多功能高分子前药纳米递药系统及制备方法和用途与流程

本发明涉及高分子化学和纳米医药技术领域，具体地说是一种高分子抗肿瘤药物递送系统及制备和用途。

背景技术：

癌症是一种危及人类生命的疾病。现有数据表明，癌症的死亡人数大于由艾滋病、疟疾和结核病造成的死亡人数之和。化疗仍然是临床中治疗癌症的最有效的方式之一。然而，由于缺乏成像技术，没有办法示踪常规化疗药物是否进入肿瘤部位，导致化疗效果差，错过了最佳治疗时间。因此，诊疗一体化的药物提供了用于癌症诊断和癌症治疗的简单且实用的方法。

Theranostics整合了癌症诊断和癌症治疗，自1998年PharmaNetics首席执行官John Funkhouser提出以来，已经成为癌症治疗的趋势。随着纳米科学和纳米技术的快速发展，纳米医学的建立和发展为癌症等主要疾病的早期诊断和精准治疗提供了一个新的多功能平台。新型纳米探针可以整合诊断和治疗的功能，可以实现肿瘤的成像和治疗。

目前，已经应用几种类型的成像技术，包括计算机断层摄影(CT)，正电子发射断层摄影(PET)，核磁共振成像(MRI)，超声成像和光声成像(PA)，作为用于指导癌症治疗的辅助工具。其中，MRI是用于诊断癌症的重要工具。为了改善MRI的特异性和灵敏度，使用造影剂来增加信号强度。目前可获得基于钆(Gd)(Magnevist，ProHance)，Fe(Feridex，Endorem)和Mn(Teslascan)的许多不同的金属对比剂。其中，基于Gd的顺磁造影剂对于肿瘤和血管成像更好，并且二乙烯三胺五乙酸钆(Gd-DTPA，Magnevist)是最常用的MRI造影剂。然而，由于它们的低分子量，常规MRI造影剂在体内具有低弛豫率。为了克服这个缺点，提出纳米颗粒作为分子探针和作为MRI造影剂是可行的，并且能够克服小分子试剂的缺点。因此，一些纳米颗粒已经被开发用于分子成像。

紫杉醇(PTX)是一种抗癌化疗药物，对广泛的癌症，特别是肺癌、乳腺癌和卵巢癌等具有优异的治疗效果。此外，PTX的聚合物前药还因其增强的水溶性而引起广泛关注，例如，PEG-PTX和Xyotax TM(聚(L-谷氨酸)-紫杉醇(PGA-PTX))，后者已进入临床试验。还开发出了聚合物前药，聚(L-γ-谷氨酰基-谷氨酰胺)-紫杉醇(PGG-PTX)，其比PGA-PTX更高的溶解度和抗肿瘤效果。与相比，这些新一代的PTX制剂降低了副作用，利用EPR效应在肿瘤组织中的积累，增强了疗效和生物相容性。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对递药系统在体内缺少示踪、小分子造影剂弛豫率低的问题，提供一种多功能高分子前药纳米递药系统，PGG-PTX-DTPA-Gd用于肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。本发明的递药系统PGG-PTX-DTPA-Gd可以通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应的被动靶向作用于肿瘤部位，杀死肿瘤细胞，另外，其增加了造影剂Gd-DTPA的弛豫率，可以通过核磁共振成像示踪纳米药物，提供肿瘤诊断，从而实现肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化。

本发明的目的是这样实现的：

一种多功能高分子前药纳米递药系统，特点在于该纳米递药系统由T₁造影剂Gd-DTPA和高分子前药纳米粒构成，其高分子前药为PGG-PTX，与T₁造影剂Gd-DTPA通过肽键连接组成PGG-PTX-DTPA-Gd，其结构如下：

其中：r为聚合度，递药系统分子量在60000-90000Da，递药系统为纳米粒，粒径在30-40nm，粒径分布PDI为0.15-0.50。

一种上述纳米递药系统的制备方法，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：制备PGG-PTX-DTPA

