治疗银屑病中药在制备防治1型糖尿病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医用的配制品，具体涉及含有来源于植物的未确定结构的药物制剂。

背景技术：

1型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导对自身胰岛β细胞产生免疫应答导致胰岛损伤，胰岛素绝对缺乏的急发性慢性病，需胰岛素终身治疗。国外资料表明，全世界不同地区的1型糖尿病发病率有数十倍差异，最高的是芬兰白人，达36.0/10万人年，而东南亚地区则较低，报告的结果为2.0/10万人年左右，而我国0～14岁人群中该病发病率达0.6/10万。由此看来，虽然我国1型糖尿病发病率较低，但是人口的众多决定了患者并不在少数，是危害人类健康的疾病之一。有研究资料显示我国青少年1型糖尿病患者呈现出逐年上升的趋势，发病率也随年龄的增长而增加，民族间的发病率差异达12倍，且发病率在不同地区之间呈现明显的南低北高现象。因此寻找有效治疗和改善该病的药物已成为一项迫在眉睫的任务。

在1型糖尿病(即胰岛素依赖型，IDDM)患者中，胰腺常有明显的病理改变，β细胞数量仅在正常的10％以下，多伴有胰小岛炎。主要病理改变有：1.胰小岛萎缩：此为1型糖尿病最常见的病理改变，表现为细胞皱缩，呈条束状而变窄。萎缩的小岛细胞形态较小，核致密，胞浆少。此类皱缩细胞尚能分泌胰高血糖素、生长抑素和胰多肽激素，但很少分泌胰岛素。2.胰小岛增生肥在：此系另一种较少见的重要改变，多见于病程短或新发病的患者。胰小岛细胞增生，甚至肥大，直径超过300～400μm。细胞较大，外形规则清晰，核较大。颗粒染色后观察，小岛主要含有具有流行性的β细胞，颗粒几乎全脱去，也含有α细胞。为“蜜月期”病情缓解的表现，数年后病情加重时β细胞可几乎完全消失。3.β细胞空泡变性：主要见于本病的急性型，特点为细胞浆变空，光镜下未见颗粒或其他细胞器。主要由于糖原子核沉着所致，并不造成β细胞永久性损伤，属可逆性改变。4.胰小岛炎：50％～70％的1型糖尿病患者，尤其是得病不久后死亡的儿童，常可见有胰小岛及其周围有淋巴细胞和单核细胞的浸润，为胰岛炎(insulitis)。由此提示自身免疫反应系1型糖尿病的发病机理。

西医虽然还无法治愈1型糖尿病，临床中已取得了重大的进展，治疗手段日趋多样化，不同程度地延缓了疾病的发生，减轻疾病的症状，提高1型糖尿病患者的生活质量。近几年，1型糖尿病的治疗取得了许多新的突破，如胰岛移植，胰岛素类似物及给药途径，基因，免疫干预，干细胞治疗等方面的研究为1型糖尿病的治疗提供了新的思路和方法。但是纯西医制剂副作用较大，血糖波动明显，胰岛素注射治疗患者依从性较差，所以急需研制用于治疗1型糖尿病的中药复方。

