人参皂苷M1用于预防或治疗硅肺病的用途的制作方法

相关申请

本申请要求2015年3月17日申请的美国临时申请第62/134,236号的优先权，其内容在此全部并入作为参考资料。

本发明涉及人参皂苷m1用于治疗或预防硅肺病的新用途。

背景技术：

硅肺病是一种吸入二氧化硅颗粒造成的肺部疾病，通常来自工作在矿场及采石场及一些其他职业如建筑、铸造厂、陶瓷及玻璃制造。二氧化硅颗粒影响肺部功能。其症状包含呼吸急促、剧烈的咳嗽及虚弱。

人参皂苷是人参的主要活性成分，已知具有多种药理学活性，例如，抗肿瘤、抗疲劳、抗过敏及抗氧化活性。人参皂苷类具有相同的基础结构，其是由具17个碳原子排成四个环的甾烷类固醇核心(gonanesteroidnucleus)组成。人参皂苷会在体内代谢，近来许多研究指出，在体内易吸收而作为活性成分的是人参皂苷代谢物而非天然存在的人参皂苷。其中，人参皂苷m1已知为原人参二醇型(protopanaxadiol-type)人参皂苷代谢物之一，其经由人体肠道细菌的绞股蓝皂苷(gypenoside)途径生成。迄今，尚未有现有技术报导人参皂苷m1在硅肺病的治疗功效。

技术实现要素：

本发明不可预期地发现，人参皂苷m1可有效减轻或延迟硅肺病的发病或恶化。因此，本发明提供一种在个体治疗或预防硅肺病的新方法。

具体而言，本发明提供一种在需要的个体治疗硅肺病的方法，其包含将有效量的人参皂苷m1施用至该个体。

具体而言，本发明的治疗方法有效地抑制二氧化硅结晶引起的nlrp3发炎体活化。更特定地，本发明的治疗方法有效地抑制二氧化硅结晶通过nlrp3发炎体引起的白介素(il)1β产生。

在部分具体实施例中，人参皂苷m1是以肠外或肠内的路径施用。

本发明还提供一种人参皂苷m1用于制造供需要的个体治疗硅肺病的药物的用途。

本发明的一或多个具体实施例的详述列于下方的说明中。本发明的其他特征或优势可由下列多个具体实施例的详细说明及所附的权利要求书而更加清楚。

附图说明

欲说明本发明，附图具体实施例如下。然而，应理解到，本发明未局限于所示的较佳具体实施例。在附图中：

图1显示小鼠j774a.1巨噬细胞连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养30分钟(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶(silicacrystal)培养24小时。培养基中il-1β量是由elisa测量。***表示相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.001。

图2显示小鼠j774a.1巨噬细胞连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养6小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)。细胞裂解液中nlrp3量及proil-1β是由西方墨点法测量。

图3显示人类thp-1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量是由elisa测量。**表示相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.01。

图4显示人类thp-1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中tnf-α量是由elisa测量。**及***表示分别相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.01及p<0.001。

图5显示人类thp-1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-6量是由elisa测量。*及***表示分别相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.05及p<0.001。

图6显示人类thp-1巨噬细胞连同或不加1μg/mllps培养5小时，再连同或不加人参皂苷m1培养30分钟(lps仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量是由elisa测量。**及***表示分别相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.01及p<0.001。

图7显示人类thp-1巨噬细胞连同或不加1μg/mllps培养5小时，再连同或不加人参皂苷m1培养30分钟(lps仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中tnf-α量是由elisa测量。**表示相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.01。

图8显示人类thp-1巨噬细胞连同或不加1μg/mllps培养5小时，再连同或不加人参皂苷m1培养30分钟(lps仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-6量是由elisa测量。***表示相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.001。

图9显示balf中il-1β量，其分离自对照组小鼠、二氧化硅结晶暴露的小鼠、口腔施用人参皂苷m1加上二氧化硅结晶暴露的小鼠，由elisa测量。***表示相比于二氧化硅结晶暴露组，显著差异等级p<0.001。

图10显示balf中il-6量，其分离自对照组小鼠、二氧化硅结晶暴露的小鼠、口腔施用人参皂苷m1加上二氧化硅结晶暴露的小鼠，由elisa测量。***表示相比于二氧化硅结晶暴露组，显著差异等级p<0.001。

