本发明涉及：
-一种通过加热灭菌的新型无菌可注射水性组合物，至少包含交联的透明质酸或其盐和一种或多种脂肪酸，其特征在于：
о水的质量比例大于总质量的51％
о脂肪酸的质量比例小于总质量的45％
о粘弹性使得在0.7hz处的比率g”/g’小于0.70
-用于制备所述组合物的方法
-所述组合物在美容和治疗应用中的用途。
背景技术：
透明质酸是由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺的重复二糖单元形成的多糖。它在结构上是线性的，并且不是物种特异性的。透明质酸广泛分布在活的人类和动物中，它实现许多生物功能，例如控制水合水平和保持液体或组织的粘弹性。特别是，它在滑液、眼睛的玻璃体和皮肤中以高浓度存在。一个70公斤的人拥有大约15克的透明质酸，其中一半包含在皮肤中，而且这个量随着年龄而降低。
透明质酸水凝胶已被广泛应用于美容和医学领域多年。特别是，这些凝胶通常被注入：
-至眼睛，在眼科手术过程中，以维持眼内空间并保护眼睛组织
-至关节，在关节病的情况下，以补充缺乏的滑液并临时恢复所述生物液体的软骨保护性能
-至皮肤内或皮下，以填充皱纹或增加面部或身体某些区域的体积
透明质酸在生物体内半衰期短(不到1周)。
在许多美容和医学应用中，它以其天然形式注入患者体内，即它不交联和/或化学改性。
对于其他应用，它以通过交联稳定的形式施用于患者。交联显著增加了透明质酸在体内的寿命(也称为持久性)，但它也改变了其生物力学/流变学性质，特别是通过使其更具弹性，从而增加其一旦注入目标组织后产生体积的能力。
最近的研究(例如，farkas等人，plastreconstsurgglobopen，2013年5月7日，1-8)已经显示衰老涉及显著的体积损失，主要与面部和身体中的脂肪间隙的缩小有关。
在例如艾滋病的疾病中也观察到这些体积损失，抗逆转录病毒疗法会诱发非常严重的脂肪代谢障碍。
无论是治疗衰老还是治疗疾病，目前最常用于恢复和/或增加面部或身体的体积的解决方案如下：
-将自体脂肪注入目标解剖区域。该技术具有提供长期结果(可能接近永久性)的优点，但需要手术(一种侵入性手术，需要从身体的一个区域采集脂肪并将其重新植入另一个区域)，并且相当大的一部分的这种脂肪不能承受转移(一般来说，手术后几个月观察到约20％-40％的体积损失)
-注射填充物，特别是基于交联的透明质酸。这种非侵入性且快速执行的技术可用于填充体积并且持续3个月至18个月以上的时间，取决于治疗的区域和所选产品
因此，交联的透明质酸在美容和医学领域中起着关键作用，因此本领域技术人员总是寻求通过赋予其更好的生物力学和/或持久性特性同时保留非常高的安全度来改善该分子的性能。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种通过加热灭菌的新型无菌可注射水性组合物，该组合物至少含有交联的透明质酸或其盐以及一种或多种脂肪酸；凝胶形式的所述组合物特别地：
-通过提高其被整合/植入组织中的能力来提高注射的水凝胶的安全性
-通过改善特别是随着时间的推移产生更多体积的能力，显著增加注射的水凝胶的性能
因此，根据本发明的第一方面，本发明涉及一种通过加热灭菌的新型无菌可注射水性组合物，该组合物至少含有交联的透明质酸或其盐和一种或多种脂肪酸；凝胶形式的所述组合物含有大于51％(质量)的水和小于45％(质量)的脂肪酸；所述组合物具有粘弹性，使得0.7hz处的比率g”/g’小于0.70。
根据本发明，组合物含有透明质酸或其盐，特别是其生理学上可接受的盐，例如钠盐、钙盐、锌盐、钾盐，有利地为钠盐。透明质酸可以是动物来源的或通过细菌发酵获得。它可以具有从几道尔顿到几百万道尔顿的分子量，有利地从大约0.01到500万道尔顿，更有利地从大约0.1到350万道尔顿。
根据本发明的一个方面，组合物可以基于透明质酸衍生物，即基于通过透明质酸分子的化学改性或任何其它改性获得的分子。
根据本发明，透明质酸或其盐的总浓度为0.001至70mg/ml之间，0.01至50mg/ml之间，1至40mg/ml之间，5至35mg/ml之间，8至33mg/ml之间，9至30mg/ml之间，10至29mg/ml之间，11至28mg/ml之间，12至27mg/ml之间，13至26.5mg/ml之间，有利地为14至26mg/ml之间。
根据本发明，包含在组合物中的透明质酸被交联，优选根据现有技术中描述的交联技术交联。参与交联的交联剂可以是相同的或不同的。它们通常是各种类型的双官能或多官能交联剂，它们可以选自例如二乙烯基砜、双官能或多官能环氧化物、碳化二亚胺和甲醛。优选地，选择双官能或多官能环氧化物类的试剂，特别是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、二环氧辛烷或1,2-双-(2,3-环氧丙基)-2,3-乙烯。bdde的使用是最特别优选的。交联温度通常在约15℃和60℃之间，交联时间通常为几个小时，有利地为从1小时到约24小时。