目前国内关于中药治疗1型糖尿病的研究多局限在中药单体或活性成分，而中药组合物治疗1型糖尿病的研究很少。陈蔚等研究发现，早期应用黄芪多糖(Astragalus Polysacharin，APS)预免疫可以纠正NOD小鼠Ts细胞的缺陷，恢复其细胞功能，使免疫抑制作用加强，纠正Thl型细胞/细胞因子的免疫失衡状态，从而预防或延缓NOD小鼠糖尿病发病。Kobayashi等发现人参提取物可降低NOD鼠的IFN-γ含量，增高IL-4含量从而预防糖尿病的发生发展。葱酸类成分大黄酸具有明显治疗NOD小鼠糖尿病及其肾病的作用，还可以明显改善db/db小鼠糖尿病肾病的损害，延缓肾功能减退。研究发现桑叶水提物对链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病小鼠胰岛的治疗作用和对肾脏以及肝脏的保健功效。康敏等研究结果显示黑苦荞粉对四氧嘧啶致糖尿病小鼠有一定的降糖作用。施念玮等研究发现雷公藤多苷通过下调NOD鼠胰腺中的Th1表达来预防糖尿病的发生。曹莉等发现葛根素可显著改善实验性糖尿病小鼠的胰岛索抵抗。王莉英等发现早期应用茶多糖预免疫可以预防或延缓NOD小鼠1型糖尿病的发生。关于防治1型糖尿病的中药，国知局的专利文献中先后公开了各种中药复方。其中，CN104042928专利申请公开了由石斛40-60份，葫芦巴5-15份制备的复方；CN103816438专利申请公开了由葛根50g；苦瓜50g；玉米须50g；番石榴叶25g；麦冬20g；海带20g；枸杞子15g；麦芽10g；生地9g；赤芍6g；二甲双胍0.03g制备的复方；CN103316101专利申请公开了由葫芦巴6-15份、黄芪6-15份、淫羊藿3-8份、补骨脂3-8份、山茱萸3-8份、大黄1-5份、肉桂3-8份、黄连2-6份制备的复方；CN103005446专利申请公开了由玉米须、蛹虫草合成的纯天然复方片剂，为降血糖功能食品；CN103585431专利申请公开了由土木香3-9份，艾叶3-9份，覆盆子6-12份，瓜子金15-30份，红景天3-6份，酸枣仁10-15份，知母6-12份，芡实9-15份，菟丝子6-12份制备的复方。

公开号为CN101632827A的专利申请公开了一种治疗银屑病中药组合物，该组合物由赤芍、肿节风、莪术、乌梅、紫草、土茯苓、甘草7味传统中草药配制而成的，具有活血祛瘀消斑，祛风除湿止痒之功。上述药物是由全国名老中医、著名皮肤病专家禤国维教授临床应用数十年的经验方加减而来，是广东省中医院用于治疗银屑病的常用药，具有活血祛瘀消斑，祛风除湿止痒之功效，临床用于治疗血虚风燥型的银屑病疗效确切。

现代药理研究表明，该中药组合物具有多种药理活性，概况起来讲，目前已公开的文献报道的药理作用如下：

(1)方中含有的芍药苷和甘草酸等指标成分，具有抗炎、免疫抑制等作用，肿节风中含有绿原酸、迷迭香酸、落新妇苷等化合物，也具有抗炎、免疫抑制等作用(冯丽敏，赵瑞芝，王银洁，韩凌，卢传坚.正交设计法优选银屑灵片中肿节风有效成分的提取工艺[J].时珍国医国药，2011，08：1860-1861.)。

(2)紫草中的紫草素对角质形成细胞株增殖有抑制及凋亡的作用(吴晓霞，周武庆.紫草素对角质形成细胞细胞株增殖的抑制及凋亡的作用[J].中国麻风皮肤病学杂志，2003，19(6)：563-565.)。

(3)莪术能使天然角化不全表皮细胞转化为正常细胞，并能抑制上皮细胞有丝分裂而起到抑制表皮增生过快的作用(徐厚谦，李应东.莪术研究概况[J].甘肃中医学院学报，1995，12(1)：46.)。

(4)莪术、肿节风、赤勺等活血化瘀诸药对于皮肤病微循环障碍的病理有明显的改善作用(黄咏菁，吴元胜，廖列辉，王蕾.阿维A胶囊联合银屑灵片治疗寻常性银屑病的临床观察[J].中国皮肤性病学杂志，2007，10：643-644.)。

(5)中药提取液对于TNF-α刺激产生的IL-8的具有抑制作用(卢传坚，刘凤年.“银屑灵片”中药提取液对肿瘤坏死因子-α刺激后角朊细胞分泌细胞因子IL-8的影响[J].辽宁中医杂志，2009，11：1862-1863.)。

