一种基于肽和光敏剂的光热纳米粒子、其制备方法和用途与流程

本发明属于纳米生物医药领域，涉及一种基于肽和光敏剂的光热纳米粒子、其制备方法和用途。

背景技术：

光热纳米粒子是一种可以捕获光并将光能转换为热量的新型纳米粒子。光热纳米粒子具有广泛的应用前景，比如可以应用于光声成像和光热治疗试剂的制备。在光声成像技术中，纳米粒子将光转换为热，热导致的膨胀进一步生成超声信号，从而结合了光的指向性和超声检测的高分辨特性，在肿瘤的检查中展现出了检测深度大、灵敏度高、安全性高的优点。基于同样的光热转换过程，光热纳米粒子可以使其周围的细胞和组织的温度升高，实现定向杀伤病变细胞的目的。与传统的放射检测和治疗相比较，光声成像和光热治疗中利用到的可见光和近红外光对正常的细胞和组织没有直接的杀伤作用。因此，光热纳米粒子为肿瘤的诊断和治疗提供了一种高效、安全的途径。

用于光声成像和光热治疗的纳米粒子需要具备在近红外区吸收强、光热转换效率高的性质。得到广泛研究的光热纳米粒子包括金纳米颗粒、石墨烯及氧化石墨烯、碳纳米管等。这些无机纳米粒子具有较大的光热转换效率和光稳定性，但是其在体内无法降解，长期安全性没有得到证实。为克服无机纳米粒子存在的不可降解的问题，人们发展了基于聚吡咯、聚苯胺等高分子聚合物的光热纳米粒子，但这些材料还存在表面修饰困难、降解机制复杂的问题。

肽是生物体天然存在的重要结构单元，肽分子的氨基酸序列决定了其在一定条件下可以自组装形成各种形貌的纳米粒子。肽分子不仅自身能自组装形成纳米粒子，包含肽分子结构的共价复合物也能够在肽分子的作用下形成各种有序结构，这些结构在化疗药物的递送等方面已经展示了一些优势。基于肽分子的自组装纳米粒子用于生物医药方面具有无免疫原性、化学结构明确、毒副作用小的优点。然而，如何设计合理的肽-光敏剂分子，并制备基于肽和光敏剂的光热纳米粒子，目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于肽和光敏剂的光热纳米粒子、其制备方法及用途；本发明形成的光热纳米粒子具有水体系中分散稳定、粒径分布均匀、大小可控、光热转换效率高、生物安全性高的特性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种光热纳米粒子，该光热纳米粒子由肽-光敏剂共价复合物经分子自组装形成。

本发明中，所述纳米粒子是由肽-光敏剂共价复合物在水体系中自组装形成的，其中需要强调的是，所涉及的肽-光敏剂共价复合物是指肽链和光敏剂之间通过共价结合，不同于以往的肽和光敏剂分子的共组装形式。

本发明通过采用以肽-光敏剂共价复合物的形式自组装，能够形成粒径大小可控、在水体系中稳定分散的光热纳米粒子，其突出的优点是光热转换效率高，可达到40％以上，从而可以应用于制备光声成像试剂、光热治疗试剂等领域。

根据本发明，所述肽-光敏剂共价复合物由光敏剂分子通过烷基链以酰胺键共价连接于肽链上，例如可以连接于肽链的碳端，也可以连接于肽链的氮端。

本发明中，所述烷基链主要用于连接光敏剂分子和肽链，其可以选自含有0-10个碳原子的烷基链，例如0个、1个、2个、3个、4个、5个、7个、9个或10个，当碳原子个数为0时，即光敏剂分子和肽链之间不含有烷基链。

根据本发明，所述肽-光敏剂共价复合物中，光敏剂分子可以是亲水性和/或疏水性光敏剂分子，然而采用疏水性光敏剂分子时所形成的光热纳米粒子，其在光热转换效率上表现出更大的优势。

本发明中，所述光敏剂分子为卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选四苯基卟啉、二氢卟吩E6、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟酚、酞菁、萘酞菁、卟啉烯或反转卟啉中的任意一种或至少两种的混合物，典型但非限制性的混合物为：卟啉和卟啉衍生物、细菌叶绿素和叶绿素a、萘并二氢卟酚和酮二氢卟酚。

根据本发明，所述肽-光敏剂共价复合物中的肽链是由苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸或精氨酸中的任意一种、两种或三种组合的寡肽序列。

本发明中的肽链选择氨基酸在1-3的寡肽序列，其有助于形成的光热纳米粒子发挥更大的光热转换效率。

本发明中，所述肽链可以选自L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬氨酸-L-天冬氨酸、L-天冬氨酸-L-天冬氨酸-L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-组氨酸-L-组氨酸或L-组氨酸-L-组氨酸-L-组氨酸中的任意一种，优选含有L-苯丙氨酸的肽链。