根据本发明，组合物包含小于总质量的45％，小于总质量的40％，小于总质量的35％，小于总质量的30％，小于总质量的25％，小于总质量的20％，小于总质量的18％，小于总质量的17％，小于总质量的16％，小于总质量的15％，小于总质量的14％，小于总质量的13％，小于总质量的12％，小于总质量的11％，小于总质量的10％，小于总质量的9％，小于总质量的8％或小于总质量的7％的质量比例的脂肪酸。
根据本发明，组合物含有一种或多种脂肪酸。例如，可以是以下脂肪酸：
-饱和脂肪酸：丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十八烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十四烷酸、三十五酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十七八烷酸、三十九烷酸、四十烷基酸、二辛酸。有利地，丁酸(通常称为丁酸)、己酸(通常称为己酸)、辛酸(通常称为辛酸)、癸酸(通常称为癸酸)、十二烷酸(通常称为月桂酸)、十四烷酸(通常称为肉豆蔻酸)、十六烷酸(通常称为棕榈酸)和十八烷酸(通常称为硬脂酸)。
-单不饱和脂肪酸：十二碳烯酸、十四碳烯酸、十六碳烯酸、十八碳烯酸、二十碳烯酸、二十二碳烯酸、二十四碳烯酸。有利地，选择十六碳烯酸(通常称为棕榈油酸)和十八碳烯酸(通常称为油酸)。
-多不饱和脂肪酸：十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸。有利地，选择十八碳二烯酸(通常称为亚油酸)、十八碳三烯酸(通常称为α-亚油酸)和二十碳四烯酸(通常称为花生四烯酸)。
根据本发明的一个方面，脂肪酸的总浓度大于0.0001mg/ml，大于0.001mg/ml，大于0.01mg/ml，大于0.1mg/ml，大于1mg/ml，大于10mg/ml，大于20mg/ml，大于30mg/ml，大于40mg/ml，大于50mg/ml，大于60mg/ml，大于70mg/ml，大于80mg/ml，大于90mg/ml，大于100mg/ml，大于110mg/ml，大于120mg/ml，大于130mg/ml。
根据本发明，组合物的主要成分是水(按质量比例)，由此本发明的新型组合物的限定词为“水性组合物”。本发明组合物中的水的质量大于总质量的51％，有利地大于总质量的60％，有利地大于总质量的70％，有利地大于总质量的75％，有利地大于总质量的80％，有利地大于总质量的85％。特别有利地使用缓冲溶液以更好地控制制剂在整个货架期内的ph和摩尔渗透压浓度。例如，可以使用基于氯化钠和磷酸根离子的缓冲液。
根据本发明，组合物是无菌的。根据现有技术中描述的技术对其进行灭菌。有利地通过加热进行灭菌，优选通过湿热(也称为蒸汽高压灭菌)进行灭菌。
优选地，通过湿热进行的灭菌在高于100℃，有利地高于110℃，有利地高于120℃的温度下进行。通常，灭菌时间可以从几秒到几分钟。例如，可以采用以下湿热灭菌周期：121℃20分钟或125℃7分钟或127℃4分钟或130℃3分钟。
重要的是要注意，有利地，选择加热灭菌，因为它给予选定的组合物非常高的无菌度，这进而为治疗的患者提供了高度的安全性。
根据本发明，组合物是可注射的。它优先包装在注射器或小瓶中，以便易于通过针或套管给药。
根据本发明，组合物具有粘弹性流变性质，使得在0.7hz频率下的比率g”/g’(＝tanδ)小于0.70，优选小于0.65，更优选小于0.60，更优选小于0.55，更优选小于0.50，更优选小于0.45，更优选小于0.40，更优选小于0.35。
本领域技术人员公知的用于表征基于水凝胶的交联的透明质酸的模量g’(＝弹性模量)和g”(＝粘性模量)(例如，sundaram等人，plastreconstsurg，2013，132：5s-21s)使用流变仪来测量，例如受控应力流变仪，在25℃的温度下以4cm的几何形状，在变形处于线性粘弹性范围内的情况下进行频率扫描。
根据本发明，脂肪酸分子以均匀或相对均匀的方式(脂肪酸微滴在水凝胶中的分散体)分散在水凝胶中，而不形成双相组合物(即其中水相和有机相彼此完全分离)(例如，当观察到水凝胶内有机相的大区域聚结时，或当有机相完全位于水凝胶的水相之上时)。
根据本发明的一个优选方面，本发明的组合物不包含用于稳定水中的脂肪酸混合物的表面活性剂；这些额外的分子可能降低此类可注射制剂所需的高度安全性。
根据本发明的一个方面，组合物还包括含有一种或多种脂肪酸和/或所设想的制剂感兴趣的任何其它物质的脂质体或囊泡。“感兴趣的物质”旨在指能够向组合物和/或施用组合物的生物体提供益处的任何分子。
脂质体和囊泡是小球形囊泡，其壁由一个或多个脂质层组成，含有水性内部空间。它们是被感兴趣的，主要是因为它们可以通过包含在脂质膜中或通过包封在内膜中来矢量化物质。例如，可以在其中包封非常不同溶解性(亲水性，两亲性或亲脂性)的活性成分。
脂质体是从天然两亲分子(磷脂或类固醇)获得的，而囊泡由合成的非离子两亲分子(脂质甘油)组成。它们的结构是微观的(0.01微米到几微米)。
