本发明涉及一种含三元氧环苯乙基色酮衍生物在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
人体免疫系统包括天然免疫和适应性免疫，在防御各种内外源因素导致的机体损伤中起重要作用。但是免疫功能过度激活也会导致严重的组织损伤。与免疫功能过度激活相关的的疾病主要有炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥。天然免疫过度激活主要导致炎症相关疾病或者加重炎症相关疾病机体损伤。适应性免疫过度激活导致自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥。
目前预防或治疗炎症相关疾病的药物主要有糖皮质激素和环氧化酶抑制剂为代表的非甾体抗炎药。虽然糖皮质激素和非甾体抗炎药具有较好的抗炎作用，但是药物不良反应严重限制了它们的应用。糖皮质激素长期应用会导致代谢功能紊乱，非甾体抗炎药长期应用会导致胃溃疡。预防或治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥的药物主要有糖皮质激素和环孢素、他克莫司等适应性免疫抑制剂。糖皮质激素长期使用会导致代谢功能紊乱，而环孢素和他克莫司等适应性免疫抑制剂又具有较高的肾毒性(hironorimatsushimaetal.，blood，114(1)，64-73(2009))。因此，开发新的结构和作用机制的天然免疫和适应性免疫抑制剂对于预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥具有重要意义。
沉香是瑞香科植物白木香含有树脂的木材。中国药典记载沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急。这些功效和治疗作用与现代医学的抗炎作用十分相似。本发明人对广泛存在于沉香中的苯乙基色酮衍生物进行了提取分离和结构鉴定，并对它们的天然免疫和适应性免疫抑制作用进行了筛选。在前期发现多个倍半萜和氯代四氢苯乙基色酮衍生物具有良好天然免疫和适应性免疫抑制作用的基础上(专利申请号：201510332393.0、201510396970.2)，进一步发现含三元氧环苯乙基色酮衍生物能够通过不同机制发挥天然免疫和适应性免疫抑制作用，能够用于预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥。
技术实现要素：
本发明人经过长期的提取分离、结构鉴定和药理活性研究，在首次发现多个倍半萜和氯代四氢苯乙基色酮衍生物具有天然免疫和适应性免疫抑制的基础上，进一步首次发现一种已知的含三元氧环苯乙基色酮衍生物(bowuetal.helveticachimicaacta，2012，95：1657-1665)可以通过不同机制发挥天然免疫和适应性免疫抑制作用。
如下表格的一种含三元氧环苯乙基色酮衍生物(g21)具有良好的天然免疫和适应性免疫抑制作用，化学名为(1αr，2r，3r，7βs)-1α，2，3，7β-tetrahydro-2，3-dihydroxy-5-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-7h-oxireno-[f][1]benzopyran-7one。
本发明的目的在于提供选自上述表格中的一种含三元氧环苯乙基色酮衍生物(g21)，通过天然免疫和适应性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明的另一目的在于提供含有效剂量化合物g21的药物组合物，通过天然免疫和适应性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明的化合物g21可根据本领域公知的方法制备。
本发明通过巨噬细胞株raw264.7细胞和bv-2细胞筛选，证明化合物g21具有抑制细菌脂多糖刺激raw264.7细胞和bv-2细胞分泌一氧化氮的作用。
本发明通过酶联免疫测定，证明化合物g21具有抑制细菌脂多糖刺激的raw264.7细胞分泌炎症因子tnf-α、il-6、il-1β的作用。
本发明通过酶联免疫测定，证明化合物g21具有抑制细菌脂多糖刺激的raw264.7细胞分泌趋化因子mcp-1、mip-1d的作用。
本发明通过流式细胞测定，证明g21具有抑制小鼠中性粒细胞活化的作用。
本发明通过流式细胞测定，证明g21具有抑制小鼠脾脏cd4+t细胞、cd8+t细胞和b活化的作用。
本发明通过小鼠系统性炎症反应模型，证明通过灌胃给予化合物g21能够抑制静脉注射细菌脂多糖导致的系统性炎症反应。