本发明中的光热纳米粒子形貌为球形，其直径在10-200nm范围内。

示例性地，本发明中的肽-光敏剂共价复合物的结构式如下所示：

第二方面，本发明提供了如第一方面所述的光热纳米粒子的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将肽-光敏剂共价复合物于良溶剂中配成溶液；

(2)将步骤(1)得到的溶液加入不良溶剂中，得到基于肽-光敏剂共价复合物的光热纳米粒子。

本发明中，步骤(1)所述肽-光敏剂共价复合物在良溶剂中的浓度为0.1-100mg/mL，例如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、90mg/mL或100mg/mL，优选1-50mg/mL。

本发明中，步骤(2)所述肽-光敏剂共价复合物在不良溶剂中的浓度为0.01-20mg/mL，例如0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL或20mg/mL，优选0.1-15mg/mL。

本发明中，步骤(1)所述良溶剂为二甲基亚砜、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙腈中的任意一种或至少两种的混合物；步骤(2)所述不良溶剂为水、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、氨-氯化铵缓冲液或枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液中的任意一种或至少两种的混合物。

具体地，本发明提供的光热纳米粒子的制备方法，可以包括以下步骤：

(1)将肽-光敏剂共价复合物于良溶剂中配制成0.1-100mg/mL的溶液；

所述良溶剂为二甲基亚砜、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或乙腈中的任意一种或至少两种的混合物；

(2)将上述溶液加入不良溶剂中，所述肽-光敏剂共价复合物在不良溶剂中浓度为0.01-20mg/mL，得到基于肽-光敏剂共价复合物的光热纳米粒子；

所述不良溶剂为水、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液、氨-氯化铵缓冲液或枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液中的任意一种或至少两种的混合物。

示例性地，所述光热纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将肽-光敏剂共价复合物于二甲基亚砜中配制成10mg/mL的溶液；

(2)将上述溶液加入水中，所述肽-光敏剂共价复合物在不良溶剂中浓度为5mg/mL，得到基于肽-光敏剂共价复合物的光热纳米粒子。

或者，所述光热纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将肽-光敏剂共价复合物于乙醇中配制成50mg/mL的溶液；

(2)将上述溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，所述肽-光敏剂共价复合物在不良溶剂中浓度为10mg/mL，得到基于肽-光敏剂共价复合物的光热纳米粒子。

第三方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的光热纳米粒子作为制备光热治疗制剂中的应用。

第四方面，本发明还提供了本发明第一方面所述光热纳米粒子作为制备光声成像制剂中的应用。

本发明的光热纳米粒子由肽-光敏剂共价复合物自组装形成；其中光敏剂发挥吸收光能的作用；肽分子的作用是调控光敏剂的自组装，一方面使形成的纳米粒子中光敏剂分子呈有序聚集状态，增强光能向热的转换，另一方面抑制光敏剂分子的进一步聚集，使得到的纳米粒子在水体系中稳定分散；与现有的光热纳米粒子相比较，本发明基于肽和光敏剂的光热纳米粒子具有分子结构明确、生物可降解、生物安全性高、无免疫原性的优点，避免了基于无机纳米颗粒和高分子聚合物应用于人体时潜在的毒副作用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的光热纳米粒子具有40％以上的光热转换效率；

(2)本发明提供的光热纳米粒子具有粒径大小可控、在水体系中稳定分散和生物可降解、生物安全性高、无免疫原性的优点，避免了基于无机纳米颗粒和高分子聚合物应用于人体时潜在的毒副作用。

附图说明

图1为实施例1中的光热纳米粒子的透射电子显微镜图片；

图2为实施例2中的光热纳米粒子的粒径分布图；

图3为实施例3中的光热纳米粒子的电位分布图；

图4为实施例4中的光热纳米粒子的原子力显微镜图片；

图5为实施例5中的光热纳米粒子在光照下的升温曲线图；

图6为实施例6中的光热纳米粒子的升温和降温曲线图；

图7为实施例7中的光热纳米粒子在溶液中的光声信号；

图8为实施例8中的光热纳米粒子用于活体光声成像的光声信号强度图；

图9为实施例9中的光热纳米粒子用于光热治疗时的热成像图；

图10为实施例10中的光热纳米粒子用于光热治疗杀灭细胞的效果图；

图11为实施例11中的光热纳米粒子用于活体光热治疗时肿瘤体积的变化曲线。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