根据本发明的一个方面，本发明的组合物含有一种或多种天然或合成来源的任选具有药理作用的活性物质，例如单独或组合的抗氧化剂、抗炎剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗癌剂、局部麻醉剂、蛋白质、激素。这些活性物质分散在水凝胶中，或者接枝到水凝胶的一种或多种聚合物上，或者包含/包封在分散在水凝胶中的脂质体/囊泡中，或者包含/包封在另一种本身分散在水凝胶中的材料中。
根据本发明的一个方面，脂肪酸家族被拓宽为生物可接受的脂质，即生物体中具有高度生物相容性的脂质。
因此，根据本发明的一个方面，通过加热灭菌的新型无菌可注射水性组合物至少包含交联的透明质酸或其盐和一种或多种生物可接受的脂质，其特征在于：
-水的质量比例大于总质量的51％
-脂质的质量比例小于总质量的45％
-粘弹性质使得在0.7hz处的比率g”/g’小于0.70
根据本发明的有利方面，本发明的组合物包含分散在水凝胶内的利多卡因。
根据本发明的一个方面，本发明的组合物含有一种或多种生物(例如细胞、富集的血小板、基因、dna片段或生长因子)来源的化合物。这些化合物优选分散在水凝胶中，但它们也可以接枝到水凝胶的一种或多种聚合物上，或者包含/包封在分散在水凝胶中的脂质体/囊泡中，或者包含/包封在本身分散在水凝胶内的另一种材料中。
根据本发明的一个方面，本发明的组合物含有分散在水凝胶的交联基质内的聚合物。例如，聚合物可以是多糖、聚酯、聚酸酐、聚磷腈、聚-ε-己内酯、聚乳酸及其衍生物、聚乙烯酸、聚丙烯酰胺、n-乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸聚合物以及生物可接受的衍生物的家族。
根据本发明的一个方面，本发明的组合物含有分散在水凝胶的交联基质内的矿物质。例如，矿物质可以是羟基磷灰石或磷酸钙，如β磷酸三钙。
根据本发明的一个方面，在施用于患者之前，将本发明的组合物与一种或多种其它优先灭菌物质混合，这些物质可以为生物体提供益处。由最终使用者即由专业人员或授权人员通过使用一个或多个混合装置的合适方法进行混合，从而允许制备令人满意的混合物并保持无菌。例如，最终使用者可通过以下方式混合本发明的水凝胶和一种或多种化合物(如脂肪酸、脂质、活性物质、生物制剂或矿物质)：
-在两个容器(一个填充本发明的水凝胶，另一个填充待分散在水凝胶中的化合物)之间来回运动，其中所述容器可以是例如注射器
-同时挤出两个容器(一个填充本发明的水凝胶，另一个填充待分散在水凝胶中的化合物)的内容物，以便在施用于患者之前将各种化合物组合和/或在另一容器中混合
本发明公开的新型组合物的目的是通过提供以下益处来改善可注射的交联的透明质酸基产品的安全性和临床表现/功效：
-将本发明的组合物更好地整合在处理区域的植入部位。实际上，与现有技术的交联的透明质酸基制剂相比，本发明的水性组合物含有脂肪酸(分散在水凝胶中的有机相)，这使其在生理学上更接近周围组织，特别是当将产品注射到具有高脂肪密度的区域时(例如，在面部皮下注射，特别是注射以增加脸颊或下巴的体积)。因此，本发明的组合物有利地注射到皮下组织和/或部分或完全含有脂肪的任何组织中。
已知交联的透明质酸基凝胶的注射具有高度的安全性。本发明的解决方案凭借其增强的整合入周围组织的能力，通过减少注射后副作用能够显著改善这种安全度：由于身体更有利地识别植入物而导致的炎症更少，因此例如，较少的注射后发红和/或疼痛
-本发明的组合物给接近和/或接触脂肪酸的细胞提供更好的环境；脂肪酸可能储存在脂肪细胞内，从而诱导细胞体积的增加，和/或被用作细胞的原料/营养，这可以帮助刺激/加强它们
-由于结合了交联的透明质酸产生体积的能力和脂肪酸刺激细胞的能力的协同作用，治疗的更好的耐用性/持久性。应该注意的是，如果脂肪酸被部分或完全包封(例如在脂质体或囊泡中)以允许它们随时间释放，则这种协同作用可能会潜在地增加/优化
-由于存在由脂肪酸代表的有机部分，所以能够更好地将有机分子分散在本发明的组合物中(与不含脂肪酸的基于交联的透明质酸的水凝胶相比)；这可以例如使得可以将更多的亲脂性分子引入产品中和/或使其更好的均匀性成为可能
-由于注射区域的炎症减轻，限制注射后产生水肿的不良现象(基于交联的透明质酸的治疗的众所周知的副作用)的可能性(由于产品更好地整合在组织中)和/或产品在体内在组织中溶胀的能力较低(存在可限制交联的透明质酸在体内捕获水的能力的有机部分，因此涉及凝胶在处理区域的较低溶胀)
根据本发明的一个方面，还需要指出的是，脂肪酸可以被包封在脂质体/囊泡中，同时分布在脂质双层中或水相中。
在将一种或多种脂肪酸和/或任何其他感兴趣的物质包封在脂质体/囊泡中的情况下，可以提出以下益处：
-维持交联的透明质酸凝胶内的感兴趣物质的完整性：事实上，由于感兴趣的物质在这些脂质体/囊泡中的整合，感兴趣的物质不被降解/氧化，和/或不与交联的透明质酸基质反应，无论是在本发明的组合物的生产过程期间，还是在已经注射组合物并且脂质体/囊泡已经从水凝胶释放后与靶细胞接触期间
