龙胆苦苷在胃溃疡疾病防治中的应用的制作方法

本发明涉及龙胆苦苷在防治胃溃疡疾病中的应用。

技术背景

胃溃疡是一种胃部溃疡性疾病，发病率在世界各个国家非常常见。当该疾病发作时，胃粘膜可出现明显的充血、糜烂，严重时可导致胃穿孔，威胁生命。虽然目前胃溃疡的具体发病机制尚未清楚，但被大家认可的是胃溃疡的发生发展及严重程度，与胃粘膜组织中如MDA、MPO、TNF-α、IL-6等异常的升高，同时抗氧化应激水平相对较低密切相关。在胃溃疡防治药物评价中，高浓度乙醇诱导的胃溃疡小鼠模型，是一种常见的用于研究受试药物在胃溃疡疾病中的作用效果的基本模型，当给予小鼠灌胃高浓度乙醇后，可迅速引起小鼠胃部粘膜点状或条形糜烂，以及充血。

秦艽是我国传统的一味中药，其药用部位为根，其80%乙醇提取物经大孔吸附树脂D-101处理后，获得的龙胆总苷，现已成为市售药品，主要用于功能性消化不良属肝胃郁热证者，症见胃脘饱胀，脘部烧灼，该药中龙胆苦苷含量达50%以上（中国专利ZL97108434.3）。而将龙胆总苷经过重结晶获得龙胆苦苷，作为肌肉和静脉注射的龙胆苦苷粉针剂（中国专利ZL 03114558.2），及在抑制肝炎病毒药物中的应用（中国专利 ZL 200410073488.7）已获得国家专利授权。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供龙胆苦苷的新用途，具体涉及在防治胃溃疡疾病中的应用。

解决上述问题的技术方案：从秦艽药材中制备出龙胆苦苷（含量大于98%），此制备的龙胆苦苷制成片剂、胶囊剂、糖浆剂、颗粒剂等口服制剂，用于防治胃溃疡疾病。

龙胆苦苷的制备工艺：

（1）秦艽药材粉碎后，过100目筛，取药材粉末，以药材比水1：10煎煮3次，每次15分钟，合并煎煮液，离心取上清液；

（2）取上清液上D101大孔吸附树脂柱，每克树脂上50 mL药液，大孔树脂柱用2 ~ 4倍量的水洗液洗脱，弃掉此水洗液，再用3 ~ 10倍的30%乙醇洗脱树脂柱，收集30%乙醇洗脱液，减压抽干，得含龙胆苦苷约70%残留物；

（3）将此残留物用水溶解再上大孔吸附树脂柱D101，用30%乙醇洗脱，回收洗脱液，所得残留物溶于2 ~ 5倍的95%乙醇中，过滤，回收乙醇并抽干，再用95%乙醇溶解，放置，析出结晶，过滤，得含量大于98%龙胆苦苷。

龙胆苦苷防治胃溃疡，以常用制剂的形式来使用：所述的常规药物用制剂含作为活性成分在制剂中与药学上可接受的载体赋形剂混合，该药用制剂可以是固体形式如片剂，胶囊剂，颗粒剂，也可以是液体形式如糖浆剂等口服制剂。

上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂：乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。

上述的制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。

本发明通过实验证明了：龙胆苦苷能抑制胃粘膜组织中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同时升高胃粘膜组织SOD，GSH的水平，提高抗氧化应激能力，减少小鼠胃粘膜糜烂性损伤的程度，达到了防治胃溃疡的目的，龙胆苦苷具有良好的开发和应用于胃溃疡疾病防治的价值。

说明书附图

图1. (A) 小鼠胃粘膜损伤的情况；(B) 溃疡指数评估。 ^###P ≤ 0.01 与正常对照组比较, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型组比较，⁺P ≤ 0.05与西咪替丁组比较；

图2. (A) 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)对TNF-α的作用；(B) 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)对IL-6的作用. ^###P ≤ 0.01 与正常对照组比较, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型组比较；

图3. 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)对MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和^###P ≤ 0.01 正常对照组比较, ^**P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 模型组比较, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 与西咪替丁组比较；

图4. 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100 mg/kg)对MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和 ^##P ≤ 0.01 正常对照组, ^*P ≤ 0.05, ^***P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 与模型组比较, and ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 西咪替丁组比较；

图5. (A) 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)对SOD的作用；(B) 在70%诱导的小鼠胃溃疡中，龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)对GSH的作用. ^#P ≤ 0.05, ^###P ≤ 0.01 和 ^###P ≤ 0.001 正常对照组比较, ^***P ≤ 0.001 与模型组比较, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01西咪替丁组比较。

具体实施方式

下面发明人给出了用龙胆苦苷防治胃溃疡疾病的实施实例。

实施例1

药用龙胆苦苷制备成片剂，以生产片剂产品1000片为例，所用原料和辅料及其重量配比如下：

龙胆苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制备工艺按制剂学片剂的常规工艺进行，每片重0.3 g，每片含龙胆苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1片，一日1次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例2