图11显示balf中总蛋白浓度，其分离自对照组小鼠、二氧化硅结晶暴露的小鼠、口腔施用人参皂苷m1加上二氧化硅结晶暴露的小鼠，由蛋白检定染色测量。***表示相比于二氧化硅结晶暴露组，显著差异等级p<0.001。

图12显示balf中总细胞数量，其分离自对照组小鼠、二氧化硅结晶暴露的小鼠、口腔施用人参皂苷m1加上二氧化硅结晶暴露的小鼠，由血球计数移计数。***表示相比于二氧化硅结晶暴露组，显著差异等级p<0.001。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的技术性及科学性术语具有本发明领域的技术人员所能常规理解的意义。除非另有指明，本文所使用的下列术语具有赋予其的涵义。

本文所使用的冠词“一”与“一个”是指一个或多于一个(也即，至少一者)的该冠词语法对象。举例而言，“一组件”是指一个组件或多于一个的组件。

il-1β是一种重要的细胞激素，通过脂多糖(lps)活化巨噬细胞中的转录活性，快速地合成无活性的未成熟型态(il-1β的先驱因子，proil-1β)(hsuandwen,2002)。不像其他细胞激素，成熟il-1β的分泌需要通过蛋白酶-1(一种半胱氨酸蛋白酶)处理其先驱型态proil-1β(milleretal.,1997)。il-1β的释放是由包含蛋白酶-1的多蛋白复合物控制(称为nlrp3发炎体)，其控制蛋白酶-1活性和il-1β的释放(casseletal.,2011；jinandflavell,2010)。nlrp3发炎体完全的活化需要同时有一个来自lps刺激tlr4的启动信号及一个来自次级刺激物的活化信号，如单钠尿酸盐(二氧化硅结晶)，前者控制nlrp3及proil-1β表现及后者控制蛋白酶-1活性(martinonetal.,2009；schroderandtschopp,2010；davisetal.,2011；casseletal.,2011；jinandflavell,2010)。硅肺病及假性硅肺病是发炎性关节炎，其特征是二氧化硅结晶及脱水焦磷酸钙(cppd)晶体分别沉积在关节中造成的突然自体限制攻击的发炎反应。nlrp3发炎体与发炎疾病的发展间的密切连结越趋明显。结晶化的硅，又称二氧化硅(silicondioxide,sio2)发现于自然界中的沙或石英。虽摄入的二氧化硅无害且无毒，但吸入为小的二氧化硅结经确会导致肺部发炎。长期二氧化硅曝露会导致硅肺病，一种不可逆的肺纤维化疾病。研究曾揭示，二氧化硅通过活化nalp3发炎体诱发成熟il-1β分泌(hornungetal.,2008；peetersetal.,2014)。硅肺病的特征是迅速的嗜中性球内流进入肺部及il-1β的大量制造(huaux,2007)。检测到暴露于二氧化硅结晶的野生小鼠中有明显的肺部嗜中性球浸润。而暴露于二氧化硅结晶的il-1r-缺乏小鼠则无(hornungetal.,2008)。抑制二氧化硅结经引起的nlrp3发炎体活化及il-1β的产生会预防且缓和硅肺病。

本发明不可预期地发现，人参皂苷m1可减少巨噬细胞中二氧化硅引起的il-1β产生(图1)及lps引起的nlrp3及proil-1β表现(图2)。这些结果指出人参皂苷m1可以预防及缓和硅肺病。

因此，本发明提供一种在需要的个体治疗硅肺病的方法，其包含施用该个体有效量的人参皂苷m1，以治疗该个体。本发明也提供人参皂苷m1用于制造一种药物用于需要的个体治疗硅肺病。

具体而言，此治疗方法有效地抑制二氧化硅结晶引起的nlrp3发炎体活化。更具体地，此治疗方法有效地抑制二氧化硅结晶通过nlrp3发炎体引起的il-1β产生。

人参皂苷m1，即20-β-d-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol)，为本领域现有的皂素代谢物之一。人参皂苷m1的化学结构如下：

