本发明涉及中药，具体涉及中药提取物，尤其涉及假马齿苋总皂苷提取物的分离纯化方法及其在制备神经系统药物中的应用。
背景技术：
假马齿苋是玄参科植物假马齿苋bacopamonnieri(l.)wettst的全草，又名白花猪母菜。具有清热凉血，解毒消肿之功效。临床上还可用于治疗支气管炎、气喘等呼吸系统疾病。该植物在印度阿育吠陀医药体系(ayurvedicsystemofmedicine)中还被认为具有增强智力和改善记忆，延缓衰老、预防痴呆，镇静、催眠，抗抑郁之功效。其标准提取物制成的制剂已在印度上市，作为治疗记忆损伤和老年痴呆的辅助药物。假马齿苋中主要含有三萜皂苷类成分，假马齿苋皂苷提取物中五个主要的皂苷成分(达玛烷型三萜皂苷化合物bacopasidei(bm28)，bacosidea3(bm37)，bacopasideii(bm29)，bacopasaponincisomer(bm35i)及bacopasaponinc(bm35)，五个皂苷成分结构式如下：
神经系统药物包括抗老年痴呆症的药物和抗忧郁药物等。
痴呆是一种获得性、持续性的智能障碍综合症，是由于多种神经系统变性或缺血过程而引起的，表现为多种大脑高级功能紊乱。痴呆是老年人的常见病，随着年龄增长发病率逐渐增加。研究表明，60岁痴呆的发病率为7.0％，70岁为4.1％，80岁为13.0％，90岁为32.2％。临床上常见有阿尔茨海默病、血管性痴呆和混合性痴呆三种。各种痴呆和记忆力受损患者尤其是阿尔兹海默症(alzheimer’sdisease，ad)和血管性痴呆(vasculardementia，vd)患者是认知减退最为常见的疾病。当前阿尔茨海默病(ad)是痴呆的主要类型，并且是导致老年人死亡的第四大原因。随着社会老龄化，vd发病率和病死率逐年上升，在世界范围内已成为继心脏病、癌症之后的威胁人类的疾病。另一方面。随着各种社会应激因素生活节奏加快以及压力增大的影响，抑郁症呈现逐年上升的趋势。西方发达国家中终身抑郁症的发病率在6％～8％之间，随着逐步的人口老龄化，在60岁以上人群中抑郁症的发病率将高达20％～50％；且在现代高强度、快节奏生活工作方式下，在年轻人中越来越集中爆发抑郁患者。抑郁症正成为一个严重的全球性问题。目前已有众多神经系统疾病的治疗药物，包括化学药和一些复方中药，但是由于化学药的不良反应以及复方中药治疗的效果等原因，人们一直致力于寻找更好的治疗药物。因此研究来源于植物的有神经系统活性天然产物，以发现高效、低毒的药物是发现新药的有效途径。
近年来的药理研究证实假马齿苋皂苷提取物具有较强的神经药理活性，可用于进一步开发成抗抑郁和治疗老年痴呆症的药物。但因为这几种成分在药材中含量较低，还需进一步纯化以满足新药开发需求。大孔吸附树脂是一类新型非离子型高分子化合物，在中药有效成分的分离纯化方面应用日益广泛。采用大孔树脂纯化假马齿苋皂苷提取物，可以保留其有效成分，除去无效杂质，提高总皂苷纯度。但是假马齿苋到目前为止尚未开发成任何形式的药物。究其原因主要是对假马齿苋的基础研究不充分，不明确其药效物质基础，亦不清楚其作用途径，导致临床应用缺乏科学的理论指导，仅依赖于传统经验。因此，需要进一步研究假马齿苋提取物的有效成分，明确假马齿苋药效成份，改进其分离纯化方法，考察其在制备药物中的应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用大孔树脂分离纯化假马齿苋皂苷提取物，提高总皂苷含量和纯度的方法，开发假马齿苋总皂苷提取物在制备药物中的应用。
本发明提供了假马齿苋总皂苷提取物的分离纯化方法，该方法包括下列步骤：
(1)取假马齿苋药材置于提取罐中，每次加入10-15倍于药材重量的80％乙醇，提取2-3次，每次1-2h，合并提取液，减压浓缩(压力-0.6bar、60℃)至无醇味；
(2)提取液加入95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·ml-1的上样液；
(3)取预处理完毕的hp-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，取上样液(0.5kg药材/l树脂)，用浓盐酸调至ph值为2.0，以0.5bv·h-1流速上样至完全，依次用2bv的30％乙醇(ph2.0)、5bv的40％乙醇(ph2.0)除杂，流速2.5bv/h；然后用2bv15％乙醇冲洗除酸，流速2.5bv/h，再用5bv60％乙醇洗脱，流速2.5bv/；所述hp-20大孔树脂的预处理方法为用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗；
(4)收集洗脱液，减压蒸干(压力-0.6bar、60℃)得假马齿苋总皂苷提取物。
通过分离纯化后得到的假马齿苋总皂苷提取物中主要含有bacopasidei(bm28)，bacosidea3(bm37)，bacopasideii(bm29)，bacopasaponincisomer(bm35i)及bacopasaponincisomer五个三萜皂苷类化合物。总皂苷的纯度为51.19％-55.67％，总皂苷转移率为76.96％-78.29％。