以上研究提示，治疗银屑病中药组合物具有一定的抗炎、免疫抑制作用。目前，该方尚未见有将其应用于防治1型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病，insulin-dependent diabetes mellitus，简称IDDM)的研究报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供治疗银屑病中药在制药中的新用途。

上述治疗银屑病中药在制药中的新用途具体是：

治疗银屑病中药在制备防治1型糖尿病的药物中的应用；所述防治1型糖尿病的药物是公开号为CN101632827A的专利申请所述的一种治疗银屑病中药组合物，其有效成分由以下重量份原料制得：

肿节风15份，莪术9份，乌梅15份，土茯苓60份，赤芍9份，紫草15份，甘草6份。

上述防治1型糖尿病的药物为片剂，该片剂的制备方法由以下步骤组成：

(1)将所述的原料药，直接捣碎成粗粉，加入10倍量体积浓度为70％的乙醇提取两次，每次2小时，合并提取液；

(2)减压浓缩，回收乙醇，制得浸膏；

(3)取浸膏，加入3重量倍的淀粉，混均，制粒，干燥，按片剂重量的5％加入硬脂酸镁，混均，压片即可。

本发明采用治疗银屑病中药组合物治疗将NOD(shi/Ltj)雌性小鼠脾淋巴细胞移植到NOD-SCID雌性小鼠体内而诱发1型糖尿病的小鼠模型并采用临床上成人服用剂量换算而来的药物浓度对1型糖尿病小鼠模型干预33天，观察小鼠血糖到建模后35天，然后取材观测指标。

结果表明，治疗银屑病中药组合物可显著提高1型糖尿病模型鼠胰腺内胰岛细胞的存活率，延缓小鼠发病，降低小鼠1型糖尿病的发病程度，延长1型糖尿病小鼠的生存期。胰岛β细胞被自身T细胞攻击出现免疫反应是引发1型糖尿病的重要免疫因素，该中药组合物对于淋巴细胞移植建立的动物模具有有效保护作用，预示着可用于1型糖尿病的预防和治疗。根据银屑病的治疗经验，该中药组合物用法如下：成人每日用量相当于上述有效成分2.15g生药/kg体重，加水煎煮2-3次的合并液，分三次服，每次150毫升，30天一个疗程。

为了公众能更好地理解本发明的有益效果，下面将通过动物实验进一步阐明。

附图说明

图1为造模后小鼠的血糖变化趋势曲线图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

图2为造模后小鼠的发病率曲线图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

图3为造模后小鼠的平均体重曲线图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

图4为造模后小鼠的平均饮水量曲线图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

图5为造模后小鼠的平均食量曲线图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

图6为各组小鼠胰腺组织的HE染色图片。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。“10X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

图7为各组小鼠胰腺组织胰岛素抗体的免疫组织化学染色图片。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。“10X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

图8为各组小鼠胰腺组织CD3抗体的免疫组织化学染色图片。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。“10X”表示放大100倍，“20X”表示放大200倍，“40X”表示放大400倍。

图9为目的基因的Q-PCR的结果柱状图。“Control”表示正常组，“Model”表示模型组，“Treantment”表示中药处理组，即治疗组。

具体实施方式

下述实验采用模拟人1型糖尿病的动物模型，通过该模型观测不同时间点的血糖值验证治疗银屑病中药组合物对于1型糖尿病的治疗作用。首先，通过尝试性实验摸索造模方法，建立稳定的1型糖尿病小鼠模型，然后通过后续的实验进一步验证治疗银屑病中药组合物具有降低血糖和延缓发病的作用。