本发明通过western-blot实验，证明化合物g21可以通过抑制stat1/3和nf-κb信号通路抑制天然免疫和适应性免疫。
本发明通过以上药理学实验证明了化合物g21及其药物组合物可以通过天然免疫和适应性免疫抑制在预防或治疗炎症相关疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥中的应用。
本发明的含化合物g21的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。
本发明的化合物g21及其药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为口服、静脉注射、肌肉注射、鼻腔、口腔粘膜、皮肤或直肠等。
本发明的化合物g21及其药物组合物的给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其它剂型如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明的化合物g21及其药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明涉及的化合物的用量为0.1～10mg/kg体重，可一次服用或分2～4次服用。本发明的化合物g21或含有它们的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。
本发明的化合物g21预防或治疗的炎症相关疾病可以是系统性炎症反应、肺炎、支气管炎、肝炎、肾炎、胃炎、肠炎、神经炎症、皮肤炎症等。
本发明的化合物g21预防或治疗的自身免疫性疾病可以是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、溃疡性结肠炎、系统性血管炎、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、桥本甲状腺炎等。
本发明的化合物g21预防或治疗的过敏性疾病可以是过敏性休克、过敏性哮喘、过敏性紫癜、过敏性皮炎等。
本发明的化合物g21预防或治疗的器官移植排斥可以是肾移植排斥、肝移植排斥、皮肤移植排斥、心脏移植排斥、造血干细胞移植排斥。
附图说明
附图为化合物g21对nf-κb通路、mapk和stat信号通路调节作用的western-blot检测图。
具体实施方式
以下将结合实施例对发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：化合物g21体外抑制小鼠巨噬细胞和神经小胶质细胞一氧化氮(no)分泌作用测定
(1)实验材料
细胞株：raw264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；bv-2细胞由中国医学科学院陈乃宏研究员馈赠。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；dmem高糖培养基、dmem/f12培养基和胎牛血清均购自康宁公司；细菌脂多糖(lps)购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；一氧化氮测定试剂盒(griess试剂)购自普利莱基因技术有限公司(货号：e1030)；噻唑兰购自美国amresco公司(货号：0793)；分析纯二甲基亚砜，购自北京化工厂。
仪器：enspiremultimodeplatereader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将处于对数生长期的raw264.7细胞(dmem高糖培养基)和bv-2细胞(dmem/f12培养基)接种到96孔板中，接种浓度均为20000细胞/孔，体积100μl，37℃和5％co2孵育24小时后，加入化合物g21，每个化合物设置7个浓度(无细胞毒作用)，各浓度设3个复孔，1小时后，加入细菌脂多糖(lps)至终浓度0.5μg/ml，继续孵育24小时。取50μl细胞上清，加入griess试剂100μl，反应10分钟后，测定540m波长的吸光度，并计算化合物g21对两种细胞分泌no的半数抑制浓度(ic50)。另将细胞培养板中培养基弃去，加入100μlmtt试剂(pbs配制的0.5mg/ml噻唑兰溶液)，细胞培养箱继续孵育4h，然后弃去mtt试剂，各孔加入150μl的二甲基亚砜溶解甲瓒，测定570nm波长的吸光度，并计算各浓度化合物对raw264.7细胞和bv-2细胞的生长抑制率。
(3)实验结果