将2.3-9.2mmol PGG-PTX钠盐溶解在去离子水中，用0.1-0.4M酸液酸化，用去离子水进行透析，再冷冻干燥。将干燥后的1.75-7.0mmol PGG-PTX溶解在25-100mL无水二甲基甲酰胺中，搅拌半小时，然后加入3.25-13.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺和2.1-8.4mmol N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，搅拌24小时；将反应混合物倒入无水乙醇中以终止反应，通过离心收集形成的沉淀，用冷乙醇洗涤三次，并在真空下干燥，得到PGG-PTX-NHS；将1.25-5.0mmol PGG-PTX-NHS溶解在10-40mL无水二甲基甲酰胺中，搅拌10分钟，得到澄清溶液，然后加入0.025-0.1mmol S-2-(4-氨基苄基)-二乙基三胺五乙酸和0.3-1.2mmol 4-二甲氨基吡啶，并搅拌24小时；通过倾入0.1-0.4M酸液终止反应，通过离心收集形成的沉淀，然后用0.15-0.6M碱液溶解，将溶液搅拌15分钟，用去离子水进行透析，过滤并冷冻干燥，得到PGG-PTX-DTPA；

步骤2：制备PGG-PTX-DTPA-Gd

将0.35-1.4mmol PGG-PTX-DTPA加入到0.05-0.2M且pH＝5.5乙酸钠缓冲溶液，再加入溶解在0.05-0.2M乙酸钠溶液的0.11-0.44mmol氯化钆，将溶液搅拌过夜；向溶液中加入二甲酚橙指示剂，然后滴加0.05-0.2M乙二胺四乙酸二钠盐溶液直至粉红色消失；使用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化，得到PGG-PTX-DTPA-Gd纳米递药系统。

所述透析，过滤并冷冻干燥是指：选择截留分子量为10000-100000的透析袋将过滤后的反应液置于去离子水中透析48-72小时后冷冻干燥。

所述酸液为稀盐酸或乙酸水溶液；碱液为碳酸氢钠或氢氧化钠水溶液。

所述纳米递药系统的应用在于该递药系统在制备诊断治疗肿瘤药物中的应用。

对本发明的纳米递药系统分别作了如下测定：

测定所述纳米递药系统的核磁；

测定所述纳米递药系统的粒径；

测定所述纳米递药系统的形态；

测定所述纳米递药系统弛豫率；

测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性；

测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取；

测定所述纳米递药系统在肺癌裸鼠体内的核磁共振成像；

测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。

测定结果表明，本发明的纳米递药系统可用作肿瘤影像诊断示踪药物，也可用作抗肿瘤药物的递送，肿瘤诊断和肿瘤治疗的一体化。

本发明的递药系统能够在水溶液中自组装形成纳米粒子，提高药物的水溶性，可通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应将其被动靶向至肿瘤部位，最大限度的降低毒副作用，提高疗效和生物利用度，以期克服化疗药物临床治疗效果不理想的瓶颈。

附图说明

图1为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd递药系统应用图；

图2为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd制备路线图；

图3为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd核磁图；

图4为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd粒径图；

图5为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd透射电镜图；

图6为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd弛豫率实验图；

图7为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd细胞毒性实验图；

图8为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd细胞定性定量摄取实验图；

图9为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd核磁共振成像实验图；

图10为本发明PGG-PTX-DTPA-Gd动物疗效实验图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面用实施例来进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面实例。

高分子前药紫杉醇载药量为34.9％，该前药的合成可参阅《Yang,D.,et al.,Effect of molecular weight of PGG-paclitaxel conjugates on in vitro and in vivo efficacy.J Control Release,2012.161(1):p.124-131》。