1治疗银屑病中药组合物对于1型糖尿病小鼠模型降低血糖和延缓发病的作用

1.1 1型糖尿病小鼠模型的建立

1.1.1仪器、材料和试剂

超净工作台，电脑，管式低速常温离心机(德国Eppendorf公司)；解剖器械若干套-剪刀和镊子，5mL注射器针柄，细胞培养皿(35mm×10mm)，45mL离心管，15mL离心管，滤网，载物台，擦手纸，乳胶手套，管架，废物缸，1mL注射器，冰盒，细胞计数板(Countstart)，1mL/200μL/10μL移液枪(德国Eppendorf公司)和枪头，电子移液枪，10mL移液管等；PBS(1×)溶液，红细胞裂解液(1×，ACK Lysis Buffer)，10％FBS/PBS溶液，0.2％的台盼蓝，消毒酒精。

1.1.2自发1型糖尿病NOD(shi/Ltj)雌性小鼠筛选

饲养NOD(shi/Ltj)雌性小鼠﹥4个月时，通过观测小鼠垫料的湿润、粘连程度和饮水量初步判定小鼠是否发病，开始检测血糖，将血糖≥11.1mmol/L的小鼠进行标记并与未发病小鼠分开放置，造模备用。

1.1.3自发1型糖尿病NOD(shi/Ltj)雌性小鼠脾淋巴细胞的分离与移植

1.超净台照紫外消毒，拿出ACK溶液复温，从动物房取出自发病造模用小鼠，准备冰盒，用装有少量10％FBS/PBS溶液的45mL离心管盛放脾脏。

2.将造模用小鼠颈椎脱臼处死，喷洒75％乙醇消毒，从侧面开腹取出脾脏，放入10％FBS/PBS溶液中，直至所有小鼠的脾脏全部取完。

3.将脾脏放在滤网上，置于装有一定量10％FBS/PBS溶液的培养皿中，一个一个的剪碎，研磨，再通过滤网过滤到45mL离心管中，置于冰盒中。

4.用管式低速常温离心机离心，1300转/分钟或300g，离心7分钟。

5.离心结束后，倒出上清，先加入2mL的ACK溶液，用枪头吹打均匀，室温静置30秒，转移上清至新离心管中，弃去白色沉淀，再在新管中加入14mL的ACK溶液，上下颠倒混匀，室温静置到5分，待溶液颜色变浅。

6.然后加入适量的PBS溶液停止反应，上下颠倒混匀，300g，离心7分钟。

7.离心结束后倒出上清，加入2mLPBS吹打均匀，再加至30mL预冷的PBS溶液，上下颠倒，同条件离心。

8.离心结束后倒出上清，加入4mLPBS，用移液管吹打均匀，取出10μL细胞悬液，再加入PBS至30mL清洗，同条件离心。同时，10μL细胞悬液中加入490μL的PBS溶液稀释50倍，用枪头吹打均匀后，再取出20μL细胞悬液，加入20μL的浓度为0.2％的台盼蓝，混合均匀，取出20μL用countstart计数软件计数(稀释了400倍)，得3.5×10⁶个细胞，则细胞总数为3.5×10⁶×50×2×4＝1.4×10⁹个。

9.离完心后，倒出上清，加入10mLPBS，则细胞浓度为1.4×10⁸个/mL，因为每只小鼠移植0.2mL细胞悬液，则每只小鼠移植的细胞数量为2.8×10⁷个。

10.将10mL的细胞悬液转入15mL离心管中，吹打均匀，置于冰盒中，带入动物房。

11.用1mL的注射器吸取细胞悬液，每只NOD-SCID小鼠注射0.2mL的细胞悬液。

12.将造完模的NOD-SCID小鼠进行分组，用苦味酸进行编号。

1.1.4结果

最后统计，我们将来源于8只已发IDDM(血糖≥11.1mmol/L)的NOD(shi/Ltj)小鼠的部分脾淋巴细胞成功移植到20只NOD-SCID小鼠体内，每只小鼠植入脾淋巴细胞量约2.8×10⁷个。已造模小鼠随机分为2组，模型组10只，只灌胃双蒸水，用于疗效对照；治疗组10只，用治疗银屑病中药组合物干预处理。正常NOD-SCID小鼠8只作为正常对照组，用于模型对照。由于观察期内操作失误，导致灌胃前期模型组和治疗组各有1只小鼠死亡。