-随着时间的延长释放：由于交联的透明质酸三维网络内的空间位阻，纳米/微米尺寸的脂质体/囊泡(包封感兴趣的物质)将从水凝胶缓慢释放：因此，通常，包封的感兴趣的物质相对于该物质在交联的透明质酸基质中的简单分散而言在较长时间内释放：因此期望的生物效应(例如刺激成纤维细胞和/或脂肪细胞型细胞)随着时间的推移更显著
-感兴趣的物质的靶向：一旦从交联的透明质酸基质释放，脂质体/囊泡将被去除(通过吞噬作用)，并且这种胞吞作用将增加感兴趣的物质(例如脂肪酸)在细胞水平(溶酶体)的浓度，从而使感兴趣的物质的作用对靶细胞更有效
-溶解难溶于水的感兴趣物质(如脂肪酸)；因此脂质体/囊泡使得仅用一个水相来保留产物成为可能。事实上，脂质体/囊泡由于其囊泡表面亲水性而能够促进交联的透明质酸三维基质中的感兴趣物质的整合和均化
令人惊讶的是，注意到本发明的组合物凭借其特定的特征，特别是其特定的流变/机械特性是重要的：
-虽然由水(主要成分)和脂肪酸组成，但即使在没有乳化剂的情况下也具有均匀的肉眼可见外观。
脂肪酸(有机相)分散在水凝胶(水相)中，由此形成具有均匀肉眼可见外观的凝胶，而在显微镜下不均匀。
不希望受限于解释，可以假定在本发明的条件下(特别是g”/g’<0.70)，交联的透明质酸起到水包油乳液的稳定剂的作用，
-即使在加热灭菌的情况下也形成稳定的乳液，甚至在120℃以上持续几十分钟的灭菌周期
-形成在室温下几个月时间稳定的乳液
-具有非常缓慢的脂肪酸从水凝胶中释放的动力学；一个可能被描述为延迟的释放。事实上，尽管本领域技术人员熟知分散在交联的透明质酸基凝胶中的感兴趣的小分子(甚至高于5000g/mol的更大分子)具有数小时的释放动力学(利多卡因或多元醇(如甘露糖醇或甘油)的情况下)，因此实质上限制了它们的中期或长期临床功效；分散在本发明凝胶中的脂肪酸在特别长的时间内释放。该特征(延迟释放)赋予本发明的水凝胶相当大的优势，并且其不依赖于限制性且昂贵的接枝和/或微胶囊化技术而获得。不希望受到解释的束缚，可以认为加热灭菌通过在交联的透明质酸和脂肪酸之间产生特定的亲和力而对本发明的组合物起到有益的作用；亲和力促进脂肪酸从水凝胶中长期延迟释放。
这些令人惊讶的事实在实例中说明。
令人惊奇的是，注意到本发明的组合物具有类似于不含脂肪酸的交联的透明质酸基组合物的流变学/机械性质(粘弹性模量g’和g”)和凝聚性质也是重要的。这些性质被描述为在可注射交联的透明质酸基产品(例如，sundaram等人，plastreconstsurg，2013,132：5s-21s)的安全性和临床表现的文献中是关键的。换句话说，在本发明的条件下即使以相对大的量添加脂肪酸也对水凝胶的流变学/机械和凝聚性几乎没有影响。这一点特别令人感兴趣，因为它可以为从业者提供具有脂肪酸的可注射产品，其具有类似于目前已知的性质，因此可用于治疗相同的适应症，同时旨在提高安全性和临床表现(例如通过提供改善的长期临床功效，如创建组织体积)。
这个令人惊讶的事实也在实例中说明。
同样重要的是要指出，本发明的组合物具有与不含脂肪酸的现有技术组合物相似的对酶和自由基降解(透明质酸基水凝胶的体内降解的关键因素)的抗性。如前所述，该特征是有利的，因为它可以为从业者提供可以施用于与现今治疗的那些相同的适应症的产品，同时在本发明的条件下提供由交联的透明质酸和脂肪酸的组合给予的额外益处。
这个令人惊讶的事实也在实例中说明。
令人惊讶地，需要提及的是，本发明的组合物具有与不含脂肪酸的交联的透明质酸基组合物类似的推出力(＝将凝胶从其注射器包装通过附接的针或套管排出所需的力)。换言之，在本发明的条件下即使以相对大的量添加脂肪酸也对水凝胶的挤出性能几乎没有影响。这种观察结果是特别令人惊讶的，因为本领域技术人员将会预期本发明的组合物相对于不含脂肪酸的交联的透明质酸基组合物获得较低的推出力，并知道脂肪酸的润滑性。这一点也是令人感兴趣的，因为它可以保持注射医师熟悉的合适的推出力，从而避免过量注射(如果推出力由于较小推/挤压阻力而较低)，因此限制了与施用的产品的过量剂量相关的不希望的效果。
这个令人惊讶的事实也在实例中说明。
另外，强调与本发明的组合物的安全性和临床表现有关的以下协同效应是重要的：
-在本发明的条件下，交联的透明质酸允许脂肪酸保留在处理区域以达到最长期的功效(而如果在没有透明质酸的溶液中进行注射，则脂肪酸立即扩散)，而脂肪酸进而改善了在部分或完全由脂肪组成的环境中交联的透明质酸(其是弹性/刚性和亲水性的)的生物整合潜力。
-在本发明的条件下，交联的透明质酸凭借其弹性/刚性(小的g”/g’比率，与组合物的高度弹性性质同义)能够通过压缩在处理区域的细胞上产生机械应力，特别是在成纤维细胞和/或脂肪细胞上。如文献中所述，机械应力刺激细胞，从而使它们特别能促进和/或产生更多对人体有益的化合物，例如通过产生更多的细胞外基质的关键组分(胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸等)，这进而增强和/或延长了注射的产品的长期效果。此外，推入细胞表面的脂肪酸的存在通过促进细胞刺激进一步增强了上述现象，特别是通过作为原料/营养物和/或作为细胞产生有益化合物的催化剂或通过相当简单地储存在脂肪细胞内(其然后在期望的临床效果的方向上产生细胞体积的增加，即，处理组织的体积的增加)。