通过分泌一氧化氮模型筛选，发现化合物g21能显著抑制小鼠巨噬细胞raw264.7和小胶质细胞bv-2在脂多糖刺激后的一氧化氮分泌，其半数抑制浓度(ic50)如表1所示；化合物g21在最高浓度达到40μm时仍对raw264.7和bv-2无生长抑制作用。
表1：化合物g21体外抑制no分泌作用测定
实施例2：化合物g21体外抑制小鼠巨噬细胞炎症因子分泌作用测定
(1)实验材料
细胞株：raw264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；dmem高糖培养基、dmem/f12培养基和胎牛血清均购自康宁公司；细菌脂多糖购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；测定tnf-α、il-6和il-1β的elisa试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司(货号：ek0527、ek0411和ek0394)。
仪器：enspiremultimodeplatereader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将处于对数生长期的raw264.7细胞接种到96孔板中，接种浓度为50000细胞/孔，体积100μl，37℃和5％co2孵育24小时后，加入化合物g21，使终浓度分别为2.5、5、10μm，，各浓度各设3个复孔，1小时后，加入细菌脂多糖(lps)至终浓度0.5μg/ml，继续孵育12小时。取细胞上清，利用elisa试剂盒测定细胞上清中tnf-α、il-6和il-1β的浓度。
(3)实验结果
通过分泌炎症因子测定，发现化合物g21处理组细胞上清tnf-α、il-6和il-1β浓度显著低于lps处理组(*p＜0.05)，如表2所示。表明化合物g21能够抑制小鼠巨噬细胞raw264.7在脂多糖刺激后的tnf-α、il-6和il-1β分泌。
表2：化合物g21体外抑制炎症因子分泌作用测定
*p＜0.05vslps
实施例3：化合物g21体外抑制小鼠巨噬细胞趋化因子分泌作用测定
(1)实验材料
细胞株：raw264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；dmem高糖培养基、dmem/f12培养基和胎牛血清均购自康宁公司；细菌脂多糖购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；测定mcp-1和mip-1α的elisa试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司(货号：ek0568和ek0449)。
仪器：enspiremultimodeplatereader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将处于对数生长期的raw264.7细胞接种到96孔板中，接种浓度为50000细胞/孔，体积100μl，37℃和5％co2孵育24小时后，加入化合物g21，使终浓度分别为2.5、5、10μm，，各浓度各设3个复孔，1小时后，加入细菌脂多糖(lps)至终浓度0.5μg/ml，继续孵育12小时。取细胞上清，利用elisa试剂盒测定细胞上清中mcp-1和mip-1α的浓度。
(3)实验结果
通过分泌趋化因子测定，发现化合物g21处理组细胞上清mcp-1和mip-1α浓度显著低于lps处理组(p＜0.05)，如表3所示。表明化合物g21能够抑制小鼠巨噬细胞raw264.7在脂多糖刺激后的mcp-1和mip-1α分泌，其中对mip-1α分泌抑制作用较强。
表3：化合物g21体外抑制趋化因子分泌作用测定
*p＜0.05vslps
实施例4：化合物g21体外抑制中性粒细胞活化作用测定
(1)实验材料
动物：balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；pe标记大鼠抗小鼠cd11b抗体和fitc标记大鼠抗小鼠cd62l抗体，购自美国bdbiosciences公司(货号：557397和561917)。
仪器：facscantotmii流式细胞仪购自美国bdbiosciences公司。
(2)实验方法