实施例1

制备PGG-PTX-DTPA

将4.6mmol PGG-PTX钠盐溶解在去离子水中，用0.2M稀盐酸酸化，用去离子水进行透析，再冷冻干燥。将干燥后的3.5mmol PGG-PTX溶解在50mL无水二甲基甲酰胺中，搅拌半小时，然后加入6.5mmol N-羟基琥珀酰亚胺和4.2mmol N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺，搅拌24小时。将反应混合物倒入无水乙醇中以终止反应，通过离心收集形成的沉淀，用冷乙醇洗涤三次，并在真空下干燥，然后得到PGG-PTX-NHS。将2.5mmol PGG-PTX-NHS溶解在20mL无水二甲基甲酰胺中，搅拌10分钟，得到澄清溶液，然后加入0.05mmol S-2-(4-氨基苄基)-二乙基三胺五乙酸和0.6mmol 4-二甲氨基吡啶，搅拌24小时。通过倾入0.2M稀盐酸溶液终止反应，通过离心收集形成的沉淀，然后用0.3M NaHCO₃溶液溶解，将溶液搅拌15分钟，用去离子水进行透析48小时，过滤并冷冻干燥，得到PGG-PTX-DTPA。

实施例2

制备PGG-PTX-DTPA-Gd

将0.69mmol PGG-PTX-DTPA加入到0.1M且pH＝5.5乙酸钠缓冲溶液，再加入溶解在0.1M乙酸钠溶液的0.22mmol氯化钆，将溶液搅拌过夜。向溶液中加入二甲酚橙指示剂，然后滴加0.1M乙二胺四乙酸二钠盐溶液，直至粉红色消失。使用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化，得到纳米递药系统。

实施例3

将PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd用氘代水溶解，在布鲁克400兆核磁共振仪下进行氢谱扫描，核磁图谱如图3所示，PGG-PTX-DTPA-Gd(II)和PGG-PTX(I)显示，DTPA的含量摩尔比约8％，与ICP-OES测定每克PGG-PTX-DTPA-Gd中Gd的含量0.21mmol-Gd相一致。

实施例4

将PGG-PTX-DTPA-Gd用PBS液配制成1.0mg/ml,超声5分钟后静置2分钟，用动态光散射仪测定粒径大小和粒径分布，结果如图4，PGG-PTX-DTPA-Gd纳米粒的分散性良好，纳米粒的平均粒径约30-40nm。

实施例5

将PGG-PTX-DTPA-Gd的形态通过透射电子显微镜来观察，需用1％的磷钨酸负染制备样品，具体如下：(1)滴一滴样品溶液于铜网上，(2)空气中干燥约10分钟，用滤纸吸去多余的液体，(3)再滴一滴1％的磷钨酸于铜网上，室温干燥5分钟后用滤纸吸去多余的染液，(4)待样品干燥后置于透射电镜下观察。图5为PGG-PTX-DTPA-Gd纳米粒的透射电镜图片，纳米粒形态均比较规则，呈球形。

实施例6

使用3T MRI测量不同Gd浓度下探针的T₁弛豫时间。以Gd浓度和驰豫时间1/T₁的线性曲线的斜率计算相应的R₁。PGG-PTX-DTPA-Gd稀释在蒸馏水中，Gd浓度范围为0.1-0.5mM，并且游离Gd-DTPA在相同剂量下作为对照。将样品转移到96孔板中，并用以下参数测量T₁弛豫时间：TR＝7000ms，TE＝11ms，TI＝24，100，200，400，600，900，1200，2000，3000和5000ms，FOV＝120×85mm，average＝1。实验结果如图6所示，将游离Gd-DTPA与PGG-PTX连接在一起，使游离Gd-DTPA的弛豫率从3.87mM^-1S^-1增加至18.98mM^-1S^-1，增加4.9倍。