根据其第二方面，本发明涉及用于制备上述新型无菌可注射组合物的方法。
制备本发明的组合物的方法的特征在于以下连续步骤：
a)制备基于交联的透明质酸或其盐的水凝胶
b)用混合操作将脂肪酸添加到水凝胶中
c)灭菌
步骤(a)通常开始于溶解透明质酸，然后使用交联剂交联透明质酸，并且通常通过纯化所获得的水凝胶而结束。
透明质酸的交联的步骤被理解为指透明质酸链通过共价键彼此桥接的步骤。通常，当交联剂与透明质酸接触时开始透明质酸的交联的步骤，并且当本领域技术人员认为透明质酸链通过交联剂的桥接的反应动力学达到可忽略的水平时结束。
水凝胶的纯化进而允许在交联后从制备的凝胶中去除不需要的分子，特别是交联残基。该纯化通过本领域技术人员熟知的技术进行，例如透析浴，通过连续水流洗涤或通过沉淀。
交联的透明质酸基水凝胶的制备有利地根据现有技术中描述的方法进行。例如，可以提及用于生产交联的透明质酸基水凝胶的申请wo97/04012、wo2004/092222、wo2005/085329和wo2009/071697。
步骤(b)包括向预先制备的交联的透明质酸基水凝胶中加入一种或多种脂肪酸。
为了促进交联的透明质酸基水凝胶中的脂肪酸的均化，应该注意的是，这些脂肪酸可以在加入至凝胶之前加热，特别是当这些脂肪酸在室温下为固体形式时，从而使它们转变成可以分散在水凝胶中的液体。
例如，可以通过以下方式执行此添加：
-通过将脂肪酸(纯态)直接添加到水凝胶中
-或者通过将脂肪酸包封在例如脂质体/囊泡中
-或者首先制备含有脂肪酸的溶液(包封或不包封)
-或者通过添加其上已经接枝了脂肪酸的另外的化合物
在脂肪酸包封在脂质体/囊泡中的情况下，后者在加入交联的透明质酸凝胶之前制备。
可以设想几种用于制备本发明的脂质体/囊泡的方法：
-采用磷脂的机械分散步骤的传统方法，例如超声处理、挤出或微流化
-基于脂质膜的水合作用的方法(首先将脂质和待包封的感兴趣分子溶解在有机溶剂中，然后蒸发溶剂，然后将获得的膜在水溶液中水合)
-基于从乳液中除去有机溶剂的方法(反相蒸发)
-依靠从混合胶束溶液中去除去污剂的方法
-基于预先形成的脂质体的转化的方法，如冻干/补液或冷冻/解冻
脂肪酸的这种添加伴随着混合操作，其目的是使水凝胶内的脂肪酸均匀化。混合可以在添加步骤期间和/或之后完成。
混合操作通过本领域技术人员熟知的技术进行，例如通过在混合容器中机械混合。
混合可以在高于室温的温度和/或在压力下和/或在超声波下进行，以优化组合物的均化。
步骤(c)包括通过本领域技术人员公知的技术对组合物进行灭菌；有利地通过高压灭菌来进行灭菌。
用于生产本发明的无菌可注射水性组合物的本发明的有利方法包括至少以下步骤：
-制备透明质酸的水溶液
-透明质酸的交联
-水凝胶的纯化，例如通过在生理盐水中透析
-通过混合操作添加一种或多种脂肪酸
-在注射器中包装
-灭菌
用于生产本发明的无菌可注射水性组合物的本发明的另一有利方法包括至少以下步骤：
-制备透明质酸的水溶液
-透明质酸的交联
-水凝胶的纯化，例如通过在生理盐水中透析
-将一种或多种脂肪酸掺入脂质体/囊泡中并通过混合操作将这些脂质体/囊泡添加至水凝胶
-在注射器中包装
-灭菌
根据其第三方面，本发明涉及上述新型无菌可注射水性组合物在人或动物中的用途，用于美容或治疗应用。
本发明的无菌可注射水性组合物特别地用于：
-填充体积
-在特定组织中产生空间，从而促进其最佳功能
-替换缺陷的生理液体或组织
-刺激或促进组织再生
-保湿和保护组织
-传递能够为生物体提供益处的物质，特别是活性物质和/或生物制剂
作为实例，可以提及在以下情况下水凝胶的用途：
-配制可通过皮内或皮下途径注射的组合物，以增强皮肤质量或填充皱纹或恢复面部(颧骨、下巴、嘴唇、鼻子等)或身体的体积
-配制用于牙科用途的可注射组合物，例如用于填充牙周袋和/或用于刺激牙齿周围的组织再生
-配制可通过眼内途径注射的组合物，特别是用于白内障、青光眼、老花眼或玻璃体手术期间的应用
-配制可通过关节内途径注射的用于整形术或风湿病学中的组合物，特别是在用于治疗关节病的缺乏滑液的粘性补充的情况下，还包括骨重建或软骨再生
-配制在泌尿科用于治疗尿或大便失禁的可注射组合物
-配制在纤维化治疗或用于改善伤口愈合的情况下的用于普通药物或手术的可注射组合物
-配制允许活性物质和/或生物制剂受控释放用于各种医学应用的可注射药物组合物
具体实施方式
实例
现在将通过以下实例以非限制性方式来说明本发明。
以下实例中使用的透明质酸钠、脂肪酸和所有其他化合物都是高纯度的。
通过测量以13.5mm/min的速率通过27g1/2针将标准注射器中包含的组合物推出所需的力(以牛顿计)测量凝胶挤出。