颈椎脱臼处死1只balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分钟，然后超净工作台内无菌去小鼠两侧股骨，剪开股骨膝关节端，利用1ml注射器吸取imdm培养基(含2％胎牛血清)将股骨中骨髓细胞冲洗到离心管中。经40μm孔径无菌滤网过滤细胞和白细胞计数，然后将细胞接种到24孔板中，保持白细胞浓度1×106个/孔，加入imdm培养基(含2％胎牛血清)至每孔培养基总体积1ml。再加入化合物g21至终浓度分别为2.5、5和10μm，，各浓度各设3个复孔，37℃和5％co2孵育1小时后，加入250μl条件培养基(conditionalmedium，cm；利用dmem高糖培养基培养的raw264.7细胞，经0.5μg/ml的lps刺激24小时而制备，其中tnf-α浓度约30ng/ml)，37℃和5％co2继续孵育1.5h。然后将细胞收集到离心管中，4℃，300g离心5分钟，倒去上清，250μl含0.5％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷pbs重悬细胞，加入pe标记大鼠抗小鼠cd11b抗体和fitc标记大鼠抗小鼠cd62l抗体，冰上孵育30分钟。然后加入1ml含0.5％bsa的pbs，4℃，300g离心5分钟，倒去上清，再加入1ml含0.5％bsa的pbs，4℃，300g离心5分钟，倒去上清。最后加入300μl含0.5％bsa的pbs重悬细胞，利用bdfacscantotmii流式细胞仪检测骨髓细胞中中性粒细胞(通过前向和侧向散射光设门)cd11b和cd62l的平均荧光强度。
(3)实验结果
通过流式细胞测定，小鼠中性粒细胞在cm处理后，细胞膜cd11b上调，而cd62l下调；化合物g21处理组cd11b平均荧光强度显著低于cm处理组(p＜0.05)，化合物g21处理组cd62l平均荧光强度显著高于cm处理组(p＜0.05)；如表4所示。表明化合物g21能够抑制小鼠中性粒细胞在炎症因子刺激后的活化。
表4：化合物g21体外抑制中性粒细胞活化作用测定
*p＜0.05vscm
实施例5：化合物g21体内抗炎作用测定
(1)实验材料
动物：balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；细菌脂多糖购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；测定tnf-α和il-6的elisa试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司(货号：ek0527和ek0411)。
仪器：enspiremultimodeplatereader购自德国铂金爱尔默公司。
(2)实验方法
将36只8周龄balb/c小鼠，适应性饲养3天，然后将动物随机平均分为5组，溶媒对照组(vehicle)、脂多糖组(lps)、化合物g21低、中、高剂量组。通过灌胃给予化合物g21各剂量组相应剂量化合物g21，vehicle和lps组给予等体积溶媒(含0.5％羧甲基纤维素钠的水溶液)。给药后1小时，通过静脉注射给予vehicle组以外5组动物10mg/kg脂多糖，vehicle组给予相应体积生理盐水。1.5h后，通过摘取眼球采集各组动物静脉血，4℃凝固1h后，4℃，800g离心取血清。利用elisa试剂盒测定血清中tnf-α和il-6浓度。
(3)实验结果
通过elisa测定，发现通过静脉注射给予小鼠lps后，小鼠血清中tnf-α和il-6浓度显著升高；化合物g21给药组动物血清中tnf-α和il-6浓度显著低于lps处理组(*p＜0.05)，如表5所示。表明化合物g21具有良好体内抗炎作用。
表5：化合物g21体内抗炎作用测定
*p＜0.05vslps
实施例6：化合物g21体外抑制cd4+t和cd8+t细胞活化作用测定
(1)实验材料
动物：balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；地鼠抗小鼠cd3e抗体(货号：557306)、地鼠抗小鼠cd28抗体(货号：557393)、fitc标记大鼠抗小鼠cd4抗体(货号：553046)、apc标记大鼠抗小鼠cd8a抗体(货号：553035)、pe标记地鼠抗小鼠cd69抗体(货号：553237)，购自美国bdbiosciences公司。
仪器：facscantotmii流式细胞仪购自美国bdbiosciences公司。
(2)实验方法
