pad4是能够在肽序列内催化精氨酸瓜氨酸化为瓜氨酸的酶的肽基精氨酸脱亚氨酶(pad)家族的成员。pad4负责各种蛋白在体外和体内的脱亚氨化或瓜氨酸化，其结果为各种疾病中的不同功能反应(jonesj.e.等人,curr.opin.drugdiscov.devel.,12(5),(2009),616-627)。除了肿瘤学适应症以外，示例性疾病的实例包含类风湿性关节炎、对发病机理具有嗜中性贡献的疾病(例如血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎)。pad4抑制剂还作为通过表观遗传机制用于人疾病的工具和治疗剂具有较宽适用性。
pad4的抑制剂具有针对类风湿性关节炎(ra)的用途。ra是影响近似1%的群体的自身免疫疾病(wegnern.等人,immunol.rev.,233(1)(2010),34-54)。其特征在于导致骨和软骨的衰弱性破坏的关节的炎症。尽管不一致，但已在许多群体研究中表明pad4多态性和ra易感性之间的弱基因相关性(kochiy.等人,ann.rheum.dis.,70,(2011),512-515)。已在滑液组织中检测到pad4(以及家族成员pad2)，其中其负责各种关节蛋白的脱亚氨化。该过程被假设为导致对ra关节中的瓜氨酸化底物(诸如纤维蛋白原、波形蛋白和胶原)的耐受性破坏且引发对其的免疫反应。这些抗瓜氨酸化蛋白抗体(acpa)有助于疾病发病且也可用作用于ra的诊断测试(例如市售的ccp2或环状瓜氨酸化蛋白2测试)。另外，通过其直接影响几种关节和炎性介体(例如纤维蛋白原、抗凝血酶、多种趋化因子)的功能的能力，增加的瓜氨酸化也可向疾病发病提供额外直接贡献。在较小的ra患者子集中，可测量抗pad4抗体且可与疾病的较侵蚀性形式关联。
pad4抑制剂也可用于减小各种疾病中的病理学嗜中性粒细胞活性。研究表明，嗜中性粒细胞细胞外捕集(net)形成的过程(嗜中性粒细胞能够固定并杀死病原体的先天性防御机制)与组蛋白瓜氨酸化相关并在pad4敲除小鼠中是缺陷的(neelii.等人,j.immunol.,180,(2008),1895-1902andlip.等人,j.exp.med.,207(9),(2010),1853-1862)。pad4抑制剂可因此适用于其中组织中的net形成有助于局部损伤和疾病病理学的疾病。此类疾病包括，但不限于，小血管炎(kessenbrockk.等人,nat.med.,15(6),(2009),623-625)、全身性红斑狼疮(hakkima.等人,proc.natl.acad.sci.usa,107(21),(2010),9813-9818andvillanuevae.等人,j.immunol.,187(1),(2011),538-52)、溃疡性结肠炎(savchenkoa.等人,pathol.int.,61(5),(2011),290-7)、囊性纤维化、哮喘(dworskir.等人,j.allergyclin.immunol.,127(5),(2011),1260-6)、深层静脉血栓形成(fuchst.等人,proc.natl.acad.sci.usa,107(36),(2010),15880-5)、牙周炎(vitkovl.等人,ultrastructuralpathol.,34(1),(2010),25-30)、败血症(clarks.r.等人,nat.med.,13(4),(2007),463-9)、阑尾炎(brinkmannv.等人,science,303,(2004),1532-5)和中风。另外，有证据证明，net可有助于在影响皮肤的疾病(例如皮肤红斑狼疮(villanuevae.等人,j.immunol.,187(1),(2011),538-52)和牛皮癣(lina.m.等人.,j.immunol.,187(1),(2011),490-500))中的病理学，所以pad4抑制剂在通过全身性或皮肤途径给药时可显示解决net皮肤病的益处。pad4抑制剂可影响嗜中性粒细胞内的额外功能并对嗜中性疾病具有较宽适用性。
研究已表明工具pad抑制剂(例如氯-脒)在许多动物疾病模型(包含胶原诱导的关节炎(willisv.c.等人,j.immunol.,186(7),(2011),4396-4404)、葡聚糖硫酸钠(dss)诱发的实验结肠炎(chumanevicha.a.等人,am.j.physiol.gastrointest.liverphysiol.,300(6),(2011),g929–g938)、骨髓修复(langes.等人,dev.biol.,355(2),(2011),205-14)和实验自身免疫性脑脊髓炎(eae))中的效力。dss结肠炎报告也表明，氯-脒驱动炎性细胞在体外和体内的细胞凋亡，表明pad4抑制剂可更通常在广泛的炎性疾病中是有效的。
pad4抑制剂也可用于治疗癌症(slack.j.l.等人,cell.mol.lifesci.,68(4),(2011),709-720)。pad4的过表达已证明于许多癌症中(changx.等人，bmccancer,9,(2009),40)。已从如下观察表明pad4抑制剂的抗增殖性作用：pad4使在p53-靶基因(诸如p21)的启动子处的组蛋白中的精氨酸残基瓜氨酸化，所述靶基因参与细胞周期停滞和细胞凋亡的诱导(lip.等人,mol.cellbiol.,28(15),(2008),4745-4758)。
pad4在使组蛋白中的精氨酸残基脱亚氨化中的上述作用可表明pad4在基因表达的表观遗传调控中的作用。pad4是观察存在于细胞核以及细胞质中的主要pad家族成员。pad4可充当组蛋白脱甲基亚氨酶以及脱亚氨酶的早期证据不一致且未证实。然而，可经由通过转化为瓜氨酸以消耗可用精氨酸残基来间接减小组蛋白精氨酸甲基化(和因此与该标志相关的表观遗传调控)。pad4抑制剂可用作影响额外疾病环境中的不同靶基因的表达的表观遗传工具或治疗剂。通过此类机制，pad4抑制剂也可有效控制干细胞中的瓜氨酸化水平且可因此在治疗上影响不同干细胞(包括，但不限于，胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞和癌症干细胞)的多能状态和分化潜力。因此，仍然存在鉴定和开发用于治疗pad4-介导的病症的pad4抑制剂的未满足的需求。
发明概述
现已发现，式i的化合物或其药学上可接受的盐可用作pad4的抑制剂：