实施例7

体外细胞摄取：以NCI-H460细胞为模型，将细胞以3×10⁴cells/ml的密度种于24孔板中培养24小时，然后用载有荧光染料DIO的PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd药物处理4h。加药处理后用PBS洗涤三次，分别用激光共聚焦定性和流式细胞仪定量评价细胞摄取情况。用激光共聚焦定性分析需要将细胞核用Hochest染成蓝色。流式细胞仪分析的细胞先用PBS洗涤三次，用用PBS洗涤，消化、离心，将沉淀重悬，流式细胞仪检测。如图7所示，激光共聚焦结果定性观察显示，PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd均容易被细胞摄取。流式细胞仪定量考察结果也显示，PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd纳米粒子均容易被细胞摄取。

实施例8

PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd的细胞毒性评价：体外细胞毒性实验以NCI-H460细胞为模型，采用CCK-8试剂盒，来考察PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd对细胞的抑制率，具体方法：将密度为3*10⁴cells/ml的非小细胞肺癌细胞NCI-H460悬液种于96孔板中，放置在5％CO₂条件下的37℃培养箱,培养24小时；向96孔板中加入不同浓度的PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd药物溶液，并设置空白对照，和阴性对照，每组设三个复孔；加药后将96孔板放置在5％CO₂条件下的37℃培养箱中继续孵育48小时；移去孔中的液体，每孔再次加入100μl新鲜培养基和10μl CCK-8试剂；将96孔板放在37℃恒温震荡箱中轻微震荡培养4小时；用酶标仪测定在450nm处的OD值。

细胞的存活率计算公式：

细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)]×100％。

公式中：

A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有非小细胞肺癌细胞NCI-H460的孔的OD值；

A(加药)：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；

A(不加药)：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值。

如图8所示，PGG-PTX和PGG-PTX-DTPA-Gd处理NCI-H460细胞48h后，细胞毒性变化不明显。

实施例9

进行MR成像研究。在裸鼠接种NCI-H460细胞后第14天，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(50μL，2.5％，50mg/kg)将小鼠(n＝3)麻醉。MR图像在具有动物线圈的3T MRI扫描仪上使用2D T₁加权自旋回波序列获得。通过尾静脉以0.07mmol-Gd/kg体重的剂量注射PGG-PTX-DTPA-Gd(B)，并且用相同剂量的游离Gd-DTPA(A)作为对照。在不同时间点进行扫描。用于图像采集的序列参数如下：TR＝500ms，TE＝14ms，α＝90°，FOV＝50(100，50％)mm，slice thickness＝1mm，and image matrix＝384×384。实验结果如图9所示，Gd-DTPA在0.5小时有较好的造影效果，而PGG-PTX-DTPA-Gd则在4小时，这是因为游离Gd-DTPA与PGG-PTX通过肽键连接在一起，形成了高分子纳米前药，肿瘤EPR效应使PGG-PTX-DTPA-Gd在肿瘤部位富集，为肿瘤诊断和肿瘤治疗的诊疗一体化提供了可行性。

实施例10

将NCI-H460细胞按常规条件(37℃，5％CO₂)培养,待细胞融合度达到80-90％时，用含EDTA的0.25％胰酶消化细胞并离心收集，用PH 7.4PBS洗涤细胞两次计数，制备成终浓度为5×10⁶个/mL的单细胞悬液,用1mL注射器将细胞接种到裸鼠的右肩皮下,每只裸鼠接种0.1mL，当肿瘤长至100-120mm³时备用。当肿瘤长至100-120mm³时(记作0天),将荷瘤小鼠随机分成3组，每组6只，分别设为生理盐水对照组，PGG-PTX(20mg/kg)组，PGG-PTX-DTPA-Gd(20mg/kg)组,尾静脉注射给药,考察如下指标：

肿瘤生长曲线：每两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式v＝1/2(长径*短径²)，计算肿瘤的体积，绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线。

疗效实验结果如图10所示，与生理盐水对照组相比，PGG-PTX组和PGG-PTX-DTPA-Gd组表现出明显的抑制肿瘤生长的效果。