取无菌24孔培养板，设置溶媒对照组(vehicle)、模型组(model)、化合物g21的2.5、5、10μm等剂量组，各组设3个复孔，溶媒对照组各孔加入1ml的pbs，其它各组每孔加入1ml含4μg/ml地鼠抗小鼠cd3e抗体的pbs，4℃孵育过夜。颈椎脱臼处死1只balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分钟，然后超净工作台内无菌取小鼠脾脏，在50ml离心管上，架设40μm孔径尼龙滤网，将脾脏放到滤网上，缓缓加入20ml的pbs，并用5ml注射器芯杆平端研磨脾脏。将过滤的脾脏细胞300g离心5分钟，倒去上清，加入10ml含10％胎牛血清的1640rpmi培养基重悬细胞，并对白细胞进行计数。然后吸去24孔板中的pbs，用1640rpmi培养基清洗2次，再将脾细胞接种到24孔板中，保持白细胞浓度1×106个/孔，加入含10％胎牛血清的1640rpmi培养基至每孔培养基总体积0.8ml。再在化合物g21各剂量组孔中加入化合物g21至终浓度分别为2.5、5、10μm，37℃和5％co2条件下继续孵育。1小时后，cd3e包被孔中加入地鼠抗小鼠cd28抗体，浓度2μg/ml，继续孵育16小时。然后将细胞收集到离心管中，4℃，300g离心5分钟，倒去上清，250μl含0.5％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷pbs重悬细胞，加入fitc标记大鼠抗小鼠cd4抗体、apc标记大鼠抗小鼠cd8抗体和pe标记地鼠抗小鼠cd69抗体，冰上孵育30分钟。然后加入1ml含0.5％bsa的pbs，4℃，200g离心5分钟，倒去上清，再加入1ml含1％bsa的pbs，4℃，200g离心5分钟，倒去上清。最后加入300μl含1％bsa的pbs重悬细胞，利用bdfacscantotmii流式细胞仪检测cd4+t细胞和cd8+t细胞活化标志物cd69的平均荧光强度。
(3)实验结果
通过流式细胞测定，发现经过cd3e和cd28抗体刺激，model组cd4+t细胞和cd8+t细胞表面活化标志物cd69显著上调；化合物g21各剂量组cd4+t细胞和cd8+t细胞表面cd69平均荧光强度显著低于model组，如表6所示(p＜0.05)。表明化合物g21能够抑制小cd4+t细胞和cd8+t细胞的活化。
表6：化合物g21体外抑制cd4+t细胞和cd8+t细胞活化作用测定
*p＜0.05vsmodel
实施例7：化合物g21体外抑制b细胞活化作用测定
(4)实验材料
动物：balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。
试剂：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；细菌脂多糖(lps)购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；apc标记大鼠抗小鼠b220抗体(货号：553092)、pe标记地鼠抗小鼠cd69抗体(货号：553237)，购自美国bdbiosciences公司。
仪器：facscantotmii流式细胞仪购自美国bdbiosciences公司。
(5)实验方法
颈椎脱臼处死1只balb/c小鼠，75％酒精浸泡5分钟，然后超净工作台内无菌取小鼠脾脏，在50ml离心管上，架设40μm孔径尼龙滤网，将脾脏放到滤网上，缓缓加入20ml的pbs，并用5ml注射器芯杆平端研磨脾脏。将过滤的脾脏细胞300g离心5分钟，倒去上清，加入10ml含10％胎牛血清的1640rpmi培养基重悬细胞，并对白细胞进行计数。然后吸去24孔板中的pbs，用1640rpmi培养基清洗2次，再将脾细胞接种到无菌24孔板中，保持白细胞浓度1×106个/孔，加入含10％胎牛血清的1640rpmi培养基至每孔培养基总体积0.8ml。设置溶媒对照组(vehicle)、模型组(model)、化合物g21的2.5、5、10μm等剂量组，各组设3个复孔，在化合物g21各剂量组孔中加入化合物g21至终浓度分别为2.5、5、10μm，37℃和5％co2条件下继续孵育。1小时后，溶媒对照孔外各孔加入lps至终浓度10μg/ml，培养基总体积1ml，继续孵育16小时。然后将细胞收集到离心管中，4℃，300g离心5分钟，倒去上清，250μl含0.5％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷pbs重悬细胞，加入apc标记大鼠抗小鼠b220抗体和pe标记地鼠抗小鼠cd69抗体，冰上孵育30分钟。然后加入1ml含0.5％bsa的pbs，4℃，300g离心5分钟，倒去上清，再加入1ml含0.5％bsa的pbs，4℃，300g离心5分钟，倒去上清。最后加入300μl含0.5％bsa的pbs重悬细胞，利用bdfacscantotmii流式细胞仪检测b细胞活化标志物cd69平均荧光强度。
(6)实验结果
通过流式细胞测定，发现经过高浓度lps刺激，model组b细胞表面活化标志物cd69显著上调；化合物g21各剂量组b细胞表面cd69平均荧光强度显著低于model组(p＜0.05)，如表7所示。表明化合物g21能够抑制b细胞活化。