药用龙胆苦苷制备成胶囊剂，以生产胶囊剂产品1000例为例，所用原料和辅料及其重量配比如下：

龙胆苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制备工艺按制剂学胶囊剂的常规工艺进行，每片重0.3 g，每片含龙胆苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1粒，一日1次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例3

药用龙胆苦苷制备成颗粒剂，以生产颗粒剂产品1000例为例，所用原料和辅料及其重量配比如下：

龙胆苦苷 200 g

蔗糖 400 g

糊精 400 g

其制备工艺按制剂学颗粒剂的常规工艺进行，每袋重1 g，1 g含龙胆苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1袋，一日1次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例4

药用龙胆苦苷制备成糖浆剂，以生产糖浆剂产品1000 mL例为例，所用原料和辅料及其重量配比如下：

龙胆苦苷 200 g

蔗糖 600 g

蒸馏水 1000 mL

其制备工艺按制剂学糖浆剂的常规工艺进行，每瓶重10 mL，1 mL含龙胆苦苷20 mg。

用法用量：口服，每次1瓶，一日1次，小儿酌减，15天一个疗程。

实施例 5 药效评价试验

为更好的理解本发明的实质，下面将用龙胆苦苷在70%乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型中的实验结果来说明它在制药领域中的新用途。

受试药物

龙胆苦苷（含量大于98%），味苦，无色至微黄色固体粉末。

受试动物

SPF级昆明种小鼠，雄鼠，健康适龄，体重22 ~ 28g，购自西安交通大学实验动物中心，生产许可证号：SYXK(陕）2007-001，动物使用许可证号SYXK(陕）2010-001.

3.实验试剂

无水乙醇，蒸馏水，70%乙醇由无水乙醇用蒸馏水稀释而成。

试验方法

4.1供试药品的配制

龙胆苦苷用蒸馏水分别配制成浓度为20 mg/kg，40 mg/kg，80 mg/kg的水溶液，4℃密闭保存备用。

龙胆苦苷对70%乙醇所致的急性胃溃疡的防治作用

昆明种小鼠60只，在SPF条件下适应性饲养7天，然后随机将小鼠分成6组，每组10只，即空白对照组，70%乙醇控制组（模型组），70%乙醇+西咪替丁100 mg/kg控制组（西咪替丁组），70%乙醇+龙胆苦苷20 mg/kg控制组（龙胆苦苷20 mg/kg剂量组），70%乙醇+龙胆苦苷40 mg/kg控制组（龙胆苦苷40 mg/kg剂量组），70%乙醇+龙胆苦苷80 mg/kg控制组（龙胆苦苷80 mg/kg剂量组）。从第1天到第14天，空白组和70%乙醇控制组灌胃给予生理盐水（0.01 mL/kg)，其余各组按剂量灌胃给予相应的药物，每天一次。第15天时，空白对照组和70%乙醇控制组灌胃给予生理盐水，其余各组按剂量灌胃给予相应的药物，1小时后，空白组仍然给予生理盐水，其余各组给予70%乙醇（0.01 mL/kg)，再过1小时后，所有动物用麻醉后，眦取血液后，移除胃组织，沿胃大弯剪开，用生理盐水（4℃）洗去残留物，于冰上展开，然后观察并记录数据，计算溃疡指数。最后将所有小鼠胃组织储藏于-80℃，用于胃粘膜组织中MDA, MPO, TNF-α, IL-6，SOD，GSH水平的测定。

小鼠胃粘膜溃疡指数的评价得分方法如下：

0：没有损伤；

1：粘膜充血；

2：针点状糜烂(X < 1 mm)；

3：小的糜烂(1 mm < X)；

4：中等糜烂(1 mm ≤ X < 2 mm)；

5：大的糜烂( 2 mm≤ X <3 mm)；

6：大面积的糜烂(3 mm < X)。

胃溃疡指数= 每组中总的得分/动物个数

4.3. TNF-α、IL-6的测定

TNF-α, IL-6通过酶联免疫吸附测定试剂盒进行测定，操作过程严格按照试剂盒操作说明进行操作，吸收波长在450 um处进行测定。

的测定

小鼠胃组织于磷酸二氢钾缓冲液（pH= 6.5）中进行匀浆，取部分组织匀浆液加入0.5%的十六烷基三甲基溴化胺溶液，涡旋10分钟，然后在4 °C及20,000 × g下离心10分钟，取上清液加入含有0.1 mM H₂O₂ 和 1.6 mM四甲基联苯氨的溶液中，在37 °C进行孵化。MPO的活性通过MPO测定试剂盒在450 nm下进行测定。

的测定

小鼠胃组织于磷酸二氢钾缓冲液（pH= 6.5）中进行匀浆. 然后在4 °C及20,000 × g下离心10分钟，取上清液. 于上清液中加入硫代巴比土酸进行反应后，在532 nm下测定MDA的浓度。

