二甲双胍联合成体干细胞在制备治疗心肌梗死药物中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及二甲双胍联合成体干细胞在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

背景技术：

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是一种严重的心脏疾病，威胁着全人类的健康。心肌梗死的主要发病机制在于心肌细胞的急性和慢性损失，并最终导致心力衰竭。多种类型的干细胞包括骨髓和脂肪组织来源的干细胞已经在临床试验中应用于治疗心肌梗死，但是治疗效果并不十分显著。其重要原因是移植后的干细胞存活率低下，在宿主心肌梗死区域高炎症因子和自由基的环境下，无论使用哪种干细胞类型进行移植，其心肌组织保护和修复作用的发挥均受限于移植细胞的存活。研究表明提高PHDP2，Akt，Bcl-2，SDF-1，CR-1等促存活基因的表达可以提高移植细胞的存活，然而通过改造这些基因的方法仍处于动物实验阶段，离应用于临床实践仍有很长距离。

目前应用于临床试验的干细胞类型主要是成体干细胞，如未分选的骨髓细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和心肌内源性干细胞。近期研究表明胚胎干细胞或者是诱导多能干细胞及其衍生细胞在治疗心肌梗死的动物实验中发挥了显著的疗效，但是这两类细胞因具有成瘤风险而尚未进入临床试验。心肌球源性干细胞(Cardiosphere-derived cell，CDC)是心肌内源性干细胞的一种，无论是在动物模型还是临床病人中，均起到心梗后保护和修复的作用，而且临床试验表明冠脉内自体CDC注射可以减少心梗面积，增加存活心肌的数量，并且在治疗1年后可以显著改善心梗区域的心功能，并且没有产生严重的副作用。CDC治疗心肌梗死的研究已进入II期临床试验，初步结果提示该细胞类型对心肌梗死的治疗效果优于骨髓间充质干细胞等细胞类型。但是，CDC移植后存活率较低，很大程度上限制其治疗心肌梗死的疗效。

技术实现要素：

有鉴于此，为增加成体干细胞在心肌恶劣移植环境中的存活，提高成体干细胞修复心肌的能力及治疗心肌梗死的疗效，本发明的目的在于提供二甲双胍(Metformin，MET)联合成体干细胞在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

二甲双胍联合成体干细胞在制备治疗心肌梗死药物中的应用。

进一步，所述成体干细胞为心肌球源性干细胞、心肌前体干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、未分选的骨髓细胞或骨髓单个核细胞中的一种。

进一步，所述心肌梗死为急性心肌梗死、无痛性心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死、右室心肌梗死或心房心肌梗死中的一种。

本发明的有益效果在于：本发明提供了二甲双胍联合成体干细胞在制备治疗心肌梗死药物中的应用，以二甲双胍联合成体干细胞制备的药物用于治疗心肌梗死，可有效增加成体干细胞在心肌恶劣移植环境中的存活，提高成体干细胞修复心肌的能力及治疗心肌梗死的疗效。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为Sham、MI+PBS、MI+MET、MI+CDC、MI+MET+CDC各组小鼠心肌梗死术后的M型超声图像、左室射血分数图及短轴收缩率图；