其中r1、r2、r3、n和环a各自如本文所定义和描述。
也已发现，式i’的化合物或其药学上可接受的盐可用作pad4的抑制剂：
其中r1、r2、r3、环a、x和n各自如本文所定义和描述。
在一些实施方案中，所提供的化合物证明了对pad4相对于pad2的选择性。本发明还提供了包含所提供的化合物的药学上可接受的组合物。所提供的化合物可用于治疗各种与pad4相关的病症。此类病症详细描述于本文中且包括，例如，类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮和牛皮癣。
发明详述
1.本发明的某些方面的一般描述
在一些实施方案中，此类化合物包括具有本文所述的各式的化合物或其药学上可接受的盐，其中各变量如本文中所定义且描述于实施方案中。在一些实施方案中，本发明提供了式i的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
r1是氢、-cn、-or或任选地被1-4个选自氟、-cn或or的基团取代的c1-6脂族基团；
r2是氢或任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团；
环a是
其中环a任选地被1-4个选自以下的基团取代：氟、-cn、-or或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团；
各r3独立地是卤素、-cn、-r或-or；
n是0-3；且
各r独立地是氢或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团。
在一些实施方案中，本发明提供了式i’的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
r1是氢、-cn、-or、
r2是氢或任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团；
环a是
其中环a任选地被1-4个选自以下的基团取代：氟、-cn、-or或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团；
各r3独立地是卤素、-cn、-r或-or；
x是c或n；
n是0-3；且
各r独立地是氢或任选地被-oh或1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团。
2.定义
本发明的化合物包括本文一般描述的那些，且进一步由本文公开的类别、子类和种类来说明。如本文所用，以下定义应适用，除非另外指明。出于本发明的目的，根据元素周期表，cas版，handbookofchemistryandphysics，第75版来鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原则描述于“organicchemistry”,thomassorrell,universitysciencebooks,sausalito：1999，和“march’sadvancedorganicchemistry”,第5版,编辑：smith,m.b.andmarch,j.,johnwiley&sons,newyork：2001，其完整内容都通过引用并入本文。
如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元的直链(即无支链)或支链、取代或未取代的烃链，或完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳香族的单环烃或双环烃(在本文中也称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，其具有至分子的其余部分的单一附接点。除非另外指定，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在还有其它实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，且在还有其它实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施方案中，“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一个或多个不饱和单元、但不是芳香族的单环c3-c6烃，其具有至分子的其余部分的单一附接点。合适的脂族基团包括，但不限于，直链或支链、取代或未取代的烷基、烯基、炔基基团和其杂合体，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断范围内适用于接触人类和低等动物的组织而无过度毒性、刺激、过敏反应等且与合理效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences,1977,66,1–19(其通过引用并入本文)中详细描述了药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐包含衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域所用的其它方法(例如离子交换)形成的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。
衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和n+(c1-4烷基)4盐。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。在适当时，另外的药学上可接受的盐包括无毒铵、季铵和胺阳离子，其使用抗衡离子诸如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根来形成。