1.2实验药物的制备

根据《中药药理实验方法学》规定，小鼠给药剂量的选择按照不同种属动物间等效剂量的直接折算公式计算，成人每日服用相当于129g生药，小鼠的用药剂量是成人的12倍，即每10g体重摄入0.258g生药量。取公开号为CN101632827A的专利申请实施例1所制得的浸膏，用水稀释至相当于每毫升混悬液含有生药量1.89g，4℃保存备用。

1.3灌胃与血糖监测

造模后第三天开始灌胃，正常对照组无需任何处理，模型组只灌胃双蒸水，治疗组只灌胃药液，两组灌胃容量一致，灌胃前均进行小鼠体重称重，做好记录，灌胃33天至取材。从造模后第15天开始通过小鼠尾静脉采血检测所有小鼠的随机血糖，使用雅培安妥血糖仪及试纸快速检测。血糖监测点设置在第15天，第21天，第23天，第25天，第26天，第27天，一直到第35天，做好小鼠血糖记录。

1.4实验结果

1.4.1各组小鼠一般状况在实验前后的变化

正常组活动频繁，动作敏捷，反应迅速；模型组精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，毛发枯槁无光泽，弓背蜷体；治疗组精神状况、反应、毛色活动较模型组明显增多。

1.4.2各组小鼠平均血糖在实验前后的变化

造模后第30天，模型组和治疗组小鼠血糖与正常组三组间比较有显著性差异(P＜0.01)，提示模型造模成功。与正常组比较，治疗组有差异，但远没有模型组差异显著，说明药物治疗有效。(结果见表1及图1)

表1 NOD-SCID小鼠及造模后小鼠血糖(mmol/L)变化

注：采用单因素重复测量的方差分析进行总体间的比较，P＝0.006＜0.01，统计学差异显著。小鼠后期血糖很高，血糖仪无法检测，显示“HI”，统计数据时用“27.8”表示。由于发病后期，模型组均已达到“HI”，用“27.8”表示无偏差，为方便统计，以“0.01”表示标准误。

1.4.3各组小鼠发病率在造模后的变化

以小鼠血糖≥11.1mmol/L为标准，判定造模的NOD-SCID小鼠是否发病。造模后3周内，各组小鼠发病率无明显差异(P＞0.05)，但模型组(n＝9)有明显发病趋势，4周后有明显差异(P＜0.01)，说明1型糖尿病造模成功，而治疗组(n＝9)发病缓慢，到4周以后才有发病趋势，到第32天时，有明显发病趋势(P＜0.01)，说明药物治疗有效。(结果见表2及图2)

表2 造模后NOD-SCID小鼠IDDM发病率(％)

注：三组间进行两两比较，由于两组间的总样本量小于40,采用卡方检验中的确切概率法进行比较，模型组、治疗组与正常组比较，^△P＜0.05，^*P＜0.01，^**P＜0.001，^***P＜0.0001。

1.4.4各组小鼠平均体重在实验前后的变化

实验前期各组小鼠体重无明显差异，在实验期间各组小鼠体重均增长，但三者之间无显著差异，实验后期模型组小鼠体重呈下降趋势，与治疗组比较有显著性差异，说明实验用药能明显改善小鼠的生存状态。(结果见表3及图3)

表3 造模后各组NOD-SCID小鼠平均体重变化

注：三组间比较采用重复测量的单因素方差分析的统计方法，三组间比较差异极显著。

1.4.5各组小鼠平均饮水量在实验前后的变化

实验前期各组小鼠饮水量无明显差异，在实验期间正常组小鼠饮水量波动不大，基本没有什么差别，而模型组和治疗组明显呈上升趋势，说明造模成功。但是，模型组与治疗组比较，上升趋势明显大于治疗组，与治疗组比较差异极显著性，说明实验用药能明显改善小鼠的生存状态，减少平均饮水量。(结果见表4及图4)