本发明的另一目的是提供了假马齿苋总皂苷提取物在制备神经系统药物中的应用。
本发明所述神经系统药物包括治疗抑郁症药物和治疗痴呆症药物。
本发明提供了假马齿苋总皂苷提取物在制备治疗郁症药物中的应用。
本发明提供了假马齿苋总皂苷提取物在制备治疗痴呆症药物中的应用。
本发明所述制备治疗痴呆症药物包括制备治疗阿尔兹海默症(alzheimer’sdisease，ad)药物和血管性痴呆(vasculardementia，vd)药物。
本发明人采用小鼠fst和tst实验对从假马齿苋中分离鉴定到的50余种单体进行了单一剂量的抗抑郁活性筛选，结果表明，达玛烷型三萜皂苷化合物bacopasidei(bm28)，bacosidea3(bm37)，bacopasideii(bm29)，bacopasaponincisomer(bm35i)及bacopasaponinc均有抗抑郁活性，其中bacopasidei(bm28)具有最强的药效作用，因此，假马齿苋总皂苷提取物可用于制备治疗抑郁症药物。
本发明人从假马齿苋药材中分离鉴定到40余种单体成分，并从中纯化得到具有较强神经保护活性的三萜皂苷类化合物bacopasidei(bm28)，bacosidea3(bm37)，bacopasideii(bm29)，bacopasaponincisomer(bm35i)及bacopasaponincisomer。前期药理研究结果表明bm28对谷氨酸(l-glutamate)和过氧化氢(h2o2)诱导的嗜铬细胞瘤细胞(pc12cells)和大鼠皮层神经元损伤具有显著的保护作用，且其保护作用具有剂量依赖性，显示了其潜在的抗老年痴呆活性，因此，假马齿苋总皂苷提取物可用于制备治疗阿尔兹海默症以及血管性痴呆的药物。
本发明所述药物为由假马齿苋总皂苷提取物为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
本发明所述药物组合物为口服制剂、注射剂或经皮肤给药制剂。
本发明提供的假马齿苋总皂苷提取物药物为临床提供了新的治疗忧郁症和痴呆症的药物，假马齿苋总皂苷提取物作为活性成分，药效好。本发明药物克服了化学药的毒付作用，有较大的临床应用前景。本发明提供的采用大孔树脂分离纯化假马齿苋总皂苷提取物的方法，操作简便，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
附图说明
图1实施例2的泄漏曲线
其中纵坐标代表上样液体积(ml)，横坐标代表渗漏总皂苷量(mg)，线代表渗漏趋势
图2实施例2不同ph原液梯度洗脱曲线
其中纵坐标代表总皂苷洗脱转移率(％)，横坐标代表不同乙醇浓度洗脱流份，线代表不同ph值(菱形ph＝7.0，正方形ph＝4.5，三角形ph＝2.0)总皂苷洗脱趋势
图3实施例2酸性上样原液稳定性考察。
其中纵坐标代表总皂苷含量(mg)，横坐标代表加酸后时间(h)，线代表加酸后总皂苷含量随时间变化趋势
图4实施例2除杂洗脱溶剂考察。
其中纵坐标代表洗脱转移率(％)，横坐标代表不同乙醇浓度洗脱流份，线代表不同乙醇浓度洗脱对杂质(三角形)和总皂苷(菱形)转移率的影响趋势
图5实施例2洗脱溶剂中总皂苷纯度。
其中纵坐标代表总皂苷纯度(％)，横坐标代表不同乙醇浓度洗脱流份，线代表不同乙醇浓度洗脱对总皂苷纯度的影响趋势
图6实施例3假马齿苋总皂苷提取物对小鼠游泳不动时间的影响(*p＜0.05)
其中纵坐标代表小鼠强迫游泳时间(秒)，横坐标代表模型组、总皂苷给药组、氟西汀(阳性药)给药组
图7实施例3假马齿苋总皂苷提取物对小鼠跳台实验的影响(*p＜0.05)
其中纵坐标代表小鼠跳台错误次数，横坐标代表正常组、模型组、总皂苷100mg/kg给药组、总皂苷100mg/kg给药组
图8实施例3bm28对谷氨酸(l-glutamate)诱导的大鼠皮层神经元和嗜铬细胞瘤细胞(pc12cells)损伤的保护作用
其中纵坐标代表wst-8转换率(％),横坐标代表不同化合物给药。
图9为图8中不同化合物用填充不一的柱状显示，具体对应关系见图示。
具体实施方式
实施例1
实施例1-1假马齿苋总皂苷含量检测方法
(一)仪器
agilent-1200型高效液相色谱仪(美国agilent公司)；ks5200h超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；bp211d型电子天平(德国sartorius)；milli-q50sp纯水系统(美国millipore公司)。
(二)试剂
乙腈(色谱纯，merck公司)；磷酸(色谱纯，tedia公司)；超纯水自制由milli-q纯水机(merkmillipore)制得；其它试剂均为分析纯。
(三)供试品及标准品