除非另外陈述，否则本文描绘的结构还意欲包括该结构的所有异构体(例如对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体))形式；例如各不对称中心的r和s构型、z和e双键异构体以及z和e构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体)混合物都在本发明的范围内。除非另外陈述，否则本发明的化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围内。另外，除非另外陈述，否则本文描绘的结构还意欲包括仅在存在一个或多个同位素富集的原子的情况下不同的化合物。例如，具有包括通过氘或氚替代氢或通过13c-或14c-富集的碳替代碳的本发明的结构的化合物在本发明的范围内。根据本发明，此类化合物可用作例如分析工具、作为生物测定中的探针或作为治疗剂。
本文所用的术语“可测量的亲和力”和“可测量地抑制”意指在包含本发明的化合物或其组合物和pad4的样品以及包含pad4、缺乏所述化合物或其组合物的等效样品之间的pad4活性的可测量的变化。
3.示例性化合物的描述
根据一个方面，本发明提供了式i的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
r1是氢、-cn、-or或任选地被1-4个选自氟、-cn或or的基团取代的c1-6脂族基团；
r2是氢或任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团；
环a是
其中环a任选地被1-4个选自以下的基团取代：氟、-cn、-or或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团；
各r3独立地是卤素、-cn、-r或-or；
n是0-3；且
各r独立地是氢或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团。
根据另一个方面，本发明提供了式i’的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
r1是氢、-cn、-or、
r2是氢或任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团；
环a是
其中环a任选地被1-4个选自以下的基团取代：氟、-cn、-or或任选地被1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团；
各r3独立地是卤素、-cn、-r或-or；
x是c或n；
n是0-3；且
各r独立地是氢或任选地被-oh或1-3个氟原子取代的c1-6脂族基团。
如上文所定义和本文所述，r1是氢、-cn、-or或任选地被1-4个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-6脂族基团。在一些实施方案中，r1是氢。在一些实施方案中，r1是任选地被1-4个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-6脂族基团。在一些实施方案中，r1是–ch2ch2och3。在一些实施方案中，r1是–cn。在一些实施方案中，r1是c1-3脂族基团。在一些实施方案中，r1是甲基。在一些实施方案中，r1是乙基。在一些实施方案中，r1是丙基。在某些实施方案中，r1是被1、2或3个氟原子取代的c1-3脂族基团。在一些实施方案中，r1是被2或3个氟原子取代的c1-3脂族基团。在一些实施方案中，r1是–ch2chf2。在一些实施方案中，r1是
如上文所定义和本文所述，r2是氢或任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是氢。在一些实施方案中，r2是任选地被1-5个选自氟、-cn或-or的基团取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是甲基。在一些实施方案中，r2是乙基。在一些实施方案中，r2是丙基。在一些实施方案中，r2是丁基。在一些实施方案中，r2是戊基。在一些实施方案中，r2是己基。在一些实施方案中，r2是环丙基。在一些实施方案中，r2是环丁基。在一些实施方案中，r2是环戊基。在一些实施方案中，r2是环己基。在一些实施方案中，r2是环丙基甲基。在一些实施方案中，r2是环丁基甲基。在一些实施方案中，r2是环戊基甲基。在一些实施方案中，r2是环己基甲基。在一些实施方案中，r2是环丙基乙基。在一些实施方案中，r2是环丁基乙基。在一些实施方案中，r2是环戊基乙基。在一些实施方案中，r2是环己基乙基。
在一些实施方案中，r2是任选地被1-5个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被1个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被2个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被3个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被4个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被5个氟原子取代的c1-10脂族基团。在一些实施方案中，r2是被1-3个氟原子取代的甲基。在一些实施方案中，r2是三氟甲基。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的乙基。在一些实施方案中，r2是2,2,2-三氟乙基。在一些实施方案中，r2是–ch2cf2ch3。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的丙基。在一些实施方案中，r2是3,3,3-三氟丙基。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的丁基。在一些实施方案中，r2是4,4,4-三氟丁基。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的戊基。在一些实施方案中，r2是5,5,5-三氟戊基。在一些实施方案中，r2是被1-5个氟原子取代的己基。在一些实施方案中，r2是6,6,6-三氟己基。在某些实施方案中，r2选自下表1中描绘的那些。
如上文所定义，各r3独立地是卤素、-cn、-r或-or。在一些实施方案中，r3是氢。在一些实施方案中，各r3独立地是卤素或-cn。在一些实施方案中，r3是c1-6脂族基团或-or。在一些实施方案中，r3是-och3。在一些实施方案中，r3是-ochf2。在一些实施方案中，r3是乙基。在一些实施方案中，r3是-cf3。在一些实施方案中，r3是-chf2。在一些实施方案中，r3是-c(oh)(ch3)2。在某些实施方案中，r3选自下表1中描绘的那些。