表4 造模后各组NOD-SCID小鼠平均饮水量变化

注：三组间比较采用重复测量的单因素方差分析的统计方法，三组间比较差异极显著。

1.4.6各组小鼠平均食量在实验前后的变化

实验前期各组小鼠食量无明显差异，在实验期间正常组和治疗组小鼠饮水量波动不大，前后基本没有什么差别，但治疗组平均食量明显低于正常组，而模型组明显呈上升趋势，总体高于其他两组，说明造模成功。治疗组平均饮食量较低，可能是由于灌胃实验用药的缘故。模型组与治疗组比较，差异极显著性，说明实验用药能明显改善小鼠的生存状态，减少平均饮食量。(结果见表5及图5)

表5 造模后各组NOD-SCID小鼠平均饮食量变化

注：两组间比较采用两独立样本t检验的统计方法，两组间比较差异极显著。

2从蛋白与分子水平探索治疗银屑病中药组合物对于1型糖尿病小鼠模型的治疗作用

2.1病理学检测

2.1.1取材

所有组小鼠在造模后第35天取材，颈椎脱臼处死，取胰腺组织，分三部分保存。一部分置于10％的中性甲醛中固定18小时，然后组织脱水，进行石蜡包埋；一部分置于冰冻包埋液(OCT)中迅速放于液氮中冷却，-80℃保存备用；一部分置于RNAlater(RNA StabilizationSolution，RNA稳定剂，购于life公司)中保存，以提取RNA检测组织样品中基因的表达。

2.1.2苏木素-伊红染色

用石蜡切片机进行石蜡样本的切片，厚度3μm，连续切片，一部分普通载玻片捞片用作HE染色，一部分粘附载玻片捞片用作免疫组织化学染色。石蜡切片放于切片架上室温过夜，次日用HE染色-封片一体机(ST5020-CV5030，Leica，Nussloch，Germany)进行染色，染色程序见表6，结束染色后直接封片机封片。

表6 HE机染程序

2.1.3各组小鼠胰腺组织病理变化

光镜下观察：分别在光镜下放大100倍、200倍、400倍观察。先在光镜下放大100倍观察，寻找胰腺组织中的胰岛并拍照，然后在200倍和400倍镜下拍照。低倍镜下，可见标本外围有一不太完整的结缔组织被膜。被膜伸入实质形成小叶间隔，将腺实质分隔成许多小叶。小叶间结缔组织内可见胰腺导管与血管的断面。小叶内大部分染色较深的是浆液性腺泡(外分泌部)，腺泡之间可见一些染色较浅、大小不等的细胞团，此即为胰岛(内分泌部)。胰岛为染色较浅淡的细胞团，大小不等，外包薄层结缔组织，位于外分泌部的腺泡之间。胰岛内细胞排列成团或索状，细胞间有丰富的毛细血管。HE染色图片中正常组胰腺组织中胰岛包膜完整，胰岛β细胞排列整齐，细胞核染色清亮，着色均匀，核膜完整；模型组胰腺组织中胰岛β细胞减少、颗粒脱失、空泡变性、坏死、消失，纤维组织增生、玻璃样变，胰岛α细胞明显增多，β细胞代偿性肥大，胰岛内部和周边有大量的炎性细胞浸润；治疗组胰腺组织中胰岛靠近导管一侧有炎性细胞浸润且有胰岛α细胞增殖，另一侧存留的胰岛β细胞较多，形态完整，排列分布整齐。(见图6)

2.1.4结果与分析

从整体上看，正常组无胰岛炎；治疗组胰腺组织中胰岛β细胞明显比模型组多，炎症浸润的范围和程度明显比模型组要小，要轻。从病理学图片可以看出治疗银屑病中药组合物治疗1型糖尿病模型小鼠效果明显。(见图6)