bacopasidei(纯度95％)，chromadex，购自深圳虹彩祥根生物科技有限公司)，bacosidea3，bacopasideii，bacopasaponincisomer及bacopasaponinc由实验室自制(纯度95％)，经ms、1h-nmr、13c-nmr测定，确定其化学结构，具体波谱数据如下：
bacosidea3
白色针晶，mp：250-252℃(ch3oh/h2o)，esi-msm/z：951[m+na]+；1h-nmr(py-d5)h-3(δh3.27，1h，dd，j＝4.0，12.0hz)，h-13(δh2.82，1h，m)，h-18(δh1.07，3h，s)，h-19(δh0.68，3h，s)，h-21(δh1.38，3h，s)，h-23(δh5.20，1h，m)，h-24(δh5.52，1h，d，j＝8.0hz)，h-26(δh1.69，3h，s)，h-27(δh1.67，3h，s)，h-28(δh1.28，3h，s)，h-29(δh1.06，3h，s)。13c-nmr(py-d5)δc：38.4(c-1)，26.4(c-2)，88.8(c-3)，39.4(c-4)，55.9(c-5)，18.0(c-6)，35.7(c-7)，37.2(c-8)，52.7(c-9)，36.9(c-10)，21.4(c-11)，28.2(c-12)，36.8(c-13)，53.4(c-14)，36.5(c-15)，110.2(c-16)，53.7(c-17)，18.5(c-18)，16.0(c-19)，68.2(c-20)，29.7(c-21)，45.1(c-22)，68.3(c-23)，126.8(c-24)，133.8(c-25)，25.2(c-26)，18.2(c-27)，27.5(c-28)，16.2(c-29)，65.5(c-30)；3-o-glu：104.8(c-1)，78.8(c-2)，88.4(c-3)，70.0(c-4)，77.6(c-5)，62.4(c-6)；ara(f)：109.6(c-1)，83.4(c-2)，77.4(c-3)，84.7(c-4)，61.8(c-5)；g1u：104.4(c-1)，75.1(c-2)，78.1(c-3)，71.3(c-4)，78.2(c-5)，62.1(c-6)。
bacopasideii
白色针晶，mp：249-251℃(ch3oh/h2o)，esi-msm/z：951[m+na]+；1h-nmr(py-d5)h-3(δh3.28，1h，dd，j＝4.0，11.0hz)，h-13(δh2.83，1h，m)，h-18(δh1.08，3h，s)，h-22(δh2.60，1h，d，j＝8.0hz)，h-23a(δh3.88，1h，dd，j＝2.0，10.0hz)，h-23b(δh4.72，1h，dd，j＝2.0，10.0hz)，h-24(δh5.85，1h，d，j＝11.0hz)，h-26(δh1.69，3h，s)，h-27(δh1.61，3h，s)，h-28(δh1.28，3h，s)，h-29(δh1.04，3h，s)。13c-nmr(py-d5)δc：38.1(c-1)，26.3(c-2)，88.8(c-3)，39.4(c-4)，55.8(c-5)，17.9(c-6)，35.7(c-7)，37.1(c-8)，52.6(c-9)，36.8(c-10)，21.3(c-11)，28.2(c-12)，36.7(c-13)，53.1(c-14)，36.6(c-15)，109.9(c-16)，50.9(c-17)，18.4(c-18)，15.9(c-19)，71.5(c-20)，26.8(c-21)，45.9(c-22)，65.7(c-23)，123.8(c-24)，132.5(c-25)，25.7(c-26)，18.1(c-27)，27.4(c-28)，16.2(c-29)，65.6(c-30)；3-o-glu：104.8(c-1)，78.7(c-2)，88.4(c-3)，70.0(c-4)，77.6(c-5)，62.4(c-6)；ara(f)：109.6(c-1)，83.4(c-2)，77.4(c-3)，84.6(c-4)，61.8(c-5)；glu：104.4(c-1)，75.1(c-2)，78.1(c-3)，71.3(c-4)，78.2(c-5)，62.0(c-6)。
bacopasaponincisomer