如上文所定义，环a是
在一些实施方案中，环a选自
在一些实施方案中，r1是甲基，r2是2,2,2-三氟乙基，且环a是
如上文所定义和本文所述，n是0-3。在一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在某些实施方案中，n选自下表1中描绘的那些。
如本文所述，x是c或n。在一些实施方案中，x是c。在一些实施方案中，x是n。在某些实施方案中，x选自下表1中描绘的那些。
在一些实施方案中，式i或式i’的化合物选自下表1中描绘的那些。
表1.式i和式i’的示例性化合物
在某些实施方案中，本发明提供了上文和本文所述的任何化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明提供了如上表1中所描绘的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供了呈分离形式的上文和本文所述的任何化合物。
4.用途、配制和给药
药学上可接受的组合物
根据另一个实施方案，本发明提供了组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物和药学上可接受的载体、助剂或媒介物。本发明的组合物中的化合物的量使得有效可测量地抑制生物样品中或患者中的pad4。在某些实施方案中，本发明的组合物中的化合物的量使得有效可测量地抑制生物样品中或患者中的pad4。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制用于给药于需要此组合物的患者。在一些实施方案中，本发明的组合物被配制用于经口服给药于患者。
本文所用的术语“受试者”与术语“患者”可互换使用且意指动物，优选哺乳动物。在一些实施方案中，受试者或患者是人类。在其它实施方案中，受试者(或患者)是家畜(veterinary)受试者(或患者)。在一些实施方案中，家畜受试者(或患者)是狗、猫或马受试者。
术语“药学上可接受的载体、助剂或媒介物”是指不破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的无毒载体、助剂或媒介物。可用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体、助剂或媒介物包括，但不限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明的组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊(buccally)、阴道或经由植入的储库(implantedreservoir)给药。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地，经口、腹膜内或静脉内给药所述组合物。本发明的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液(ringer'ssolution)和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。
出于该目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单-或二-甘油酯。脂肪酸(诸如油酸和其甘油酯衍生物)可用于制备可注射物，如天然药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，其尤其呈其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其它常用表面活性剂，诸如tweens、spans和通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。
本发明的药学上可接受的组合物可以以任何经口可接受的剂型经口给药，所述剂型包括，但不限于，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于经口使用的片剂的情况下，常用的载体包含乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口给药，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水性悬浮液用于经口使用时，可将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可添加某些甜味剂、矫味剂或着色剂。
或者，本发明的药学上可接受的组合物可以用于直肠给药的栓剂形式给药。这些可通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇类。
本发明的药学上可接受的组合物也可局部给药，尤其当治疗靶标包括可通过局部施加易于接近的区域或器官(包括眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。可容易地制备用于这些区域或器官各自的合适的局部制剂。
可以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂来实现对于下部肠道的局部施加。也可使用局部经皮贴片。
对于局部施加，可将所提供的药学上可接受的组合物配制于含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏中。用于局部给药本发明的化合物的载体包括，但不限于，矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将所提供的药学上可接受的组合物配制于含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳霜中。合适的载体包括，但不限于，矿物油、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼部使用，可将所提供的药学上可接受的组合物配制为在等渗、ph调节的无菌盐水中的微粒化悬浮液，或优选地配制为在等渗、ph调节的无菌盐水中的溶液，其含有或不含防腐剂，诸如氯苄烷铵(benzylalkoniumchloride)。或者，对于眼部使用，可将药学上可接受的组合物配制于软膏(诸如矿脂)中。
