脱液无色，然后以5个柱装体积的质量浓度为0.4％的NaOH水溶液洗脱除去色素，最后用12个柱装体积的体积浓度为90％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得纯度为94.07％的茶多酚；

(2)茶多糖的制备：将步骤(1)所述茶渣，加入20质量倍的去离子水，90℃热浸提3次，抽滤，得浸提液，浸提液浓缩至浸提液体积的20％得浓缩液，加浓缩液4体积倍的体积浓度为99.7％的乙醇水溶液，静置12h，在5000rpm，离心10min，将沉淀物溶于水并依次经分子量为100kDa和80kDa的中空纤维素膜超滤得到分子量80kDa-100kDa的组分，浓缩干燥，得茶多糖；

(3)将所述茶多酚和所述茶多糖按质量比为1.5:1的比例混合均匀，得具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物。

实施例4

一种具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)茶多酚的制备：取茶叶，粉碎，加入17质量倍的体积浓度为85％的乙醇水溶液；静置48h，减压抽滤，得到滤液和茶渣；滤液用2倍的乙酸乙酯萃取5次，静置分层，合并上层，合并液减压浓缩至干，得到茶粗多酚；将茶粗多酚加乙醇溶解，加于已处理好的HPD-100型大孔吸附树脂柱上，树脂柱径高比为1:13，先用水洗脱，至洗脱液无色，然后以4个柱装体积的质量浓度为0.3％的NaOH水溶液洗脱除去色素，最后用10个柱装体积的体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得纯度为92.18％的茶多酚；

用型号为H103的大孔吸附树脂替代本实施例的HPD-100型大孔吸附树脂，其它同本实施例，制备的茶多酚的纯度与本实施例相似。

(2)茶多糖的制备：将步骤(1)所述茶渣，加入17质量倍的去离子水，85℃热浸提3次，抽滤，得浸提液，浸提液浓缩至浸提液体积的10％得浓缩液，加浓缩液3体积倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液，静置24h，在3500rpm，离心8min，将沉淀物溶于水并依次经分子量为100kDa和80kDa的中空纤维素膜超滤得到分子量80kDa-100kDa的组分，浓缩干燥，得茶多糖；

(3)将所述茶多酚和所述茶多糖按质量比为2:1的比例混合均匀，得具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物。

实施例5

本发明组合物对肝癌细胞SMMC7721存活率的影响。

实验目的：

检测组合物对肝癌细胞SMMC7721存活率的影响。

实验材料：

1.受试物：茶多酚、茶多糖，实施例1～4获得的组合物，准确称量各受试物，用二甲基亚砜溶解，配成浓度为0.15mg/mL的贮存液，在-20℃下保存，使用时用二甲基亚砜稀释成浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12和0.15mg/mL的溶液。

2.试剂：DMEM培养基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS缓冲液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余试剂均为市售。

3.细胞株：人源性SMMC7721肝癌细胞：购自上海细胞库。

4.仪器：CO₂培养箱(BPN-80CW)：上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BDS-200)：重庆奥特光学仪器有限公司。酶标仪(DNM-9602)：北京普朗医疗设备有限公司。

实验方法及结果：

实验方法：

MTT法检测受试物对SMMC7721肝癌细胞抑制率的影响。

细胞于含胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的培养基中，37℃，5％CO₂的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板，细胞密度为6000～8000个/孔。37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后加入不同浓度的茶多酚茶多糖组合物，37℃，5％CO₂培养箱中孵育72h。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL的MTT 100μL、37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为490nm。

细胞抑制率(％)＝【1-(受试组OD值/对照组OD值)】×100％

为确定茶多酚茶多糖组合物的抗肝癌效果是协同作用还是叠加作用，采用Chou-Talady中的中效原理计算联合指数(CI)。CI＝D1/DX1+D2/DX2。D1和D2是药物1和药物2联合作用抑制率为50％时的作用浓度。DX1和DX2是药物1和药物2单独应用抑制率为50％时的作用浓度。根据Chou-Talady的理论，如果CI＝1，药物联合作用效果有叠加效应；CI<1，药物联合作用效果有协同效应；CI>1，药物联合作用效果有协同效应。

实验结果：

表1.本发明得到的受试物对SMMC7721肝癌细胞抑制率的IC₅₀值。

实验结果表明按实施例制备获得的茶多酚茶多糖组合物对肝癌细胞的生长具有良好的抑制作用。联合指数远远小于1，说明组合物具有协同抗肝癌的疗效。

实施例6

本发明组合物对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制作用。

实验目的：

检测组合物对小鼠移植性肿瘤生长的影响。

实验材料：

1.受试物：实施例1获得的组合物。准确称量组合物，用生理盐水溶解，配成浓度为15mg/mL的贮存液，在-20℃下保存，使用时用生理盐水将组合物稀释成3，6和12mg/mL的低中高三个剂量的溶液；环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司(批号15101225)；0.9％氯化钠注射液(生理盐水)：河北天成药业股份有限公司(批号A15100801)；

2.试剂：DMEM培养基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS缓冲液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余试剂均为市售。

3.动物及瘤株：雄性昆明种小鼠，体重20±2g，共40只，动物合格证SCXK(京)2014-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。鼠源性H22肉瘤细胞：购自上海细胞库。