白色针晶，mp：250-252℃(ch3oh/h2o)，esi-msm/z：921[m+na]+；1h-nmr(py-d5)h-3(δh3.23，1h，dd，j＝4.0，12.0hz)，h-13(δh2.81，1h，m)，h-18(δh1.06，3h，s)，h-19(δh0.69，3h，s)，h-21(δh1.37，3h，s)，h-22a(δh1.65，1h，dd，j＝2.0，14.0hz)，h-22b(δh1.74，1h，dd，j＝2.0，14.0hz)，h-23(δh5.21，1h，m)，h-24(δh5.52，1h，d，j＝8.0hz)，h-26(δh1.68，3h，s)，h-27(δh1.66，3h，s)，h-28(δh1.27，3h，s)，h-29(δh1.05，3h，s)。13c-nmr(py-d5)δc：38.4(c-1)，26.4(c-2)，88.3(c-3)，39.5(c-4)，55.8(c-5)，17.9(c-6)，35.7(c-7)，37.2(c-8)，52.7(c-9)，36.9(c-10)，21.4(c-11)，28.2(c-12)，36.8(c-13)，53.4(c-14)，36.5(c-15)，110.2(c-16)，53.6(c-17)，18.5(c-18)，16.0(c-19)，68.1(c-20)，29.7(c-21)，45.1(c-22)，68.3(c-23)，126.8(c-24)，133.7(c-25)，25.2(c-26)，17.9(c-27)，27.4(c-28)，16.2(c-29)，65.5(c-30)；3-o-ara：105.3(c-1)，76.7(c-2)，83.2(c-3)，68.2(c-4)，65.4(c-5)；ara(f)：110.0(c-1)，83.5(c-2)，77.8(c-3)，84.6(c-4)，61.7(c-5)；glu：104.6(c-1)，74.9(c-2)，77.6(c-3)，71.2(c-4)，78.1(c-5)，62.2(c-6)。
bacopasaponinc
白色针晶，mp：222-223℃(ch3oh/h2o)，esi-msm/z：921[m+na]+；1h-nmr(py-d5)h-3(δh3.27，1h，dd，j＝4.0，12.0hz)，h-13(δh2.83，1h，m)，h-18(δh1.09，3h，s)，h-19(δh0.75，3h，s)，h-21(δh1.38，3h，s)，h-22(δh2.62，1h，d，j＝10.0hz)，h-23a(δh3.87，1h，dd，j＝2.0，11.0hz)，h-23b(δh4.69，1h，dd，j＝2.0，11.0hz)，h-24(δh5.84，1h，d，j＝10.0hz)，h-26(δh1.71，3h，s)，h-27(δh1.63，3h，s)，h-28(δh1.29，3h，s)，h-29(δh1.07，3h，s)，h-30a(δh4.29，1h，d，j＝7.0hz)，h-30b(δh4.16，1h，d，j＝7.0hz)。13c-nmr(py-d5)δc：38.5(c-1)，26.4(c-2)，88.3(c-3)，39.5(c-4)，56.0(c-5)，18.0(c-6)，35.8(c-7)，37.2(c-8)，52.8(c-9)，37.0(c-10)，21.4(c-11)，28.3(c-12)，36.8(c-13)，53.2(c-14)，36.6(c-15)，109.9(c-16)，51.0(c-17)，18.5(c-18)，16.0(c-19)，71.5(c-20)，26.8(c-21)，46.0(c-22)，65.8(c-23)，123.8(c-24)，132.5(c-25)，25.6(c-26)，18.1(c-27)，27.6(c-28)，16.2(c-29)，65.5(c-30)；3-o-ara：105.3(c-1)，76.6(c-2)，83.1(c-3)，68.1(c-4)，65.3(c-5)；ara(f)：110.1(c-1)，83.4(c-2)，77.8(c-3)，84.8(c-4)，61.9(c-5)；glu：104.6(c-1)，74.9(c-2)，77.8(c-3)，71.3(c-4)，78.1(c-5)，62.4(c-6)。
(四)溶液的配制
1、对照品溶液的制备
精密称取bacopasidei10.07mg，bacosidea310.51mg，bacopasideii10.46mg，bacopasaponincisomer10.47mg，bacopasaponinc10.43mg。用甲醇溶解，定容于25ml容量瓶，置于4℃冰箱内冷藏备用。
2、供试品溶液的制备
样品假马齿苋总皂苷提取物(自制品实施例1-2)直接研磨成细粉，取粉末10.0mg，精密称定，加入适量甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，摇匀，离心，上清液过0.22μm滤膜即得；
(五)hplc测定假马齿苋总皂苷提取物含量
采用agelapromsilc18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以32.5％乙腈/67.5％磷酸(naoh调ph＝3)为流动相，1ml/min流速，30℃柱温，205nm检测波长，洗脱45分钟同时实现五个皂苷成分的含量测定。
实施例1-2制备假马齿苋总皂苷提取物