也可通过经鼻气溶胶或吸入来给药本发明的药学上可接受的组合物。根据药物制剂领域众所周知的技术来制备此类组合物且可将其制备为盐水溶液，其采用苯甲醇或其它合适防腐剂、吸收促进剂(以增强生物利用度)、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂。
最优选地，本发明的药学上可接受的组合物被配制用于经口给药。此类制剂可与食物一起或不与食物一起给药。在一些实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物不与食物一起给药。在其它实施方案中，本发明的药学上可接受的组合物与食物一起给药。
本发明的药学上可接受的组合物可经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)、经颊、作为经口或经鼻喷雾等给药于人类和其它动物，这取决于所治疗的感染的严重程度。在某些实施方案中，本发明的化合物可以约0.01mg/kg受试者体重/天至约50mg/kg受试者体重/天且优选约1mg/kg受试者体重/天至约25mg/kg受试者体重/天的剂量水平每天一或多次经口或肠胃外给药，以获得期望治疗效应。
用于经口给药的液体剂型包括，但不限于，药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂(诸如例如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特定而言棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇类和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除了惰性稀释剂以外，经口组合物也可包括助剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于该目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。另外，在可注射制剂中使用脂肪酸，诸如油酸。
可注射制剂可例如通过如下灭菌：过滤通过细菌截留过滤器或通过并入灭菌剂，所述灭菌剂呈可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式。
为了延长本发明的化合物的效应，通常期望从皮下或肌内注射来减缓化合物的吸收。这可通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率然后则取决于其溶解速率，其进而可取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油性媒介物中来实现肠胃外给药的化合物形式的延迟吸收。通过在生物可降解聚合物(诸如聚乳酸-聚乙交酯)中形成化合物的微囊基质来制备可注射的储库形式。取决于化合物与聚合物的比率和采用的特定聚合物的性质，可控制化合物释放的速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通过将化合物捕集于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射制剂。
用于直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此其可在直肠或阴道腔内融化并释放活性化合物。
用于经口给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒。在此类固体剂型中，所述活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，诸如甘油，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，诸如石蜡，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物，g)润湿剂，诸如例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土，和i)润滑剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇类、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情形下，剂型也可包含缓冲剂。
也可采用类似类型的固体组合物作为使用赋形剂诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇类等的在软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可用包衣和包壳(诸如肠溶包衣和药学配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。其可任选地含有遮光剂且也可以是其任选地以延迟方式仅或优先在肠道的特定部分中释放活性成分(诸活性成分)的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。也可采用相似类型的固体组合物作为使用赋形剂诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇类等的在软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