人参皂苷m1已知为原人参二醇型人参皂苷的代谢物之一，其经由人体肠道细菌的绞股蓝皂苷途径产生。人体服用人参后，可于血液或尿液中发现人参皂苷m1。人参皂苷m1可制备自人参植物，其是以本领域现有方法如真菌发酵方式进行，例如，中国台湾发明专利申请第094116005号(i280982)及美国专利第7,932,057号，其全部内容在此列入本案以作为参考数据。在部分具体实施例中，用于制备人参皂苷m1的人参植物包括五加科(araliaceae)、人参属(panaxgenus)，如人参(p.ginseng)及假人参(p.pseudo-ginseng)(也称作三七)。一般而言，人参皂苷m1的制备方法包括步骤：(a)提供人参植物材料(如叶或茎)的粉末；(b)提供真菌，以进行人参植物材料的发酵，其中发酵温度范围为20至50℃、发酵湿度范围为70至100％、ph值范围为4.0至6.0、及发酵时间范围为5至15天；(c)萃取及收集发酵产物；以及(d)自发酵产物分离20-β-d-吡喃葡萄糖基原人参二醇。

在本发明中，当以“分离”或“纯化”描述人参皂苷m1时，其应理解为非绝对的分离或纯化，而是相对的分离或纯化。举例而言，纯化的人参皂苷m1是指相比于其天然存在形式而言，纯度更高。在一具体实施例中，含有纯化的人参皂苷m1的制剂可包含的人参皂苷m1的含量为总制剂的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％(w/w)。应理解的是，当以某数字显示比例或剂量时，该数字通常包括其10％上下的范围，或更特别地，包括其5％上下的范围。

本文所使用的“个人”或“个体”等词包括人类或非人类动物，例如陪伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如牛、绵羊、猪、马等)、或实验动物(如大鼠、小鼠、天竺鼠等)。

本文所使用的“治疗”乙词是指施加或施用包括一或多种活性药剂的组合物至具有疾病、疾病的症状或病况、或疾病恶化的个体，其目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进、或影响疾病、疾病的症状或病况、疾病引发的失能、或疾病恶化。

本文所使用的“治疗有效量”一词是指在治疗的个体产生治疗功效的活性成分的量。举例而言，用于治疗硅肺病的有效量为可抑制二氧化硅结晶引起的nlrp3发炎体活化，更具体地，可以抑制二氧化硅结晶通过nlrp3发炎体引起的白介素-1β产生的剂量。

治疗有效量可因各种因素而有所变化，如施用途径及频率、接受该药物的个体的体重及物种、及施用目的。熟知本领域的技术人员可基于本文的公开、建立的方法、及其本身的经验确定各情况的剂量。举例而言，在部分具体实施例中，本发明所使用的人参皂苷m1口服剂量为每日10至1,000mg/kg。在部分实施例中，本发明所使用的人参皂苷m1口服剂量为每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg、或每日5至30mg/kg。此外，在本发明的部分具体实施例中，人参皂苷m1周期性施用一段时间，例如，每日施用达至少15天、一个月或二个月或更久。

依据本发明，人参皂苷m1可作为活性成分，以治疗硅肺病。在一具体实施例中，针对输送及吸收目的，治疗有效量的活性成分可与医药上可接受载体配制成适当形式的医药组合物。依据施用模式，本发明的医药组合物较佳为包含约0.1％重至约100％重的活性成分，其中百分比重是以组合物的总重量为基准计算。

本文所使用的“医药上可接受”一词是指载体与组合物的活性成分兼容，且较佳为可稳定该活性成分且对于接受治疗的个体具有安全性。该载体可为活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂、或介质。适用的赋形剂的一些示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、及甲基纤维素。本组合物可额外包含润滑剂如滑石、硬脂酸镁、及矿物油；润湿剂；乳化剂及悬浮剂；防腐剂如甲基及丙基羟基苯甲酸酯；增甜剂；以及调味剂。在施用至患者后，本发明的组合物可提供活性成分快速、持续、或缓慢释放的效果。

依据本发明，该组合物的形式可为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬剂、乳液、溶液、糖浆、软与硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液、及包装粉剂。

本发明的组合物可经由任何生理上可接受途径输送，例如，口服、非口服(如肌内、静脉、皮下、及腹腔)、经皮、栓剂、及鼻内方法。关于非口服施用，较佳为使用无菌水溶液，其可包含其他物质，如足以使溶液与血液等张的盐类或葡萄糖。水溶液可视需求适当地经缓冲(较佳为具ph值3至9)。本领域的技术人员可由现有的标准药理学技术在无菌条件下制备适合的非口服组合物。

