一种用于治疗小鹅瘟的生物制品及其制备方法与流程

本发明涉及生物制品技术领域，进一步涉复合型生物制品在抗病毒方面的治疗，具体涉及一种用于治疗小鹅瘟的生物制品及其制备方法。

背景技术：

小鹅瘟(Gosling Plague，GP)又称为鹅细小病毒感染(Goose Parvovirus Infection)，是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雏鹅急性或亚急性败血性传染病。本病主要侵害4～20天的雏鹅和雏番鸭，以急性肠炎及肝、肾、心脏实质脏器病变为主要特征，具有传播快、发病率和致死率高的特点。该病是危害养鹅业最严重的传染病之一，每年都有不同程度的流行，造成相当大的经济损失，严重危害着集约化养鹅业的持续、稳定、健康发展。

目前应用于小鹅瘟的抗感染药品主要包括抗生素、化学合成药品、中药制剂、弱毒活疫苗及卵黄抗体等抗病毒感染生物制剂。对于小鹅瘟病都有一定的疗效，但也有一定的弊端。例如，抗生素容易发生药物残留及沉积，可以通过动物性食物进入人体，导致耐药性增强，抗生素类药物不能更好的发挥作用，引起人类疾病；化学合成药品毒副作用大，不利于动物的身体健康；中药制剂药效慢、用量大、质量不易稳定，使用起来不方便；卵黄抗体对于混合感染和继发感染的治疗作用较弱；活疫苗存在着毒力返强的可能，有潜在的传染性和致病性，且疫苗存在与母源抗体相互作用的问题，接种时间及方式等都可能影响最终的免疫效果。抗原抗体复合物是指由特异性高免血清或抗体按恰当的比例与相应抗原混合而成。这类复合物兼有预防及治疗的双重作用。这种复合物不但能抵抗病原微生物引起的持续性感染，避免抗生素及中药制剂的弊端，而且还可以突破母源抗体干扰，并可减少活疫苗引起的强烈应激反应，还可以与其他疫苗联合使用，做到多病共治。有文献报道，抗原抗体复合物制成的疫苗还可以接种于较大日龄的禽类胚中进行疾病预防，可诱导胚体产生较高水平抗体，同时对出雏率及胚体的生长发育没有影响，对不同高低抗体水平母源抗体的鸡胚免疫经攻毒试验也证明复合物疫苗非常有效。这给今后的禽类疫病防治提供了新的方法，这种方法相较于传统常规疫苗，对鸡的副反应更小，可提高免疫的安全性。

针对抗原抗体复合物的作用机理尚不明确，有研究推测抗原抗体复合物可同时激发机体的细胞免疫和体液免疫，而细胞免疫在攻毒保护时起着重要作用。一般认为：①抗原抗体复合物的作用机制与复合物可直接与滤泡树突状细胞结合的能力有关。Jeurissen调查了IBD复合物疫苗中IBDV在不同靶器官中的感染情况，结果表明：免疫复合物进入机体后能与树突状细胞结合并长时间滞留在细胞表面，树突状细胞不能內质化复合物，因而复合物中的病毒也得到保护，可以免受淋巴细胞的攻击。②由于复合物中抗体分子的Fc片段与抗原递呈细胞的Fc受体有很高的亲和性，因而使复合物中病毒更有效的与抗原递呈细胞相结合，复合物被吞噬和內质化后病毒不会被杀灭，最后激活B淋巴细胞和T淋巴细胞，刺激B淋巴细胞成为抗体分泌细胞，从而引起强烈的体液免疫反应和细胞免疫应答。虽然抗原抗体复合物的作用机理未有确切答案，但多项研究结果都显示，抗原抗体以适当的比例结合为抗原抗体复合物后，能突破母源抗体的干扰，对免疫鸡能提供很好的保护，免疫效果比常规疫苗更好。目前此项技术已成功用于鸡传染性法氏囊病、新城疫及呼肠病毒病疫苗的研制，并取得了很好的效果。

VP3蛋白是小鹅瘟病毒的主要结构蛋白，约占总蛋白的80％。VP3蛋白是小鹅瘟病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体，利用GPV的VP3基因构建基因疫苗免疫雏鹅，可以诱导机体产生良好的细胞免疫应答，VP3基因具有较高的遗传稳定性，国内外的鹅细小病毒VP3基因也具有较高相似性，这可能是目前小鹅瘟只有一种血清型的分子基础，为基因工程苗的研制提供了可行性。目前，常规疫苗主要使用的都是全病毒进行试验，存在散毒的危险。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于治疗小鹅瘟的生物制品及其制备方法，以解决现有技术的小鹅瘟治疗药物疗效较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的小鹅瘟治疗药物安全性较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于治疗小鹅瘟的生物制品，所述生物制品中含有小鹅瘟病毒V3蛋白和小鹅瘟病毒卵黄抗体。