活性化合物也可与一种或多种如上文所示的赋形剂呈微囊化形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可用包衣和包壳(诸如肠溶包衣、释放控制包衣和药学配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。在此类固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(诸如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。此类剂型也可如同通常实践一样包含除了惰性稀释剂以外的额外物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂(诸如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。其可任选地含有遮光剂且也可以是其任选地以延迟方式仅或优先在肠道的特定部分中释放活性成分(诸活性成分)的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于局部或经皮给药本发明的化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳霜、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。如果需要，可在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载体和任何所需防腐剂或缓冲剂混合。眼部制剂、滴耳剂和滴眼剂也涵盖于本发明的范围内。另外，本发明涵盖使用透皮贴片，其具有提供化合物至身体的受控递送的额外优点。此类剂型可通过将化合物溶解或分配于适当介质中来制备。也可使用吸收增强剂来增加所述化合物穿过皮肤的通量。速率可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
可与载体材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明的化合物的量将取决于所治疗的宿主、特定给药模式而变化。优选地，应当配制所提供的组合物，以便可将剂量为0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂给药于接受这些组合物的患者。
本发明的化合物可单独或与一种或多种其它治疗化合物组合给药，可能的组合疗法采用以下形式：本发明的化合物和一种或多种其它治疗化合物的固定组合或本发明的化合物和一种或多种其它治疗化合物的给药彼此独立地交错或给予，或固定组合和一种或多种其它治疗化合物的组合给药。本发明的化合物可此外或另外与化学疗法、放射疗法、免疫疗法、光疗法、手术干预或这些的组合联合给药以尤其用于肿瘤疗法。长期疗法在其它治疗策略的情况下同样地可能作为辅助疗法，如上文所述。其它可能治疗是肿瘤消退后用于维持患者状态的疗法或甚至化学预防疗法，例如在处于风险下的患者中。
那些额外药剂可作为多剂量方案的一部分与含有本发明化合物的组合物分开给药。或者，那些药剂可以是单一剂型的一部分，其与本发明的化合物一起混合于单一组合物中。如果作为多剂量方案的一部分给药，则两种活性剂可同时、依次或彼此在一定时间期间内、通常彼此在5小时内递送。
如本文所用，术语“组合”、“组合的”和相关术语是指同时或依次给药本发明的治疗剂。例如，本发明的化合物可与另一治疗剂同时或依次以分开的单位剂型或一起在单一单位剂型中进行给药。因此，本发明提供包含本发明的化合物、额外治疗剂和药学上可接受的载体、助剂或媒介物的单一单位剂型。
可与载体物质组合以产生单一剂型的本发明化合物和额外治疗剂两者的量(在如上文所述包含额外治疗剂的那些组合物中)将取决于所治疗的宿主和特定给药方式而变化。优选地，本发明的组合物应当被配制，使得可给药剂量为0.01-100mg/kg体重/天的本发明化合物。
在包含额外治疗剂的那些组合物中，该额外治疗剂和本发明的化合物可协同起作用。因此，额外治疗剂在此类组合物中的量将小于仅利用该治疗剂的单一疗法中所需的量。
存在于本发明的组合物中的额外治疗剂的量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中正常给药的量。优选地，本文公开的组合物中的额外治疗剂的量的范围将为包含该药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中正常存在的量的约50％至100％。
还应理解，用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合和治疗医师的判断以及所治疗的具体疾病的严重程度。本发明的化合物在组合物中的量还将取决于组合物中的特定化合物。
化合物和药学上可接受的组合物的用途
本文所述的化合物和组合物通常可用于抑制pad4。
可在体外、在体内或在细胞系中测定在本发明中用作pad4的抑制剂的化合物的活性。体外测定法包括测定pad4抑制的测定法。用于测定本发明中用作pad4的抑制剂的化合物的详细条件记载于下文诸实施例中。在一些实施方案中，所提供的化合物与pad2相比选择性抑制pad4。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“治疗(treating)”是指如本文所述的逆转、减轻疾病或病症或其一种或多种症状、延迟其发作或抑制其进展。在一些实施方案中，治疗可在已发生一种或多种症状之后给药。在其它实施方案中，治疗剂可在无症状的情况下给药。例如，可在症状发作之前将治疗剂给药于敏感个体(例如根据症状历史和/或根据遗传或其它敏感因子)。也可在症状已消退之后继续治疗，例如以防止或延迟其复发。
所提供的化合物是pad4的抑制剂且因此可用于治疗一种或多种与pad4的活性相关的病症。因此，在某些实施方案中，本发明提供了治疗pad4-介导的病症的方法，其包括向有此需要的患者给药本发明的化合物或其药学上可接受的组合物的步骤。
在某些实施方案中，pad4-介导的病症是由不适当的pad4活性介导的疾病、病况或病症。在一些实施方案中，pad4-介导的病症选自类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮和牛皮癣。在一个进一步实施方案中，由不适当的pad4活性介导的病症是类风湿性关节炎。在一个进一步实施方案中，由不适当的pad4活性介导的病症是全身性狼疮。在一个进一步实施方案中，由不适当的pad4活性介导的病症是血管炎。在一个进一步实施方案中，由不适当的pad4活性介导的病症是皮肤红斑狼疮。在一个进一步实施方案中，由不适当的pad4活性介导的病症是牛皮癣。