取如下所示结构式的化合物2mg，溶解于1mL二甲基亚砜，配制成5mg/mL的溶液，加入10mL水，得到光热纳米粒子的分散液。取样品滴于铜网，透射电子显微镜测试得到图1所示结构，其表明该光热纳米粒子为直径30nm左右的球体。

实施例2

取如下所示结构式的化合物100mg，溶解于1mL乙醇，配制成100mg/mL的溶液，加入磷酸盐缓冲液，使化合物浓度为20mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。取样品进行动态光散射测试，结果如图2所示，其表明纳米粒子的直径为100纳米左右。

实施例3

取如下所示结构式的化合物0.1mg，溶解于1mL甲醇，配制成0.1mg/mL的溶液，加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，使化合物浓度为0.01mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液，经测试其粒径为10纳米左右。取样品进行电位测试，结果如图3所示，表明纳米粒子的电位为-20毫伏左右。

实施例4

取如下所示结构式的化合物10mg，溶解于1mL四氢呋喃，配制成10mg/mL的溶液，加入醋酸-醋酸铵缓冲液，使化合物浓度为1mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。取样品负载于云母片表面进行原子显微镜测试，结果如图4所示，其表明纳米粒子为直径200纳米左右的球体。

实施例5

取如下所示结构式的化合物2mg，溶解于1mL乙腈，配制成2mg/mL的溶液，加入氨-氯化铵缓冲液，使化合物浓度为0.2mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。取1mL 0.2mg/mL的样品置于1厘米的正方形比色皿中，使用700纳米波长的激光进行照射，激光功率0.2瓦/平方厘米，以纯水作为对照组，以温度探测仪测试溶液温度的变化，结果如图5所示，其表明纳米粒子在激光照射下能迅速转换光能为热量，光热转换效率为80％。

实施例6

取如下所示结构式的化合物5mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺，配制成5mg/mL的溶液，加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液，使化合物浓度为1mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。取1mL 1mg/mL的样品置于1厘米的正方形比色皿中，使用650纳米波长的激光进行照射，激光功率0.2瓦/平方厘米，照射10分钟后关闭激光，整个过程中以温度探测仪测试溶液温度的变化，结果如图6所示，其表明纳米粒子在激光照射下能迅速转换光能为热量，光热转换效率计算为46％。

实施例7

取如下所示结构式的化合物5mg，溶解于1mL二甲基亚砜，配制成5mg/mL的溶液，加入水，使化合物浓度为0.5mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。测试其光热转换效率为40％。取0.5mg/mL的样品置于进行光声成像测试，结果如图7所示，其表明纳米粒子在激光照射下能产生光声信号。

实施例8

取如下所示结构式的化合物5mg，溶解于1mL乙醇，配制成5mg/mL的溶液，加入水，使化合物浓度为0.5mg/mL，得到光热纳米粒子的分散液。取200微升0.5mg/mL的样品经过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，24小时后将小鼠置于光声成像仪中进行测试，结果如图8所示，肿瘤部位光声信号较强，而正常组织中光声信号较弱，表明该纳米粒子在活体中在肿瘤部位富集，并能够显示肿瘤的位置。

实施例9

如实施例2中制备的光热纳米粒子，配制为1mg/mL的样品，取200微升经过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，24小时后使用700纳米波长的激光照射肿瘤位置，激光功率0.2瓦/平方厘米，照射过程中使用热成像仪检测小鼠温度的变化，结果如图9所示，其表明肿瘤部分温度上升，而其他部位无明显变化。

实施例10

取实施例8中制备的光热纳米粒子，与乳腺癌细胞MFC-7共孵育，光热纳米粒子在培养液中的浓度为0.05mg/mL，24小时后使用700纳米波长的激光照射细胞2分钟，激光功率0.5瓦/平方厘米，照射后继续孵育24小时并进行细胞活度测试，结果如图10所示，经光热治疗的细胞活度明显下降，而未经纳米粒子处理的细胞活度无明显变化。

实施例11

取实施例1中制备的纳米粒子，在5％葡萄糖水溶液中配制成0.8mg/mL的溶液。取20只小鼠，分成4组：对照组、仅激光组、仅纳米粒子组、纳米粒子+激光组(光热治疗组)。仅纳米粒子组和纳米粒子+激光组的小鼠通过尾静脉注射200微升纳米粒子，24小时后使用635纳米波长的激光照射肿瘤10分钟，照射后每隔一天测试小鼠肿瘤体积的变化，结果如图11所示。结果表明，光热治疗组的肿瘤得到较好的抑制，而其它几组的肿瘤没有明显变化，说明该纳米粒子用于光热治疗能很好地抑制肿瘤。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品及详细制备方法，但本发明并不局限于上述产品和详细制备方法，即不意味着本发明必须依赖上述产品和详细制备方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。