3.1免疫组织化学染色

3.1.1胰岛素抗体检测

3.1.1.1染色方法

胰腺组织石蜡切片3μm，37℃过夜，次日放入65℃烘箱烤片2小时。然后用二甲苯脱蜡两次，按无水乙醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇梯度复水。用1×柠檬酸修复液修复，3％H₂O₂消除内源性过氧化物酶消酶，二抗同来源血清封闭，然后孵一抗，4℃冰箱过夜，次日孵二抗，DAB显色，复染，分化，返蓝，脱水，中性树胶封片，镜下观察与拍照。

3.1.1.2镜下观察及分析

分别在光镜下放大100倍、200倍、400倍观察。先在光镜下放大100倍观察，寻找胰腺组织中的胰岛并拍照，然后在200倍和400倍镜下拍照。观察可见，正常对照组insulin抗体阳性的区域弥漫整个胰岛，只有胰岛周边α细胞未被染上；模型组染上的只有零星的几个胰岛β细胞，治疗组胰岛中insulin阳性的胰岛β细胞较多。(见图7)

3.1.2 CD3抗体检测

3.1.2.1染色方法

胰腺组织石蜡切片3μm，37℃过夜，次日放入65℃烘箱烤片2小时。然后用二甲苯脱蜡两次，按无水乙醇、95％乙醇、70％乙醇、50％乙醇梯度复水。用1×柠檬酸修复液修复，3％H₂O₂消除内源性过氧化物酶消酶，二抗同来源血清封闭，然后孵一抗，4℃冰箱过夜，次日孵二抗，DAB显色，复染，分化，返蓝，脱水，中性树胶封片，镜下观察与拍照。

3.1.2.2镜下观察及分析

分别在光镜下放大100倍、200倍、400倍观察。先在光镜下放大100倍观察，寻找胰腺组织中的胰岛并拍照，然后在200倍和400倍镜下拍照。观察可见，正常组CD3抗体阴性；模型组染上CD3阳性的T细胞很多，治疗组胰岛中CD3阳性的T细胞较少。(见图8)

4.1分子生物学检测

4.1.1实验方法

用Micro Kit提取胰腺组织总RNA，然后测RNA样品的浓度，调整至合适做RNA逆转录的浓度。用Promega的逆转录试剂盒进行RNA样本的逆转录，最后进行实时荧光定量PCR，检测胰腺样品中InsulinⅡ、CD3ε、IL-4、IL-10、IL-1β、IFN-γ、IL-17A各基因的相对表达量。基因序列见表7。

表7 基因序列

4.1.2结果与分析

InsulinⅡ是胰腺中胰岛细胞的特征基因，其含量的多少反映组织中胰岛的功能状况。正常组(n＝8)小鼠胰岛功能正常，模型组(n＝9)和治疗组(n＝9)基因的相对表达量明显低于正常组，治疗组保留胰岛一半的功能，模型组几乎完全丧失胰岛功能，采用单因素方差分析进行总体比较，差异极显著(P＜0.0001)，结果见表8及图9-A。

CD3ε是T淋巴细胞的特征基因，其含量的多少反映组织中炎症浸润的程度。正常NOD-SCID小鼠胰岛组织中不表达CD3ε，模型组(n＝9)CD3ε基因的相对表达量远高于治疗组(n＝9)和正常组(n＝8)，说明模型组炎症浸润相当严重，采用单因素方差分析进行总体比较，差异极显著(P＜0.0001)，结果见表8及图9-B。

IL-4是Th2细胞的特征因子，治疗组(n＝9)IL-4基因的相对表达量远高于模型组(n＝9)，采用两独立样本t检验法进行比较，差异极显著(P＜0.0001)，结果见表8及图9-C。

IL-10是一种重要的抗炎因子。治疗组(n＝9)IL-10基因的相对表达量明显高于模型组(n＝9)，说明药物治疗可能调节胰腺组织病变部分T细胞向Th2细胞分化，采用采用两独立样本t检验法进行比较，差异极显著(P＜0.0001)，结果见表8及图9-D。