在一个实施方案中，提供了治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供了治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗全身性狼疮的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗血管炎的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗皮肤红斑狼疮的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，提供了治疗牛皮癣的方法，所述方法包括向有此需要的人受试者给药治疗有效量的所提供的化合物或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，pad4-介导的病症选自：酸诱发的肺损伤、痤疮(papa)、急性淋巴细胞性白血病、急性呼吸窘迫综合征、阿狄森氏病(addison’sdisease)、肾上腺增生、肾上腺皮质功能不全、老化、aids、酒精性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝病、过敏原诱发的哮喘、过敏支气管肺、曲菌病(aspergillosis)、过敏性结膜炎、脱发、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌肉萎缩性侧索硬化和重量损失、心绞痛、血管性水肿、无汗外胚层发育不全-id、强直性脊柱炎、前段炎症、抗磷脂综合征、口疮口炎、阑尾炎、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自身免疫疾病、自身免疫性肝炎、蜂螫伤诱发的炎症、贝切特氏病(behcet’sdisease)、贝切特氏综合征(behcet’ssyndrome)、贝尔氏麻痹症(bellspalsey)、铍中毒、布劳综合征(blausyndrome)、骨疼痛、细支气管炎、烧伤、粘液囊炎、癌症、心脏肥大、腕隧道综合征、分解代谢病症、白内障、脑动脉瘤、化学刺激物诱发的炎症、脉络膜视网膜炎、慢性心脏衰竭、早产儿的慢性肺病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性阻塞性肺病、结肠炎、复杂性区域疼痛综合征、结缔组织疾病、角膜溃疡、克罗恩氏病(crohn’sdisease)、隐热蛋白(cryopyrin)相关的周期性综合征、隐球菌病、囊性纤维化、白介素-1-受体拮抗剂(dira)的缺陷、皮炎、皮炎内毒素血症、皮肌炎、弥漫型内因性脑桥神经胶质瘤、子宫内膜异位症、内毒素血症、上髁炎、成红细胞减少症、家族性淀粉样多发性神经病变、家族性冷性荨麻疹、家族性地中海热、胎儿生长迟滞、青光眼、肾小球疾病、肾小球肾炎、痛风、痛风性关节炎、移植物抗宿主病、肠病、头部损伤、头痛、听力损失、心脏病、溶血性贫血、亨舍二氏紫癜(henoch-scholeinpurpura)、肝炎、遗传性周期性发热综合征、带状疱疹和单纯疱疹、hiv-1、霍奇金氏病(hodgkin’sdisease)、亨廷顿氏病(huntington’sdisease)、透明膜病、高氨血症、高钙血症、高胆固醇血症、高免疫球蛋白血症d伴随反复发热(hids)、发育不全和其它贫血、发育不全性贫血、特发性血小板减少性紫癜、色素失调症、感染性单核细胞增多症、炎性肠病、炎性肺病、炎性神经病变、炎性疼痛、昆虫咬伤诱发的炎症、虹膜炎、刺激物诱发的炎症、缺血/再灌注、幼年性类风湿性关节炎、角膜炎、肾病、由寄生虫感染引起的肾损伤、由寄生虫感染引起的肾损伤、肾移植排斥预防、钩端螺旋体病、白血病、吕弗勒氏综合征(loeffler’ssyndrome)、肺损伤、肺损伤、狼疮、狼疮、狼疮性肾炎、淋巴瘤、脑膜炎、间皮瘤、混合结缔组织疾病、muckle-wells综合征(muckle-wellssyndrome)(荨麻疹耳聋淀粉样变性)、多发性硬化、肌肉萎缩、肌肉营养不良症、重症肌无力、心肌炎、蕈样真菌病、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、肌炎、鼻窦炎、坏死性小肠结肠炎、新生儿发作多系统炎性疾病(nomid)、肾病综合征、神经炎、神经病理学疾病、非过敏原诱发的哮喘、肥胖症、眼睛过敏、视神经炎、器官移植、骨关节炎、中耳炎、佩吉特氏病(paget’sdisease)、疼痛、胰腺炎、帕金森氏病(parkinson’sdisease)、天疱疮、心包炎、周期性发热、牙周炎、腹膜的子宫内膜异位症、百日咳、咽炎和腺炎(pfapa综合征)、植物刺激物诱发的炎症、肺炎(pneumonia)、肺炎(pneumonitis)、肺囊虫感染、毒葛(poisonivy)/漆酚油诱发的炎症、结节性多动脉炎、多软骨炎、多囊性肾病、多肌炎、牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣、牛皮癣、心理社会应激疾病、肺病、肺高血压、肺纤维化、坏疽性脓皮病、化脓性无菌关节炎、肾病、视网膜疾病、风湿性心脏炎、风湿性疾病、类风湿性关节炎、肉状瘤病、皮脂溢、败血症、严重疼痛、镰状细胞、镰状细胞贫血、二氧化硅诱发的疾病、sjogren氏综合征(sjogren’ssyndrome)、皮肤病、睡眠呼吸暂停、实体瘤、骨髓损伤、stevens-johnson综合征(stevens-johnsonsyndrome)、中风、蛛网膜下出血、晒伤、颞动脉炎、腱鞘炎、血小板减少症、甲状腺炎、组织移植、tnf受体相关的周期性综合征(traps)、弓形体病、移植、创伤性脑损伤、肺结核、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、葡萄膜炎和韦格纳氏肉芽肿(wegener’sgranulomatosis)。