使用受控应力流变仪(taar2000)和具有1000微米间隙尺寸的4cm-2°圆锥体/平板几何形状在25℃下测量凝胶的流变性质(测量弹性模量g’和tanδ＝g”/g’。
实例1：制备本发明的凝胶g1和凝胶ref1(比较)
称出1.23g透明质酸钠(naha)粉末，其分子量大约等于1.5mda并且水的含量为8.2％，并且添加11.3g的0.25nnaoh水溶液。粉末水合持续1.5小时，用刮刀定期手动均化。在反应混合物中加入0.63g在0.25n苏打水中稀释至1/5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)溶液，然后机械均化15分钟，然后浸入50℃的恒温浴中2.5小时。将含有hcl的磷酸盐缓冲液加入到获得的网状物中以实现ph＝7.3和透明质酸浓度等于25mg/ml。在该溶液中使凝胶在室温下溶胀24小时；在该时间结束时，用刮刀手动均化10分钟，然后使用基于纤维素的膜(截留值＝10,000da)在磷酸盐缓冲液中通过透析纯化24小时。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。因此获得凝胶ref1a。ref1a的透明质酸浓度为19.9mg/ml。
将2.7g棕榈油酸加入到15.0g凝胶ref1a中。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。由此获得凝胶gel1a。
将凝胶ref1a和gel1a包装在1ml注射器中，然后在121℃的高压灭菌器中灭菌10分钟。由此获得凝胶ref1和gel1(＝本发明的凝胶)，由ref1a和gel1a衍生的灭菌凝胶。
实例2：制备本发明的凝胶g21和凝胶ref21(对比)
称出8.31g透明质酸钠(naha)粉末，其分子量大约等于1.7mda并且水的含量为4.9％，并加入73.5g的0.25nnaoh水溶液。粉末的水合持续1.5小时，用刮刀定期手动均化。在反应混合物中加入4.37g在0.25n苏打水中稀释至1/5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)溶液，接着机械均化15分钟，然后浸入50℃的恒温浴中2.5小时。将含有hcl的磷酸盐缓冲液加入到获得的网状物中以实现ph＝7.3和透明质酸浓度等于30mg/ml。在该溶液中使凝胶在室温下溶胀24小时；在该时间结束时，用刮刀手动均化10分钟，然后使用基于纤维素的膜(截留值＝10,000da)在磷酸盐缓冲液中通过透析纯化24小时。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。由此获得凝胶ref2a。ref2a的透明质酸浓度为25.2mg/ml。
将2.3克油酸加入到45.0克凝胶ref2a中。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。因此获得凝胶gel2a1。
将2.3g磷酸盐缓冲液加入到45.0g凝胶ref2a中。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。由此获得凝胶ref2a1。
将凝胶ref2a1和gel2a1包装在1毫升注射器中，然后在121℃的高压灭菌器中灭菌10分钟。由此获得凝胶ref21和gel21(＝本发明的凝胶)，由ref2a1和gel2a1衍生的灭菌凝胶。
实例3：制备本发明的凝胶g22和凝胶ref22(对比)
向40.0g凝胶ref2a(实例2中制备)中加入5.1g磷酸盐缓冲液中的25mg/ml透明质酸钠(分子量＝1.7mda，水的含量＝4.9％)的溶液，然后手动混合5分钟。然后加入8.1g油酸，并将该凝胶用刮刀手动混合10分钟。由此获得凝胶gel2a2。
向40.0g凝胶ref2a(实例2中制备)中加入5.1g磷酸盐缓冲液中的25mg/ml透明质酸钠(分子量＝1.7mda，水的含量＝4.9％)的溶液，然后用刮手动混合5分钟。然后加入8.1g磷酸盐缓冲液，并将该凝胶用刮刀手动混合10分钟。由此获得凝胶ref2a2。
将凝胶ref2a2和gel2a2包装在1ml注射器中，然后在131℃的高压灭菌器中灭菌20分钟。由此获得凝胶ref22和gel22(＝本发明的凝胶)，由ref2a2和gel2a2衍生的灭菌凝胶。
实例4：制备凝胶g23(在本发明中未被考虑的凝胶，因为在0.7hz处g”/g’>0.70)和凝胶ref23(对比)
向30.0g凝胶ref2a(实例2中制备)中加入15.0g磷酸盐缓冲液中的25mg/ml透明质酸钠(分子量＝1.7mda，水的含量＝4.9％)的溶液，然后用刮刀手动混合10分钟。然后加入5.4g油酸，并将该凝胶用刮刀手动混合10分钟。由此获得凝胶gel2a3。
向30.0g凝胶ref2a(实例2中制备)中加入15.0g磷酸盐缓冲液中的25mg/ml透明质酸钠(分子量＝1.7mda，水的含量＝4.9％)的溶液，然后用刮刀手动混合10分钟。然后加入5.4g磷酸盐缓冲液，并用刮刀将凝胶手动混合10分钟。由此获得凝胶ref2a3。