IL-1β是一种与抗原协同作用，促使CD4⁺T细胞活化的炎性细胞因子。模型组(n＝9)IL-1β基因的相对表达量高于治疗组(n＝9)，采用两独立样本t检验法进行比较，差异有统计学意义(P＝0.0103＜0.05)，结果见表8及图9-E。

IFN-γ是Th1细胞的特征因子，模型组(n＝9)IFN-γ基因的相对表达量高于治疗组(n＝9)，采用两独立样本t检验法进行比较，差异较显著(P＝0.0001＜0.001)，结果见表8及图9-F。

IL-17A是Th中与1型糖尿病发展密切相关Th-17细胞的特征因子，为促炎因子。模型组(n＝9)IL-17A基因的相对表达量远高于治疗组(n＝9)，说明模型组炎症浸润的严重程度，采用两独立样本t检验法进行比较，差异较显著(P＝0.0008＜0.001)，结果见表8及图9-G。

表8 胰腺组织内特定基因相对表达量

注：insulinⅡ和CD3ε是以β-actin为内参基因，以正常组为对照组；IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A是以CD3ε为内参基因，以模型组为对照组。insulinⅡ和CD3ε三组的数据采用单因素方差分析进行三组间总体比较，先进行方差齐性检验，P＜0.05，说明方差不齐，采用均值相等性的键壮性检验(Welch/Brown-Forsythe)，P＜0.0001，组间多重比较采用Tamhane's T2检验法，正常组与模型组，模型组与治疗组，治疗组与正常组比较，^***P＜0.001，^**P＜0.01。IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A的模型组与治疗组两组独立样本采用t检验，先进行数据的正态性检验和方差齐性检验，IL-4，IL-10，IL-1β，IFN-γ，IL-17A的数据虽有符合正态性分布，但方差不齐，所以采用非参数检验法中Wilcoxon检验法，P值分别为＜0.0001，＜0.0001，0.0103＜0.05，0.0001＜0.001，0.0008＜0.001。

3统计学分析

所有的定量资料以(SEM)表示，样本数量根据实验需要而定，用Graphpad Prism 5软件作图，统计学分析使用Graphpad Prism 5软件、SPSS 20.0软件，重复测量的数据采用重复测量设计方差分析法，方差不齐时使用Dunnett’s T3检验法。定量资料三组间的比较采用单因素方差分析法；方差齐时，组间多重比较采用Tukey HSD检验法，方差不齐时，采用均值相等性的键壮性检验(Welch/Brown-Forsythe)，组间多重比较采用Tamhane's T2检验法。定量资料两组间的比较采用两独立样本t检验，不符合正态性分布且方差不齐的两组数据采用非参数检验法中Wilcoxon检验法。分类资料使用Fisher's Exact检验法，而1型糖尿病小鼠的生存评价资料采用Log-rank时序检验法。等级资料的比较采用秩和检验中的Kruskal Wallis H检验法。P＜0.05认为差异有统计学意义。

4结论

1型糖尿病动物模型经过治疗银屑病中药组合物干预处理，起到了很大延缓病情和治疗的作用。该中药组合物能够减轻小鼠胰腺组织内炎症的浸润，保护胰岛细胞的功能。总之，如今的研究表明该中药组合物能够显著提高T1D模型鼠胰腺内胰岛细胞的存活率，减少胰岛内炎性细胞如T细胞的浸润，延缓小鼠发病，降低小鼠T1D的发病率，延长小鼠的生存期，提示该中药组合物对模拟人自发1型糖尿病建立的T1D模型小鼠胰腺内胰岛细胞损伤具有良好的保护作用，减少炎症细胞的浸润，预示着该中药组合物在防治1型糖尿病方面有很大的开发应用前景。

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<110> 广东省中医院

<120> 治疗银屑病中药在制备防治1型糖尿病的药物中的应用

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