作为优选，所述生物制品中琼扩效价为1:32的小鹅瘟病毒VP3蛋白与琼扩效价为1:32的小鹅瘟病毒卵黄抗体体积比为1:1。

作为优选，所述生物制品的剂型为液体制剂、油水混合制剂或冻干固体制剂。

作为优选，所述液体制剂是通过以下方法制备的：取配方量的小鹅瘟病毒VP3蛋白及小鹅瘟病毒卵黄抗体加入至PBS缓冲液中，而后无菌过滤。

作为优选，所述油水混合制剂是通过以下方法制备的：将含配方量小鹅瘟病毒VP3蛋白和小鹅瘟病毒卵黄抗体的水相与油相佐剂缓慢混合乳化。

作为优选，所述冻干固体制剂是通过以下方法制备的：取配方量的小鹅瘟病毒VP3蛋白、小鹅瘟病毒卵黄抗体混合液体加入冻干保护剂，而后冷冻干燥。

一种上述生物制品的制备方法：包括以下步骤：

1)制备小鹅瘟病毒VP3蛋白抗原溶液。

2)利用小鹅瘟病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，制备高免卵黄抗体。

3)将步骤1)所得的小鹅瘟病毒VP3蛋白抗原溶液与步骤2)所得的小鹅瘟病毒卵黄抗体混合。

作为优选，还包括步骤4)：向步骤3)所得的混合物中加入佐剂。

作为优选，步骤1)具体包括以下操作：利用GenBank中的小鹅瘟病毒毒株VP3蛋白表达基因共保守区域，设计上下游引物，利用小鹅瘟病毒总RNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR，将扩增产物克隆至表达载体后进行VP3蛋白的表达，表达产物经纯化检测后即得VP3蛋白抗原溶液。

作为优选，步骤2)具体包括以下操作：用小鹅瘟病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，每两次免疫之间间隔14-21天，三免后14天收集高免鸡蛋，并进行琼扩双向扩散试验检测，琼扩效价≥1：64的高免蛋加辛酸等进行卵黄抗体提取，提取后除菌浓缩即得到所述高免卵黄抗体。

本发明提供了一种用于治疗小鹅瘟的生物制品及其制备方法，该技术方案基于抗原抗体复合物对病毒的良好防治效果而设计，并针对小鹅瘟病毒的自身特性确定以VP3蛋白为抗原、以卵黄抗体为抗体的组合方案，在此基础上进一步设计了二者的具体制备方法。该技术方案在原有小鹅瘟卵黄抗体的基础上，加入小鹅瘟VP3蛋白抗原，制成复合物。这种小鹅瘟抗原抗体复合物可以抵抗病原微生物引起的持续性感染，避免抗生素的过量使用，突破母源抗体的干扰，减少活疫苗引起的强烈应激反应，由于使用的抗原不是完整的病毒抗原，而是小鹅瘟的VP3蛋白制成的抗原，可以减少全毒向外散毒的危险，更加安全可靠有效。本发明所获得的抗原抗体复合物具有安全性好，免疫效果佳，免疫作用产生快，保护率高的特点。

附图说明

图1是本发明实施例6中不同实验组实验动物的血清抗体水平比较。

图2是本发明实施例7中不同实验组实验动物发病率、死亡率、保护率比较。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1(小鹅瘟卵黄抗体IgY制备)

(1)高免蛋的制备：利用小鹅瘟灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，免疫剂量为1ml/只，免疫间隔为14天，三次免疫后收集鸡蛋进行卵黄抗体效价检测，琼扩效价高于1:64可进行鸡蛋收集。

(2)卵黄抗体IgY的提取制备：将高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，晾干备用；采取机械打蛋，分离并收集卵黄；用胶体磨乳化后，1:4加入醋酸盐缓冲液(pH5.2)，搅拌60min，用板框过滤器过滤；过滤清液加入2％的辛酸，剧烈搅拌60min，板框过滤；过滤清液用0.22μm微孔过滤除菌即得。

实施例2(小鹅瘟VP3蛋白抗原制备)