依据本发明，含有以人参皂苷m1作为活性成分的人参皂苷m1或组合物可用于治疗罹患硅肺病或有罹患硅肺病风险的个体。具体而言，含有以人参皂苷m1作为活性成分的人参皂苷m1或组合物可施用至罹患硅肺病的个体或具有罹患硅肺病风险的个体，通过抑制二氧化硅结晶引起的nlrp3发炎体活化，以预防疾病发生或改善症状或推迟症状恶化。

本发明进一步以下列实施例说明，其目的旨在阐述而非局限。

实施例

1.材料及方法

人参皂苷m1，即20-β-d-吡喃葡萄糖基原人参二醇(20-o-β-d-glucopyranosyl-20(s)-protopanaxadiol)(以下命名为lchk168)，是以本领域现有的方法制备，如中国台湾专利申请第094116005号(i280982)及美国专利第7,932,057号所公开的。

小鼠巨噬细胞细胞株j774a.1及人类单和白血球细胞株thp-1购于美国菌种保存中心(rockville,md)并培养在添加10％以高温去活性的胎牛血清及2mml-谷氨酰胺的rpmi1640培养基(皆购于lifetechnologies,carlsbad,ca)于37℃、5％co2培养箱中。为了诱导单核球分化成巨噬细胞，thp-1以添加100nm佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(sigma-aldrich)培养在rpmi-1640中48小时。

图1中，j774a.1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps(来自大肠杆菌0111:b4，购于sigma,stlouis,mo)培养2小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时(皆购于invivogen,sandiego,ca)。培养基中il-1β量是由elisa测量。

图2中，j774a.1巨噬细胞(2x10⁶细胞/2ml培养基/盘)连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps(来自大肠杆菌0111:b4，购于sigma,stlouis,mo)培养6小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)。细胞裂解液中nlrp3及proil-1β是由西方墨点法测量。简言之，治疗后，细胞收集并在4℃裂解于包含蛋白酶抑制剂组合物(sigma,stlouis,mo)的裂解缓冲液中(25mmtris-氯化氢，ph7.5，100mm氯化钠，2mmedta，2.5mmegta，20mm氟化钠，1mm正钒酸钠，20mmβ甘油磷酸钠，10mm焦磷酸钠，0.5％tritonx-100)，然后完整的细胞裂解液以sds-page分离再电转至pvdf膜。将膜于阻断溶液中(5％脱脂牛奶在含0.1％tween20的磷酸盐缓冲盐水)室温反应1小时，再与nlrp3或proil-1β抗体于阻断溶液中室温反应2小时。以含0.1％tween20的pbs冲洗三次后，膜与hrp-共轭次级抗体于阻断溶液中室温反应1小时并以强化化学发光西方墨点法检测系统显色。

在图3-5中，thp-1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加人参皂苷m1培养30小时，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时(购自invivogen,sandiego,ca)。培养基中il-1β量(图3)、tnf-α(图4)及il-6(图5)是由elisa测量。

在图6-8中，thp-1巨噬细胞(1x10⁵细胞/500μl培养基/孔槽)连同或不加1μg/mllps培养5小时，再连同或不加人参皂苷m1培养30小时(lps仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量(图6)、tnf-α(图7)及il-6(图8)是由elisa测量

在图9-12中，动物实验皆在宜兰大学实验动物照护及使用委员会的伦理审议下进行，并符合nih实验动物照护及使用指南的伦理规范。雄性c57bl/6小鼠购于实验动物中心(台北，中国台湾)。小鼠饲养在22-24℃，相对湿度40-70％，12小时光暗循环，自由饮食饮水。第0、1及2天，每日以管喂方式口腔施用人参皂苷m1(60mg/kg体重)。硅肺病在第0天、第1天及第2天，每日以气管内暴露40μ悬浮200mg二氧化硅结晶的磷酸盐缓冲盐水(pbs)诱导(n＝6)。每一天小鼠在施用人参皂苷m1后，暴露于二氧化硅4小时，对照组小鼠接受pbs。在最后二氧化硅结晶暴露的四小时后，所有小鼠皆以断颈方式牺牲，支气管灌洗是以1ml1％bsa/pbs溶液重复滴注在吸出连续3次进行。支气管灌洗液(balf)中il-1β量及il-6量是以elisa分析。balf总细胞数量是以血球计数仪计数，而balf中蛋白质浓度是以蛋白质检定染色确定。