图2为MI+PBS、MI+MET、MI+CDC、MI+MET+CDC各组小鼠心肌梗死术后的Masson染色显示纤维化图及心梗面积图；

图3为MET显著提高CDC心肌内注射的存活率图；

图4为二甲双胍增加过氧化氢处理后的心肌球源性干细胞的AMPK和eNOS的磷酸化水平的western blot图。

其中，图1中，A为各组小鼠心肌梗死术后M型超声图像，B为各组小鼠心肌梗死术后的左室射血分数图，C为各组小鼠心肌梗死术后的左室短轴收缩率图；图2中，A1为各组小鼠心肌梗死术后心肌梗死面积图，A2为各组小鼠心肌梗死术后心肌梗死面积统计图，B1为各组小鼠心肌梗死术后梗死区纤维化图，B2为各组小鼠心肌梗死术后梗死区纤维化统计图，C1为各组小鼠心肌梗死术后梗死边缘区纤维化图，C2为各组小鼠心肌梗死术后梗死边缘区纤维化统计图；图3中，A为MI+CDC、MI+MET+CDC两组小鼠心肌梗死术后的免疫荧光染色图，B为MI+CDC、MI+MET+CDC两组小鼠心肌梗死术后的消化计数图，C为MI+CDC、MI+MET+CDC两组小鼠心肌梗死术后CDC存活率统计图；图4中，A1为各组小鼠心肌球源性干细胞的AMPK western blot图，图A2为各组小鼠心肌球源性干细胞的AMPK磷酸化水平的统计图，B1为各组小鼠心肌球源性干细胞的eNOS western blot图，B2为各组小鼠心肌球源性干细胞的eNOS磷酸化水平的统计图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

心肌球源性干细胞(Cardiosphere-derived cell，CDC)的提取、培养及鉴定

用GFP标记16周龄C57小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb)，取小鼠离体心脏，将小鼠心脏剪碎成小于1mm³的组织块，使用0.05％的胰酶消化，然后将组织接种于预先使用纤连蛋白孵育的60mm小皿中，之后加入1mlCEM(80％IMDM，20％血清，1％双抗)，7天后使用胰酶消化孵育出的CDC。

将上述CDC细胞以1000r/min离心3min，弃去上清培养基，PBS清洗两次，加入CD29、CD105、CD90、CD45、CD34、CD31抗体，以及FITC和PE同型抗体4℃孵育30min，之后PBS清洗2次，使用C6流式细胞仪进行鉴定，上样量为10000。鉴定结果为CD29、CD105、CD90阳性，CD45、CD34、CD31阴性。

实施例2

二甲双胍(Metformin，MET)联合CDC使用可改善小鼠心肌梗死术后心功能

将小鼠随机分为四组：MI+PBS，MI+MET，MI+CDC和MI+MET+CDC。心肌梗死术前6小时腹膜内注射二甲双胍125mg/kg。异氟烷进行诱导麻醉后，固定小鼠于加热毯上，纵行切开颈部皮肤、肌肉，暴露气管，进行气管插管，调整呼吸机频率为100次/分，潮气量为20ml。于小鼠第四肋间横行切开皮肤、肌肉，暴露肋骨，剪开肋间肌，撑开器暴露心脏，撕开心包膜，使用7-0丝线于左心耳下2-3mm结扎冠状动脉，见心脏颜色变白，表明结扎成功，实验组于心肌梗死边缘分8个点注射CDC，关胸，消毒切口。假手术组(Sham)为仅进行开关胸，不结扎冠脉。二甲双胍术后注射剂量为125mg/kg/day。术后7天，将小鼠随机编号，遵守双盲原则，超声仪(GE vivid 7)测定小鼠的心脏结构和心功能，具体为：异氟烷诱导麻醉后，固定小鼠于泡沫板上，超声探头检测小鼠胸骨旁长轴观心脏影像，模式为M型，使用Teicholz公式计算左室射血分数，每个数据重复三次，以平均值作为统计数据。实验结果如图1所示，由各组M型超声图像(如图1A)可知，二甲双胍联合使用CDC可以显著改善小鼠心梗术后的左室射血分数(如图1B所示)及短轴收缩率(如图1C所示)。