、GSH的测定

小鼠胃黏膜中SOD、GSH的测定用SOD 测定试剂盒和GSH 测定试剂盒来进行测定，操作步骤严格按照测定试剂盒操作说明进行。

数据分析

所有数据通过SPSS 19.0统计软件进行分析，以means ± S.E.M (standard error of mean)表示。其中模型组与空白对照组，以及龙胆苦苷三个不同的剂量组与西咪替丁组之间的显著性分析通过Mann-Whitney U 进行检验。西咪替组和龙胆苦苷给药组，与模型组之间的显著性分析通过单因素方差分析中LSD-t 进行检验。P ≤ 0.05被认为具有显著性。

实验结果

6.1 胃粘膜溃疡指数的评价

如图1A, 正常控制组没有出现明显的胃粘膜糜烂性损伤，与模型组小鼠胃粘膜出现的严重性糜烂损伤相比，西咪替丁和龙胆苦苷预防性给药减轻了胃粘膜损伤的程度。如图1B, 从溃疡指数评价得分结果来看，与模型组18.8 ± 3.809，龙胆苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)预防性给药使溃疡指数评价得分分别降低到8.9 ± 1.709 (P ≤ 0.01), 2.6 ± 0.763 (P ≤ 0.001), 和 1.8 ± 0.853 (P ≤ 0.001)，并且预防性给以西咪替丁也是溃疡指数评价得分降低到8.1 ± 1.929 (P ≤ 0.001)。同时龙胆苦苷大剂量组(80 mg/kg)，溃疡指数评价得分低于西咪替丁给药组。

胃粘膜中TNF-α, IL-6的评价

如图2A，与模型组(683.07 ± 17.071)比较，龙胆苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 预防性给药分别将TNF-α 的水平降低到544.48 ± 15.546 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 478.74 ± 13.436 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 和 415.40 ± 10.475 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且 TNF-α 的水平在西咪替丁控制组也被降低到370.9 ± 11.501, P ≤ 0.001。如图2B，与正常控制组(82.431 ± 3.429 pg/ml tissue)比较，IL-6水平在模型组升高到156.42 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。而与7模型组比较，预防性给以龙胆苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)，使IL-6的水平降低到 142.52 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.01), 122.25 ± 2.229 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), and 113.04 ± 2.467 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且预防性给以西咪替丁使IL-6水平也降低到93.37 ± 2.432 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MPO的评价

如图3, 与模型组MPO水平(3.9 ± 0.044)比较, 预防性给以龙胆苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MPO水平降低到3.49 ± 0.083 U/g tissue (P ≤ 0.01), 3.23 ± 0.043 U/g tissue (P ≤ 0.001), 2.74 ± 0.0519 U/g tissue (P ≤ 0.001), 和3.45 ± 0.064 (P ≤ 0.01)，并且龙胆苦苷80 mg/kg剂量组对MPO的降低程度优于西咪替丁组(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MDA的评价

如图4, 与模型组MDA水平(0.51 ± 0.028)比较, 预防性给以龙胆苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MDA水平降低到0.41 ± 0.026 (P ≤ 0.05), 0.20 ± 0.013 (P ≤ 0.001), 0.33 ± 0.019 (P ≤ 0.001), and 0.37 ± 0.047 (P ≤ 0.01). 而且, 40 mg/kg 和 80 mg/kg 剂量组中MDA的水平明显比西咪替丁组低(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中SOD、GSH的评价

如图5A和图5B, 预防性给以龙胆苦苷和西咪替丁明显升高了小鼠胃黏膜中SOD和GSH的水平。在给以龙胆苦苷20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，SOD的水平分别达到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.134(P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.1134(P ≤ 0.001)，GSH的水平分别达到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001), 8.09 ± 0.134 (P ≤ 0.001), 9.16 ± 0.1134 (P ≤ 0.001)。而模型组的SOD、GSH水平为6.54 ± 0.120、6.54 ± 0.120. 与模型组SOD、GSH水平相比，给以西咪替丁(100mg/kg)也使SOD、GSH水平升高到8.16 ± 0.122(P ≤ 0.001)、8.16 ± 0.122 (P ≤ 0.001). 并且SOD和 GSH水平在龙胆苦苷大剂量组(80 mg/kg)都比西咪替丁组(100mg/kg)高(P ≤ 0.001).

7.结论

实验结果表明：在70%乙醇诱导的小鼠胃溃疡模型中，龙胆苦苷能抑制胃粘膜组织中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同时升高胃粘膜组织SOD，GSH的水平，提高抗氧化应激能力，减少小鼠胃粘膜糜烂性损伤的程度，达到了防治胃溃疡的目的。并且龙胆苦苷80 mg/kg剂量对MDA, MPO降低的程度以及对SOD，GSH升高的程度优于西咪替丁100 mg/kg的剂量，结合龙胆苦苷80 mg/kg剂量组和西咪替丁100 mg/kg剂量组的溃疡指数评价得分结果，表明龙胆苦苷在80 mg/kg的剂量下，对胃溃疡的防治效果优于西咪替丁100 mg/kg的剂量，因此，说明龙胆苦苷在胃溃疡防治药物中，具有良好的开发和应用于胃溃疡疾病防治的价值。