取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(压力-0.6bar，60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·ml-1的上样液。取预处理(用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗)完毕的hp-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500ml。取上样液800ml(0.5kg药材/l树脂)，用浓盐酸调至ph值为2.0，以0.5bv·h-1流速上样至完全，依次用2bv的30％乙醇(ph2.0)、5bv的40％乙醇(ph2.0)除杂，流速2.5bv/h，采用2bv15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5bv/h，再用5bv60％乙醇洗脱，流速2.5bv/h，收集洗脱液，减压蒸干(压力-0.6bar，60℃)得假马齿苋总皂苷提取物141g，经hplc检测，总皂苷的纯度为55.67％，总皂苷转移率为78.29％。
通过供试品峰与标准品峰保留时间比对，认定五个三萜皂苷类化合物bacopasidei，bacosidea3，bacopasideii，bacopasaponincisomer及bacopasaponinc，并通过hplc-uv外标法对各个化合物进行定量。
实施例1-3制备假马齿苋总皂苷提取物
称取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入60kg的80％乙醇，提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩(减压，压力-0.6bar60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·ml-1的上样液。取预处理(同上处理)完毕的hp-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500ml。取上样液800ml，用浓盐酸调至ph值为2.0，以0.5bv·h-1流速上样至完全，依次用2bv的30％乙醇(ph2.0)、5bv的40％乙醇(ph2.0)除杂，流速2.5bv/h，采用2bv15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5bv/h，再用5bv60％乙醇洗脱，流速2.5bv/h，收集洗脱液，减压蒸干(压力-0.6bar60℃)得假马齿苋总皂苷提取物146g，经hplc检测，总皂苷的纯度为51.62％，总皂苷转移率为77.97％。
实施例1-4制备假马齿苋总皂苷提取物
称取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入75kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(减压，60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·ml-1的上样液。取预处理(同上处理)完毕的hp-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500ml。取上样液800ml，用浓盐酸调至ph值为2.0，以0.5bv·h-1流速上样至完全，依次用2bv的30％乙醇(ph2.0)、5bv的40％乙醇(ph2.0)除杂，流速2.5bv/h，采用2bv15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5bv/h，再用5bv60％乙醇洗脱，流速2.5bv/h，收集洗脱液，减压蒸干(60℃)得假马齿苋总皂苷提取物146g，经hplc检测，总皂苷的纯度为51.19％，总皂苷转移率为76.96％。
实施例2
假马齿苋皂苷提取物的分离纯化方法研究试验
1.仪器与试药
anglient1200液相色谱仪，带四元泵、als、tcc、vwd和chemstation工作站(美国安捷伦科技有限公司)，dxtqz-100型小型提取浓缩机组(南京仁宝制药设备有限公司)，r200型旋转蒸发器，dl-2010低温冷却液循环泵(上海申生科技有限公司)，lxj-iib高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，phs-3e型ph计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，zhwy-211b型恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)，xp205型分析天平(0.01mg，梅特勒-托利多仪器有限公司)；