将凝胶ref2a3和gel2a3包装在1ml注射器中，然后在131℃的高压灭菌器中灭菌40分钟。由此获得凝胶ref23和gel23，从ref2a3和gel2a3衍生的灭菌凝胶。
实例5：制备本发明的凝胶g31
称出2.77g透明质酸钠(naha)粉末，其分子量大约等于1.7mda并且水的含量为4.9％，并加入27.1g0.25nnaoh水溶液。粉末的水合持续1.5小时，用刮刀定期手动均化。在反应混合物中加入0.95g在0.25n苏打水中稀释至1/5的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)溶液，接着机械均化15分钟，然后浸入50℃的恒温浴中3小时。将含有hcl的磷酸盐缓冲液添加到获得的网状物中以实现ph＝7.3并且透明质酸浓度等于25mg/ml。在该溶液中使凝胶在室温下溶胀24小时；在该时间结束时，用刮刀手动均化10分钟，然后使用基于纤维素的膜(截留值＝10,000da)在磷酸盐缓冲液中通过透析纯化24小时。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。因此获得凝胶ref3a。ref3a的透明质酸浓度为18.6mg/ml。
然后制备含有油酸的脂质体。为此目的，使用脂质膜水合然后超声处理的常规技术。
使用的磷脂分别为1.0/0.5/0.1摩尔比的磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰肌醇(pi)和磷脂酰丝氨酸(ps)。
将4.3g油酸和27.8g上述脂质混合物溶于氯仿/甲醇混合物(50g，2.7:1摩尔比)中。然后在氩气存在下，在室温下用旋转蒸发器蒸发除去溶剂，然后在真空烘箱中干燥具有油酸的磷脂18小时，从而产生膜。
然后通过加入磷酸盐缓冲液并摇动使含有油酸的磷脂膜水合。因此形成多层脂质体，包封油酸。它们的数均直径(通过动态光散射测量)在450-1200nm的范围内。
在冰水浴中以10khz的功率持续10分钟的超声处理步骤(浸入多层脂质体混合物中的超声波探针)以用于均化含有油酸的脂质体溶液，同时将脂质体的直径降至数均值在80至250nm之间。
将预先制备的13.2g含有油酸的脂质体溶液加入到40.0g凝胶ref3a中。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。由此获得凝胶gel3a1。
将凝胶gel3a1包装在1ml注射器中，然后在121℃的高压灭菌器中灭菌20分钟。由此获得凝胶gel31(＝本发明的凝胶)，从gel3a1衍生的灭菌凝胶。
实例6：制备本发明的凝胶g32
首先制备含有棕榈酸的脂质体。
为此目的，使用脂质膜水合然后挤出的常规技术。
使用的脂质分别为1.0/0.2/0.45摩尔比的磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰甘油(pg)和胆固醇(c)。
将10.5g棕榈酸(首先加热以将室温下固体形式的脂肪酸转化为液体)和30g上述脂质混合物溶于氯仿/甲醇混合物(50g，2.7:1摩尔比)中。然后在氩气存在下，在室温下用旋转蒸发器蒸发除去溶剂，然后在真空烘箱中干燥具有棕榈酸的磷脂15小时，由此产生膜。
然后通过加入磷酸盐缓冲液和摇动使磷脂和棕榈酸的膜水合。由此形成多层脂质体，包封棕榈酸。它们的数均直径(通过动态光散射测量)在370至1050nm的范围内。
使用在37℃的温度下在0.2微米聚碳酸酯膜(
将3.8g预先制备的含有棕榈酸的脂质体溶液加入到40.0g凝胶ref3a(实例5中制备)中。用刮刀手动将凝胶混合10分钟。由此获得凝胶gel3a2。
将凝胶gel3a2包装在1ml注射器中，然后在121℃的高压灭菌器中灭菌20分钟。由此获得凝胶gel32(＝本发明的凝胶)，从gel3a2衍生的灭菌凝胶。
实例7：表征本发明的凝胶g1、g21、g22和凝胶ref1、ref21、ref22、g23和ref23(比较)
分析本发明的凝胶g1(实例1中制备)、g21(实例2中制备)和g22(实例3中制备)，并与凝胶ref1(实例1中制备)、ref21(实例2中制备)和ref22(在实例3中制备)进行比较。
在推出力、流变性、凝聚性和外观方面分析所有凝胶，并且在高压灭菌器中灭菌后进行分析。
如下评估要分析的凝胶的凝聚性：将1ml待测试的凝胶置于含有8ml纯化水的10ml瓶中，然后手动振荡15秒。取决于所分析的制剂，可以观察到水中的凝胶的非常高的解离/断裂(＝水平1＝低凝聚性)，或很少或不解离(＝水平3＝高凝聚性)，或介于1和3之间的平均凝聚性(＝等级2＝平均凝聚性)。
用双目显微镜观察要分析的凝胶的显微外观，放大40倍。
以完全令人惊讶的方式，注意到本发明的基于交联的透明质酸与脂肪酸的凝胶具有与不含脂肪酸的相应凝胶类似的推出力、凝聚度和流变学性质。
本发明凝胶的这一特征是特别有利的，因为它可以为从业者提供具有脂肪酸的可注射产品，其具有与目前已知的那些类似的性质，因此可用于治疗相同的适应症，同时由于脂肪酸的存在而旨在更好的安全性和临床表现(例如，长期产生/保持体积的能力更好)。