elisa方法，加入50μl生物素化抗体反应物及50μl培养基至预先以抗老鼠il-1β或il-6涂层的stripwell培养盘，培养于室温2小时。以冲洗缓冲液冲洗培养盘3次后，加入100μl稀释的hrp(辣根过氧化物酶)标记链霉亲和素浓缩物至各个孔槽并培养于室温30分钟。重复冲洗流程，然后加入100μl预先混合的四甲基联苯胺基底溶液至各个孔槽并显色于黑暗中室温30分钟。接着另外加入100μl提供的停止溶液至各个孔槽以停止反应，以微量盘分析仪测量培养盘在波长450nm的吸光值。

2.结果

2.1人参皂苷m1减少j774a.1巨噬细胞中二氧化硅结晶引起的il-1β产生

小鼠j774a.1巨噬细胞连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量是由elisa测量。如图1所示，结果显示人参皂苷m1减少il-1β分泌，并指出人参皂苷m1减少硅肺病相关的发炎反应。***表示相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.001。

2.2人参皂苷m1减少j774a.1巨噬细胞中lps引起的nlrp3及il-1β表现

j774a.1巨噬细胞连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养6小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)。细胞裂解液中nlrp3量及proil-1β量是由西方墨点法测量。如图2所示，结果显示人参皂苷m1减少lps活化的j774a.1巨噬细胞中nlrp3量及proil-1β量。

总而言之，我们的研究显示人参皂苷m1有效地减少巨噬细胞中二氧化硅结晶引起的il-1β产生(图1)及cppd引起的il-1β产生(图2)以及lps引起的nkrp3及proil-1β表现(图3)。这些发现指出人参皂苷m1有效地预防及缓和硅肺病。

2.3人参皂苷m1减少thp-1巨噬细胞中二氧化硅结晶引起的il-1β、tnf-α及il-6产生

为了确认人参皂苷m1抗发炎活性，人类thp-1巨噬细胞连同或不加人参皂苷m1培养30分钟，再连同或不加1μg/mllps培养5小时(人参皂苷m1仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量、il-6量是由elisa测量。如图3-5所示，结果显示人参皂苷m1减少il-1β产生(图3)、tnf-α产生(图4)以及il-6产生(图5)，并指出人参皂苷m1减少人类巨噬细胞中硅肺病相关的发炎反应。*及***表示分别相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.05、p<0.01及p<0.001。

2.4人参皂苷m1减少lps前处理的thp-1巨噬细胞中二氧化硅结晶引起的il-1β、tnf-α及il-6产生

为了探讨人参皂苷m1是否抑制二氧化硅结晶调控的nlrp3发炎体的活化信号，人类thp-1巨噬细胞连同或不加1μg/mllps前处理5小时，再连同或不加人参皂苷m1培养30分钟(lps仍然存在或缺少)，接着连同或不加200μg/ml二氧化硅结晶培养24小时。培养基中il-1β量、tnf-α、il-6量是由elisa测量。如图6-8所示，结果显示人参皂苷m1减少lps前处理的thp-1巨噬细胞中il-1β产生(图6)、tnf-α产生(图7)以及il-6产生(图8)，并指出人参皂苷m1通过抑制nlrp3发炎体的活化信号减少人类巨噬细胞中硅肺病相关的发炎反应。*及***表示分别相比于单独二氧化硅结晶组，显著差异等级p<0.01及p<0.001。

2.5人参皂苷m1减少活体内二氧化硅结晶引起的硅肺病

相比于对照组小鼠，气管内暴露二氧化硅结晶小鼠显著地提高小鼠balf中il-1β(图9)及il-6(图10)产生。口腔施用人参皂苷m1显著地减少小鼠balf中二氧化硅结晶引起的il-1β(图9)及il-6(图10)产生。二氧化硅结晶也显著地提高balf中总细胞浓度(图11)及总细胞数(图12)，而这些影响被人参皂苷m1显著抑制。

相信熟知本发明领域普通知识的技术人员可基于本文的阐述最大限度利用本发明，而无需进一步说明。因此，应理解到，所提供的说明书及权利要求书仅用于示例的目的，而非以任何方式局限本发明的范围。

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