bacopasidei对照品(纯度87％，上海迈瑞尔化学技术有限公司提供)；假马齿苋药材(福建漳州产，经第二军医大学药学院生药教研室张汉明教授鉴定为玄参科假马齿苋)；d101(净品型，天津海光化工有限公司)、ab-8、nka-9、h-20、hpd-300(均购自郑州勤实科技有限公司)、hp-20(三菱化学株式会社)型大孔树脂；乙腈(色谱纯，上海星可生化有限公司)，浓盐酸、磷酸(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
2.方法与结果
2.1假马齿苋总皂苷含量测定
2.1.1色谱条件
色谱柱：资生堂capce11-c18(5μm，4.6×250mm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸(naoh调节ph5.0)＝31.5：68.5；流速1ml·min-1，进样20μl，柱温30℃，检测波长205nm。
2.1.2对照品溶液的制备
精密称取bacopasidei对照品4.53mg，置10ml量瓶中，加甲醇适量，超声溶解后，放冷后加甲醇定容，摇匀得0.392mg·ml-1的对照品溶液。
2.2上样液的制备
称取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(60℃，-0.6bar)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·ml-1的上样液，测定(2.1.1hplc-uv外标法)其中bacopasidei的含量为1.464mg·ml-1，总皂苷的含量为4.684mg·ml-1，总皂苷纯度为6.49％。
2.3大孔树脂纯化工艺考察试验
2.3.1大孔树脂预处理
取大孔树脂分别用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后湿法装柱，乙醇洗脱至流出液与蒸馏水等量混合无白色浑浊沉淀为止，用蒸馏水洗至无醇味备用。
2.3.2大孔树脂型号筛选(静态试验)
取预处理完毕的不同型号hp-20、h20、ab-8、hpd-300、nka-9、d101大孔吸附树脂(相当于5g干树脂，以各树脂的含水量进行折算)，置250ml锥形瓶中，分别加入上样原液各100ml，密塞，置恒温振荡器中振摇(100r·min-1)24h，使其达到吸附平衡，静置，吸取适量上清液，测定其中的总皂苷含量。将各样品抽滤，分别用100ml去离子水洗涤树脂床，再将树脂转移到250ml锥形瓶中，加入100ml95％乙醇，密塞，以与上述相同转速振摇进行完全解吸，静置，吸取适量上清液，测定总皂苷含量，计算饱和吸附量及解吸率。见表1，结果表明，hp-20大孔树脂吸附解吸性能良好，故选取hp-20大孔树脂进行下一步实验。
饱和比吸附量＝(吸附原液总皂苷含量-吸附后上清液中总皂苷含量)/干树脂量
解吸率＝解吸液中总皂苷含量/饱和吸附量×100％
表1静态试验结果
2.3.3上样容量考察
取预处理完毕的hp-20大孔树脂，湿法装柱，柱体积500ml。取上样原液1400ml，以0.5bv·h-1流速上样，每200ml收集一次，测定各收集液中总皂苷含量，以收集液中测得总皂苷含量为纵坐标，以上样药液体积为横坐标绘制泄漏曲线，见图1，总皂苷开始泄露时原液的上样体积为1100ml，即每升树脂最多可吸附2200ml原液，再结合上述上样原液对应的0.311g·ml-1药材，确定饱和上样量为1l树脂柱对应0.67kg药材。为避免上样液过载造成原料的损失，因此最佳上样量大约为1l树脂柱对应0.4～0.5kg药材。
2.3.4上样质量浓度考察
取3根层析柱，装入相同量的大孔树脂，柱体积500ml。取上样原液400ml3份，用30％乙醇分别稀释成体积达到400，800，1600ml，然后分别上样，流速为0.5bv·h-1，上样完毕后，再依次用30％，80％乙醇各2.5bv冲洗树脂床，流速1.5bv·h-1，测定流出液和30％、80％洗脱液中总皂苷含量，计算吸附解吸率，得出原液稀释至400，800，1600ml的柱子吸附解吸率分别为94.20％，98.00％，98.00％。因上样药液的浓度与其洗脱规律关系不大，从上样体积及上样时间考虑，选用未稀释的药液作为上样原液较为适合。
2.3.5上样流速考察
取3根层析柱，装入相同量的大孔树脂，柱体积500ml。取上样原液400ml3份，以不同流速0.5，1，2bv·h-1上样，上样完毕后，再依次用30％，80％乙醇各500ml冲洗树脂床，流速1.5bv·h-1，测定流出液和30％，80％洗脱液中总皂苷含量，计算吸附解吸率，得出上样流速为0.5，1，2bv·h-1的柱子吸附解吸率分别为93.70％，94.20％，98.30％。上样流速与洗脱规律关系不大，但从树脂的饱和吸附考虑，上样流速越低，树脂对药液中总皂苷吸附越完全，随着上样量的增大，其柱子泄露的可能性越小，因此考虑采用0.5bv·h-1的流速进行上样。
2.3.6上样液ph考察