4.仪器：CO₂培养箱(BPN-80CW)：上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD)：苏州净化设备有限公司；倒置显微镜(BDS-200)：重庆奥特光学仪器有限公司。紫外分光光度计(UV-9200)：北京瑞利分析仪器厂。酶标仪(DNM-9602)：北京普朗医疗设备有限公司。

实验方法及结果：

1.受试物对H22实体瘤的抑制作用

取冻存的H22小鼠肝癌细胞，置于37℃恒温水浴中解冻，离心，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤两次，再用PBS液重悬细胞，经ICR小鼠腹腔传3代以上，腹水长出后，在无菌条件下抽取瘤液，瘤液与生理盐水按体积比1:1的比例稀释并充分混合得到细胞悬液。用台盼兰染色后，在血细胞计数器上计数，其中活细胞数大于95％，用生理盐水调整细胞悬液的浓度为1×10⁷个瘤细胞/mL。然后将调整好浓度的细胞悬液按0.2mL/只接种于小鼠右前肢腋窝皮下，构建实体瘤动物模型，得到H22荷瘤小鼠。

接种后次日随机分组，每组8只，受试物组(低中高三个剂量)，模型组(生理盐水)和阳性对照药组(25mg/kg)。小鼠灌胃给药，每天一次，剂量0.01mL/g(给药体积/小鼠体重)连续给药给药14天，给药期间，每隔2到3天用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a、最小直径b，按V＝1/2×a×b²计算瘤体积，绘制小鼠肿瘤生长曲线。实验结果见表2、图1；于第15天称取各小鼠的体重，摘除眼球取血，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤、脾脏、胸腺并称重，按以下各式计算肿瘤抑制率、脾脏指数及胸腺指数。肿瘤拍照。实验结果见表3-4，肿瘤照片见图2。

肿瘤抑制率(％)＝(1－给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％

脾脏指数(mg/g)＝脾脏重量/体重

胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量/体重

表2实验各组小鼠给药期间肿瘤体积

实施例1各组小鼠给药期间肿瘤体积如表2所示，图1是实施例1各组小鼠的瘤体积随观察天数的变化曲线，结果表明，本发明的组合物能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长有阻碍作用。

实验证明，实施例2、3、4的组合物能减缓小鼠移植性肿瘤的生长速度，对肿瘤的生长有阻碍作用。

表3.实验各组小鼠的瘤重及肿瘤的抑制率

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表3所示的实验数据可知，与模型组相比，实施例1的组合物对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用(P<0.001)，且具有浓度依赖性，随着用药剂量的增加，抑瘤作用增强；中、高剂量组的抑瘤效果接近于阳性对照药，无显著性差异，P>0.05。

实验证明，实施例2、3、4的组合物对小鼠H22实体瘤有明显的抑制作用。

表4.实验各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表4的实验结果可知，实施例1的组合物的中、高剂量的组合物可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。

实验证明，实施例2、3、4的组合物的中、高剂量可以显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，提高了小鼠的固有免疫力。

本发明药物对荷瘤小鼠生存质量的影响

实验方法及结果：

每日测定小鼠的体重，摄食量及摄水量。计算小鼠的水食效率。摄食效率＝(增长的体重/摄食量)×100％；摄水效率＝(增长的体重/摄水量)×100％。实验结果见图3。

由图3可知，与阳性对照药相比，实施例1的组合物可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率(P<0.001)，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。

实验证明，实施例2、3、4的组合物可以显著提高荷瘤小鼠的水食效率，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存质量。

本发明药物对荷瘤小鼠肝脏中相关酶的影响

实验方法及结果：

测肝组织匀浆中过氧化氢(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活力及丙二醛(MDA)的含量。测定试剂盒购买于南京建成生物工程研究所(货号依次为：A007-1；A005；A001-3；C009-2；C010-2；A003-1)。各组小鼠肝脏中相关酶的含量如表5所示。

表5 实验各组小鼠肝脏中相关酶的含量

注：^aP<0.05，^bP<0.01，^cP<0.001vs模型组

由表5的结果可知，本发明实施例1的组合物可以提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，且有浓度依赖性。另外，实施例1的组合物可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。

实验证明，实施例2、3、4的组合物提高肝脏中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝脏MDA的水平，且有浓度依赖性。可以显著降低肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，降低肝毒性，减少肝脏炎症的产生。与模型组相比，阳性药组小鼠肝脏中转氨酶升高，这表明化疗药环磷酰胺对肝脏有较大的毒性。

本发明的组合物对荷瘤小鼠血清中免疫因子含量的影响

实验方法及结果：

各组小鼠停药后次日采用眼球摘除法取血，静置后离心分离血清，E L I S A法检测荷瘤小鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IF-2)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量，结果见表6。

表6.实验各组小鼠血清中血管内皮生长因子、白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型组；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs阳性对照药组

由表6可知，实施例1的组合物可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。

实验证明，实施例2、3、4的组合物可以降低肿瘤血管内皮生长因子的表达，提高白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达，提高机体免疫力。

实施例1荷瘤小鼠的肿瘤病理切片见图4(A-E分别代表：模型组、阳性对照药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)

给药组肿瘤细胞生长不如模型组活跃，部分紧密排列，部分较松散，高剂量组表现出多发灶性及大片状肿瘤组织坏死，可见较大部分凝固性坏死，肿瘤周边可见血管、纤维组织增生；少量炎细胞浸润。