表7：化合物g21体外抑制b细胞活化作用测定
*p＜0.05vsmodel
实施例8：化合物g21抗炎作用机制研究
(1)实验材料
细胞株：raw264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
试剂及材料：化合物g21由北京中医药大学中药现代研究中心从沉香中提取分离；dmem高糖培养基、dmem/f12培养基和胎牛血清均购自康宁公司；细菌脂多糖(lps)购自德国sigma-aldrich公司(货号：l2880)；ripa裂解液(货号：p0013b)、bca蛋白定量试剂盒(货号：p0010)、sds-page凝胶配制试剂盒(货号：p0012a)、sds-page电泳液(货号：p0014b)、westernblot转膜液(货号：p0021b)、超敏ecl化学发光试剂盒(货号：p0018)、pvdf膜(货号：ffp39)购自碧云天生物技术研究所；nf-κbpathwaysamplerkit(货号：9936)、mapkfamilyantibodysamplerkit(货号：9926)、phospho-mapkfamilyantibodysamplerkit(货号：9910)、statantibodysamplerkit(9939)和phospho-statantibodysamplerkit(9914)购自美国cellsignallingtechnology公司。
仪器：imagequantlas4000mini超灵敏化学发光成像仪，购自generalelectric公司。
(2)实验方法
接种细胞：将处于对数生长期的raw264.7细胞接种到6孔板中，接种浓度为200000细胞/孔，体积2ml，37℃和5％co2孵育24小时；药物处理细胞：将6孔板细胞设溶媒对照组(vehicle)、脂多糖处理组(lps)、化合物g21各剂量组(2.5、5、10μm)，化合物g21各剂量组加入化合物g21至终浓度为2.5、5、10μm，1小时后，加入lps至脂多糖处理组和g21各剂量组至终浓度0.5μg/ml，继续孵育3小时；收集细胞：弃细胞培养基，用冰冷pbs冲洗细胞2次，然后各孔加入1.5ml冰冷pbs，用细胞刮收集细胞到2ml离心管中，4℃、300g离心5分钟，弃上清；裂解细胞：各管细胞中加入400μl的ripa裂解液，冰浴裂解30分钟，4℃、10000g离心10分钟，收集上清；蛋白浓度定量：利用bca蛋白定量试剂盒测定各样品蛋白浓度，并用ripa裂解液将各样品浓度调到同一浓度；制备蛋白电泳样品：吸取上述蛋白样品各200μl，加入50μl蛋白电泳上样缓冲液(5×)，混匀后99℃金属浴10分钟，然后冷却至室温；蛋白电泳：利用sds-page凝胶配制试剂盒配制10％聚丙烯酰胺凝胶，然后将上述蛋白样品各上样10μl，90v恒压电泳2小时；蛋白电转：将海绵垫、滤纸、甲醇浸泡过的pvdf膜和完成电泳操作的聚丙烯酰胺凝胶、滤纸、海绵垫按顺序放到电转夹中，再固定到电转槽内，120v恒压冰浴电转1.5小时；封闭：将电转后的膜取出，放入tbs溶液配制的5％脱脂牛奶中封闭1小时；一抗孵育：将封闭后的pvdf膜按目的条带所在位置剪成小条，然后分别加入5％脱脂牛奶配制的兔抗小鼠β-actin抗体、p65抗体、phospho-p65抗体、p38抗体、phospho-p38抗体、erk1/2抗体、phospho-erk1/2抗体、jnk抗体、phospho-jnk抗体、stat1抗体、phospho-stat1抗体、stat3抗体、phospho-stat3抗体(均为1∶1000稀释)，4℃塑封袋中孵育过夜；洗涤：将孵育一抗后的pvdf膜用tbst洗涤3次，每次5分钟；二抗孵育：再将pvdf膜装入塑封袋中，加入tbst配制的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg，室温孵育2h；洗涤：将孵育二抗后的pvdf膜用tbst洗涤3次，每次5分钟；化学发光成像：将pvdf膜逐条放入imagequantlas4000mini超灵敏化学发光成像仪中，加入超敏ecl化学发光液，拍摄化学发光图片。
浓度。
(3)实验结果
通过上述westernblot检测，发现经lps处理后，raw264.7细胞中nf-κb、mapk和stat1/3信号通路出现显著活化。经过化合物g21处理，raw264.7细胞中nf-κb和stat1/3信号通路活化被显著抑制(见附图)。由于nf-κb和stat信号通路在天然免疫和适应性免疫中发挥重要作用，抑制nf-κb和stat信号通路可能是化合物g21发挥天然免疫抑制和适应性免疫抑制的关键机制。