取3根层析柱，装入相同量的大孔树脂，柱体积500ml。取上样原液3份各600ml，浓盐酸分别调节ph为2.0，4.5，7.0，然后分别上样，流速0.5bv·h-1，再依次用30％，35％，40％乙醇(已调节ph与上样原液相同)各5bv冲洗树脂床，再采用70％，80％乙醇各5bv冲洗树脂床，均每2.5bv收集一次，测定各洗脱液中总皂苷含量。见图2，当原液上样ph为7.0、4.5时总皂苷在30％～45％乙醇中的转移率为33.5％，13.3％，在70％～80％乙醇中的转移率为52.8％，82.1％，而当原液上样ph为2.0时，总皂苷在70％乙醇中的转移率为100.0％，因此调节原液ph为2.0后上样最佳。
上样原液ph调节为2.0稳定性考察：取40ml含醇量为30％的上样原液，加浓盐酸调ph达到2.0后，在加入浓盐酸1，2，4，6，12h时间点分别取样，测定其中总皂苷含量，结果见图3，药液在加酸12h之内，总皂苷含量变化不大，较为稳定，因此确定药液加酸后12h内上样较为适宜。
2.3.7除杂洗脱溶剂和用量考察
取1根层析柱，装入大孔树脂，柱体积500ml。按最佳上样量、最佳上样浓度、最佳上样速度和ph上样，完毕后用30％(2bv)，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％乙醇各5bv冲洗脂床(其中30％，40％，45％乙醇ph为2.0)，每2.5bv收集一次，分别测定其中的总皂苷含量，并测定出膏量计算总皂苷纯度见图4和图5，总皂苷在45％乙醇中开始洗脱下来，杂质在流出液，30％～40％乙醇中的总转移率达到87.86％，因此可以选择40％乙醇(ph2.0)作为除杂溶剂，2bv的30％乙醇(ph2.0)、5bv的40％乙醇可以完全除去这部分杂质；总皂苷在45％-60％乙醇中的转移率为96.81％，其中总皂苷的总纯度达到47.0％，而在40％～70％乙醇中的转移率为99.13％，纯度没有提高，因此选择60％乙醇为洗脱收集溶液，体积定为5bv。
总皂苷洗脱液除酸步骤考察：调节原液和除杂溶剂ph为2.0，加入一定量的浓盐酸，在总皂苷收集液中含有一定的酸，对以后总皂苷中间体性质和贮存可能会产生一定影响，因此决定在除杂步骤后，采用低浓度乙醇冲洗树脂床，收集液呈中性后，再采用60％乙醇洗脱收集总皂苷。实验结果表明，采用15％乙醇，冲洗2bv可完全除去洗脱液中的酸。
2.3.8除杂洗脱流速考察
取3根层析柱，装入相同量的大孔树脂，柱体积500ml。按最佳上样量、最佳上样浓度、最佳上样速度和ph上样，完毕后用2bv30％酸性乙醇(ph2.0)、5bv40％酸性乙醇(ph2.0)除杂，2bv的15％乙醇除酸，5bv60％中性乙醇洗脱，除杂洗脱流速分别2.5，4，6bv·h-1，收集各部分，分别测定其中的总皂苷含量，总皂苷在各部分的转移率，见表2，不同除杂洗脱流速比较，总皂苷的转移率均达到80％左右，相差不大，但是当流速为4bv·h-1时，40％乙醇部位总皂苷洗脱下来，因此除杂洗脱流速不宜过大。以2.5bv·h-1为宜。
表2不同除杂洗脱流速考察
2.3.9径高比考察
取3根相同型号的层析柱，各分别加入已处理好的树脂适量，使其径高比分别约为：1∶7，1∶11，1∶15(1bv＝44ml，69ml，95ml)，取各树脂量所对应的上样原液按最佳上样速度上样，再依次用30％，80％乙醇各500ml冲洗树脂床，流速2.5bv·h-1，测定流出液和30％，80％洗脱液中总皂苷含量，计算吸附解吸率，得到径高比为1∶7、1∶11、1∶15的柱子的吸附解吸率为45.10％，70.10％，93.10％，随着柱长的增加，总皂苷的洗脱质量逐步增加，洗脱的效果越好，因此选择径高比越小的柱子进行实验，效果越好。但实际工业生产中能以满足径高比要求，因此选择径高比为1∶10的树脂柱。
2.3.10验证试验
取3根层析柱，装入相同量的大孔树脂，柱体积500ml。按优选的纯化工艺进行试验，并测定出膏量，计算三根柱子60％乙醇中总皂苷转移率分别为77.97％，76.96％，78.29％，总皂苷的纯度分别为51.62％，51.19％，55.67％，说明该工艺稳定，样品质量可控。
3.结论
采用静态试验筛选大孔树脂型号时，不同类型大孔树脂吸附能力差别较大，假马齿苋总皂苷为弱极性物质，其在弱极性树脂(hp-20、hpd-300)中的吸附量明显高于极性树脂(nka-9)、非极性树脂(d101、h-20)中的吸附量，前两种树脂中hp-20的吸附解吸率较高，且另做树脂使用周期考察试验表明hp-20树脂使用5次，其吸附解吸性能不变，因此选择hp-20树脂进行试验。
假马齿苋总皂苷中的bacopaside变因分子结构中含有磺酸基，对上样液及除杂溶剂的乙醇浓度较为敏感，调节ph至酸性，将有利于bacopaside液呈游离的分子形式存在，增强树脂的吸附作用，减少其在除杂阶段因乙醇浓度增加造成泄露损失，调节原液和除杂溶剂ph为2.0时，bacopaside露和其他四个皂苷吸附和解吸趋势一致，更有利于纯化过程中总皂苷的转移。除杂后低浓度乙醇除酸步骤的设定，使总皂苷中间体更加稳定。