利用基因克隆技术，将小鹅瘟VP3基因克隆到原核表达载体上，转染到原核表达宿主体内，诱导表达。后用亲和层析技术纯化从而获得VP3蛋白。具体的操作方法为：利用GenBank中小鹅瘟病毒经典毒株的VP3共保守片段，使用软件Premier 5.0设计VP3基因上下游引物并合成；取感染小鹅瘟病强毒的雏鹅肝脏组织，研磨匀浆后利用常规RNA提取技术提取总RNA并反转录为cDNA；以cDNA为模板，利用VP3基因上下游引物对VP3基因进行扩增及回收；回收产物及所使用的表达载体使用同种限制性内切酶进行酶切后连接，并将连接产物转化至表达载体；筛选阳性克隆进行培养、诱导后回收表达菌体；将菌体进行超声破碎，进行亲和层析后可获得。

实施例3(小鹅瘟VP3蛋白抗原及小鹅瘟卵黄抗体的效价测定)

利用琼脂扩散试验队小鹅瘟VP3蛋白抗原及小鹅瘟卵黄抗体进行效价测定。具体操作如下：制备还有8％NaCl及1％琼脂糖的琼脂平板；使用梅花孔在琼脂平板上打孔；

(1)检测VP3蛋白抗原效价：将VP3蛋白抗原倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入小鹅瘟标准阳性血清，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为VP3蛋白的抗原效价。

(2)检测卵黄抗体效价：将卵黄抗体倍比稀释后分别注入梅花孔外周孔，中心孔加入小鹅瘟标准琼扩抗原，加样量以加满不溢出为度。将琼脂板放入湿盒，37℃作用24h～48h，中心孔与外周孔出现沉淀线的最大稀释倍数为小鹅瘟卵黄抗体的效价。

实施例4(制备小鹅瘟卵黄抗体与小鹅瘟VP3蛋白抗原结合比例不同的三种抗原抗体复合物)

(1)配制小鹅瘟病毒VP3蛋白抗原效价为1:16；1:128；1:32三种浓度

(2)配制小鹅瘟卵黄抗体效价为1:128；1:16；1:32三种浓度

(3)将上述(1)(2)两种物质按所给出顺序等体积混合

(4)混合产物做无菌处理后可得复合物一、复合物二、复合物三

实施例5(制备油水混合制剂型抗原抗体复合物)

将处方量的抗原抗体复合物加入油佐剂中进行乳化，即可得到抗原抗体复合物的油水混合制剂型。

实施例6(对鹅进行免疫试验)

取1日龄易感雏鹅60羽，随机分为6组，适应饲养一天后进行如下操作：

第一组：设为空白对照组，每羽肌注0.2ml生理盐水；

第二组：设为复合物一组，每羽肌注0.2ml复合物一；

第三组：设为复合物二组，每羽肌注0.2ml复合物二；

第四组：设为复合物三组，每羽肌注0.2ml复合物三；

第五组：设为常规小鹅瘟疫苗组，每羽肌注处方剂量的常规小鹅瘟灭活疫苗；

第六组：设为VP3疫苗组，每羽肌注0.2ml琼扩效价为AGP＝1：32的VP3蛋白疫苗。

上述免疫之后14天进行一次加强免疫，每隔一周进行鸡只采血，检测血清中抗体水平(见图1)，注射抗原抗体复合物的鸡只，产生免疫应答的时间都要短于常规疫苗和VP3疫苗组，抗原抗体复合物三的是各组中血清抗体效价上升最快的，能够产生抗体的水平也是各组中最高的；抗原抗体复合物一和复合物二与常规疫苗组在抗体效价达到稳定时，效价水平没有明显差异。

实施例7(攻毒试验)

取4日龄SPF鸡60羽，随机分3组，适应饲养一日后，分别进行如下操作：

第一组：设为空白对照组，每羽肌注1ml生理盐水；

第二组：设为常规疫苗组，每羽肌注处方量的常规小鹅瘟灭活疫苗；

第三组：设为抗原抗体复合物组，每羽肌注1ml抗原抗体复合物三。

各组免疫7天后，利用小鹅瘟强毒SD-36株(200ELD50)进行点眼，14天后各组按原有剂量加强免疫1次。统计各组中小鹅瘟发病率、死亡率及保护率，实验结果如图2所示。结果表明：空白对照组鸡只死亡率为100％，抗原抗体复合物组死亡率最低，保护率可达到95％。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。