实例8：制备未交联的透明质酸与脂肪酸的溶液(比较)
向5.0g磷酸盐缓冲液中的20mg/ml透明质酸钠(分子量＝1.7mda，水的含量＝4.9％)的溶液中加入0.35g油酸并用刮刀手动混合10分钟。由此获得溶液sol4a。
将溶液sol4a包装在1ml注射器中，然后在121℃的高压灭菌器中灭菌20分钟。由此获得sol4，从sol4a衍生的灭菌溶液。
在灭菌后的t＝0时，注意到外观上半透明的溶液sol4具有几个不均匀区域。在室温下储存2个月后，在溶液表面上观察到上清液(＝脂肪酸的有机相)。
在本发明的范围内没有考虑这种类型的溶液(未交联的透明质酸与脂肪酸)，由于水包油乳液的稳定性不足，与几个月的保存期限不相容。
不希望受到解释的束缚，该实例显示透明质酸必须交联以稳定悬浮在水凝胶中的脂肪酸，这使得有可能获得本发明的组合物，其具有均匀的视觉外观，同时显微镜下不均匀。
实例9：评估本发明的凝胶g21和凝胶ref21和ref21+抗氧化剂对自由基和酶促降解的抗性。
将4％甘露醇加入到4.9g凝胶ref21中，然后用刮刀手动混合10分钟。由此获得凝胶[ref21+抗氧化剂]。
自由基降解测试：
分别放置在5个试管中(对每个试管用刮刀手动混合1分钟)：
-管1：2.0g凝胶g21(实例2中制备)
-管2：2.0g凝胶ref21(实例2中制备)
-管3：2.0g凝胶g21+10％h2o2溶液(30％质量/质量)
-管4：2.0g凝胶ref21+10％h2o2溶液(30％质量/质量)
-管5：2.0g凝胶[ref21+抗氧化剂]+10％h2o2溶液(30％m/m)
然后将这些管置于37℃的烘箱中6小时，然后翻转所有的管。
注意到，管1和2的内容物以相同的方式非常少地流出，而管3和4的内容物以相同的方式快速流出。反过来，具有抗氧化剂的管5的内容物以介于管1/2和管3/4之间的中间方式流出。
该实验表明，在通过h2o2的自由基降解期间，本发明的凝胶和相应的不含脂肪酸的凝胶具有相似的降解动力学。
酶降解测试：
分别将下列物质放置在4个试管中(对每个试管用刮刀手动混合1分钟)：
-管1：2.0g凝胶g21(实例2中制备)
-管2：2.0g凝胶ref21(实例2中制备)
-管3：2.0g凝胶g21+10％透明质酸酶溶液(牛源，200u/ml)
-管4：2.0g凝胶ref21+10％透明质酸酶溶液(牛源，200u/ml)
然后将这些管置于37℃的烘箱中6小时，然后翻转所有的管。
注意到，管1和2的内容物以相同的方式非常少地流出，而管3和4的内容物以相同的方式快速流出。
该实验显示，在透明质酸酶酶降解期间，本发明的凝胶和不含脂肪酸的相应凝胶具有相似的降解动力学。
实例10：评估本发明的凝胶g1、g21、g22和凝胶g23在室温储存期间的时间稳定性(比较)
在室温下储存凝胶g1(实例1中制备)、g21(实例2中制备)、g22(实例3中制备)和g23(实例4中制备)并随时间观察。
值得注意的是，在室温下6个月后，本发明的凝胶g1、g21和g22是半透明且均质的，而凝胶g23(本发明中未考虑的凝胶)在0.7hz处的比率g”/g’大于0.70，开始显示不均匀区域(凝胶中的小脂肪酸液滴的凝聚)。
与本发明的凝胶g1、g21和g22不同，凝胶g23在室温下与24个月的保存期限不相容，这是实践者(使用者)对于可注射交联的透明质酸基产品通常所需的持续时间。
在0.7hz处的比率g”/g’与粘弹性组合物的基本上弹性的性质同义，因此在本发明中起决定性作用。
实例11：评估脂肪酸释放的动力学(比较)
将下列物质置于基于纤维素的膜上(膜截留值＝10000da；每cm膜约3.5g凝胶的填充比率)：
-10g本发明的凝胶g1(在实例1中制备)
-10g凝胶ref1(在实例1中制备)
-10g本发明的凝胶g22(在实例3中制备)
-10g凝胶ref22(在实例3中制备)
将这4个膜各自置于500ml的0.9％nacl盐水溶液中并随时间观察凝胶：
-在t＝0时，由于分散在凝胶中的脂肪酸的存在，本发明的凝胶g1和g22是半透明的。这一点通过用双目显微镜观察进一步证实，放大倍数为40x，可以观察到分散在交联的透明质酸凝胶中的小脂肪酸液滴。至于凝胶ref1和ref22，它们是完全透明的
-在1天、3天、1周、2周、3周、4周、6周、8周、24周和40周后进行相同的观察(视觉和双目显微镜)。对于这些时间点中的每一个，如在t＝0时，本发明的凝胶g1和g22是半透明的并且凝胶ref1和ref22是透明的。
以完全令人惊讶的方式，尽管本领域技术人员熟知中小分子从交联的透明质酸基凝胶中快速释放(例如盐酸利多卡因分子首先在24小时内几乎完全释放--wo2010/015900的实例4)，注意到，存在于本发明的凝胶中的脂肪酸在几周后也释放得很少，几乎不释放。此特征赋予本发明的水凝胶相当大的优势，因为这允许它们从由交联的透明质酸和脂肪酸之间的协同作用提供的优势中受益，本发明的条件下，在植入组织后持续很长的一段时间。