一般情况下，大孔树脂柱纯化工艺的上样溶液都是无醇溶液，本实验过程中发现，以含醇药液上样可以在上样前和上样过程中快速有效去除药液中的大极性杂质，且因为药液含醇可以大大提高上样的速度、减少大极性杂质对树脂柱床的阻塞、缩短柱纯化工艺周期。经过实验考查，含醇30％既能保证目标皂苷的溶解度、又能保证上样过程中目标皂苷不会洗脱出来，是最佳的含醇量。鉴于生产过程中药液浓缩液的含醇量无法直接快速测得，此步骤所制定的工艺为将药材提取液浓缩至无醇后再以体积比兑醇至含醇30％。
实施例3
假马齿苋总皂苷提取物的药效试验
(1)抗抑郁活性研究
实施例1-2制备的假马齿苋总皂苷提取物采用小鼠强迫游泳实验(fst)进行了抗抑郁活性研究。
方法、步骤：实验动物：20g的maleicr小鼠(市售上海斯莱克实验动物有限公司)，每组12只；
实验给药：采用灌胃给药，连续给药六天；总皂苷设一个剂量组(200mg/kg)，阳性药氟西汀(12mg/kg)，模型组给予等量生理盐水。
实验过程：第六天小鼠给药40min后，进行强迫游泳实验，小鼠适应2min记录4min内不动时间。
由实验结果(见表1-1)可以看出假马齿苋总皂苷提取物显著性的降低小鼠游泳不动时间，表明假马齿苋总皂苷提取物具有显著地抗抑郁作用。
(2)抗老年痴呆活性研究，
实施例1-2制备的假马齿苋总皂苷提取物进行了小鼠跳台实验。
实验动物：20g的maleicr小鼠，每组12只；
实验给药：采用灌胃给药，连续给药六天；总皂苷设两个剂量组(100、200mg/kg)，模型组给予等量生理盐水。实验过程：通以36v交流电，动物受到电击，正常反应是跳到平台以躲避伤害性刺激。训练5min，记录小鼠受到电击的次数(错误次数)，作为学习成绩。24h后重复实验，为记忆保持实验。记录受电击动物数、第一次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总数。
由实验结果(见图6、图7)可以看出假马齿苋总皂苷提取物显著性
的降低了小鼠跳台的错误次数。
本发明人从假马齿苋药材中分离鉴定到40余种单体成分，并从中纯化得到具有较强神经保护活性的三萜皂苷类化合物bacopasidei(bm28，结构如式i所示)。前期药理研究结果(图8)表明bm28对谷氨酸(l-glutamate)和过氧化氢(h2o2)诱导的嗜铬细胞瘤细胞(pc12cells)和大鼠皮层神经元损伤具有显著的保护作用，且其保护作用具有剂量依赖性，显示了其潜在的抗老年痴呆活性。
与此同时，本发明人采用小鼠fst和tst实验对从假马齿苋中分离鉴定到的50余种单体进行了单一剂量的抗抑郁活性筛选，结果表明bm28具有最强的药效作用(表1-1，化合物50mg/kg；阳性药氟西汀(市售，礼来苏州制药有限公司)10mg/kg)。
表1-1bm28用于抗抑郁动物模型筛选结果
综上所述，假马齿苋抗抑郁抗老年痴呆活性主要是由其皂苷类成分作用，并且筛选到其中主要皂苷成分之一bacopasidei活性最好。
(二)bacopasidei抗抑郁抗老年痴呆作用研究
基于上述药理活性研究，课题组又对bacopasidei进行了系统性的抗抑郁抗老年痴呆药效学及其作用机制研究。
1、bacopasidei抗抑郁药效学及其作用机制研究
采用行为绝望的抑郁动物模型(tst、fst)和药物(利血平，5-htp)诱发的动物抑郁模型研究发现bacopasidei具有显著的抗抑郁作用。进一步研究发现其抗抑郁作用可能与以下机制有关：1)可能涉及去甲肾上腺素系统，提高脑内ne、da的水平；2)改善脑内抗氧化应激酶活性；3)可能不涉及5-羟色胺能系统而发挥作用；4)可能不通过抑制脑内单胺氧化酶(mao)活性起作用。
2、bacopasidei抗老年痴呆药效学及其作用机制研究
首先通过东莨菪碱诱导的短时记忆缺失模型筛选了bacopasidei抗老年痴呆具有显著活性的给药剂量。然后依据此剂量进行了bacopasidei治疗app/ps1双转基因阿尔茨海默小鼠实验，通过morris水迷宫及硫磺素染色、尼氏染色，明确了bacopasidei治疗app/ps1双转基因模型阿尔茨海默小鼠的药效；并且研究其作用机制结论如下：1)bacopasidei改善app/ps1双转基因阿尔茨海默小鼠脑内抗氧化应激酶活性；2)其作用机制可能不是通过抑制脑内乙酰胆碱酯酶活性。
其次，通过大脑中动脉缺血再灌注损伤(mcao)模型评价了bacopasidei抗脑缺血作用。实验通过神经功能评分、脑水肿程度、脑缺血面积、病理组织切片及脑内酶活性检测发现bacopasidei对mcao大鼠有保护作用，其作用可能与以下机制有关：1)提高脑内抗氧化应激酶活性；2)清除脑内脂质反应产物mda及增加脑血管扩张因子no的含量；3)改善损伤大鼠脑内的能量代谢及脑内能量代谢相关酶。
(三)小结
尽管bacopasidei具有较好的抗抑郁抗老年痴呆作用，bacopasidei的制备非常不容易，耗时耗力，bacopasidei为假马齿苋的主要皂苷成分之一，因此假马齿苋皂苷提取物作为防治老年痴呆和抗抑郁的新药研发，具有很大优势及良好前景。