实施例3

二甲双胍促进CDC的存活并减少梗死面积

提取实施例2中各组小鼠心肌细胞于显微镜下计数具有绿色荧光的CDC，具体如下：取各组小鼠离体心脏，置于4℃的PBS中，移至显微镜下；用眼科镊除去主动脉周围的脂肪和其他组织，迅速将主动脉挂于针头上，用线头打结固定，针头的位置不能超过主动脉根部；用容量为1ml的注射器吸入1号液(140mM NaCl、10mM Glucose、4mM KCl、1mM MgCl₂.6H₂O、10mM Hepes、10mM牛磺酸、10mM BDM)将心脏内的血液冲出；取下针头，挂于灌注器上，除去灌注器内气泡，以1号液灌注2min，然后换2号液(50ml 1号液、50mg胶原酶、6mg胰蛋白酶、0.5M CaCl₂ 2uL)冲洗消化10min，至心脏组织变软塌陷，流速加快为约每秒1滴，心脏颜色由红变浅，停止消化；将心脏剪下于60mm皿中，加2ml 2号液，将心脏剪碎至几大块，用吸管吹散；50目滤器过滤悬液，除去未被消化的心脏组织，并向滤液中加入10ml 3号液(50ml 1号液、250mg BSA、0.5M CaCl₂ 12.5uL)，以终止消化；将混合液体移入无菌离心管中，在1000r/min下离心5min，弃上清，在无菌离心管中加入4号液(50ml 1号液、250mg BSA、0.5M CaCl₂、25uL)，重悬细胞，收集心肌细胞，在显微镜下观察具有绿色荧光的CDC。

免疫荧光染色计数CDC，具体如下：以体积分数为4％的多聚甲醛固定心脏组织，石蜡包埋固定，切片机切片，二甲苯脱蜡，EDTA-柠檬酸钠修复30min，滴加免疫荧光封闭液，20℃下封闭1h，PBS洗片三次，再滴加兔来源anti-GFP(1:50，3ul)，小鼠来源Anti-α-actinin(1:100，3ul)于4℃孵育12h，PBS再洗片三次，滴加FITC标记山羊抗兔抗体(1:200，3ul)，Cy3标记山羊抗小鼠抗体(1:200，3ul)37℃在孵育1h，PBS再洗片三次后滴加DAPI染液，最后使用甘油缓冲液封片，荧光显微镜下计数具有绿色荧光的CDC。

Masson染色：石蜡切片机切片，脱蜡后用Weigert苏木精液染核5min，充分水洗后用Masson丽春红酸性复红液染色5min，以体积分数为2％的冰醋酸水溶液浸洗30s，体积分数为1％的磷钼酸水溶液分化3min，用苯胺蓝或光绿液染5min，以体积分数为0.2％的冰醋酸水溶液浸洗30s，质量分数为95％的酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

结果：二甲双胍联合心肌球源性干细胞移植可以显著减少心肌梗死面积(如图2A1、A2所示)，以及梗死区纤维化(如图2B1、B2所示)和梗死边缘区纤维化(如图2C1、C2所示)。通过免疫荧光(如图3A所示)和消化计数(如图3B所示)的方式证明应用二甲双胍显著提高心肌球源性干细胞在的存活率(如图3C所示)。

实施例4

Western blot验证二甲双胍促进CDC存活的分子机制

实验分组为Control、H₂O₂、MET+H₂O₂、AICAR+H₂O₂、MET+CC+H₂O₂、AICAR+CC+H₂O₂。配制SDS-PAGE凝胶，上样量为100ug总蛋白，浓缩胶部分50-80v使样品浓缩成一条窄带，到分离胶可选择100-120v，直至溴酚蓝到达底部停止电泳。取下胶板，半干法转膜，5-10％脱脂牛奶封闭，室温、摇床约1h，用TBST漂洗一次约5min；用5％脱脂牛奶或5％BSA的TBST稀释一抗4℃过夜或室温1h孵育；用TBST缓冲液漂洗，3-4次，每次10min，用含1％BSA的TBST，1:5000-1：20000稀释二抗，摇床室温孵育1h，扫膜。

结果：通过Western blot证明二甲双胍可以增加过氧化氢处理后的心肌球源性干细胞的AMPK(如图4A1、A2所示)和eNOS(如图4B1、B2所示)的磷酸化水平。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。