在一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于疗法中。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗由不适当的pad4活性介导的病症。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗全身性狼疮。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗血管炎。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗皮肤红斑狼疮。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗牛皮癣。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由不适当的pad4活性介导的病症的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗全身性狼疮的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗血管炎的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗皮肤红斑狼疮的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了所提供的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗牛皮癣的药物中的用途。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防由不适当的pad4活性介导的病症的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防类风湿性关节炎、血管炎、全身性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、癌症、囊性纤维化、哮喘、皮肤红斑狼疮或牛皮癣的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防全身性狼疮的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防血管炎的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防皮肤红斑狼疮的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。在一个进一步实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防牛皮癣的药物组合物，其包含所提供的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的各个方面的所有特征加上必要的变更适用于所有其它方面。
为了可更全面地理解本文所描述的本发明，记载以下实施例。应理解，这些实施例仅用于说明性目的且不应解释为以任何方式限制本发明。
实施例
如以下诸实施例中所描绘的那样，在某些示例性实施方案中，根据以下一般程序制备诸化合物。应理解，尽管一般方法描绘本发明的某些化合物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其它方法可适用于本文所描述的所有化合物和这些化合物各自的亚类和种类。
分析型lcms方法：
方法a
met/u-hplc(低ph7min方法)
柱：phenomenexkinetex-xbc18,2.1mmx100mm,1.7µm
流速：0.6ml/min
流动相：a，0.1%甲酸(水溶液)；和b，0.1%甲酸(mecn)
注入体积：3μl
温度：40℃
检测：215nm(标称)
梯度时间(分钟)-%b
0.00-5
5.30-100
5.80-100
5.82-5
方法b
met/cr/1600(高ph7min方法)
柱：phenomenexgeminic18,2.0mmx100mm,3µm
流速：0.5ml/min
流动相：
a：2mm碳酸氢铵/hplc级水，ph10
b：hplc级mecn
注入体积：3μl
温度：50℃
检测：215nm
梯度时间：(分钟)-%b
0.0–5
5.50–100
5.90–100
5.92–5
9.00-5
方法c
metcr1416(低phshimadzu7min方法)
柱：watersatlantisdc18,2.1mmx100mm,3µm柱
流速：0.6ml/min
流动相：a，0.1%甲酸(水溶液)；和b，0.1%甲酸(乙腈)
注入体积：3μl
温度：40℃
检测：215nm(标称)
梯度时间(分钟)-%b
0.00-5
5.00-100
5.40-100
5.42–5
方法d
metcr1410(低phshimadzu2min方法)
柱：kinetexcore-shellc18,2.1mmx50mm,5µm柱
流速：1.2ml/min
流动相：a，0.1%甲酸(水溶液)；和b，0.1%甲酸(乙腈)
注入体积：3μl
温度：40℃
检测：215nm(标称)
梯度时间(分钟)-%b
0.00-5
1.20-100
1.30-100
1.31–5
方法e
手性hplc制备型方法
柱：amy-c,20mmx250mm,5µm柱
流速：42ml/min
流动相：a，0.1%甲酸(水溶液)；和b，0.1%甲酸(乙腈)
注入体积：250μl
温度：环境温度
检测：215nm(标称)
等度条件：1:1庚烷:ipa(0.1%v/vnh3)
方法f
手性纯度分析方法
柱：amy-c,4.6mmx250mm,5µm柱
流速：1ml/min
注入体积：1.0µl
温度：环境温度
检测：254nm
等度条件1:1庚烷:ipa(0.1%v/vnh3)。
根据以下方案1来制备本发明的化合物。
方案1
2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-6-{八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基}-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶盐酸盐ev-at1623-001(eoai3440740)的合成
1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸ev-aq1977-001–步骤1
在0℃和氮气气氛下，经5min向1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯(cas221675-35-0,4.0g,21.03mmol)于dmf(40ml)中的搅拌溶液中逐份添加nah(60%,0.95g,23.87mmol)。将所得混合物在室温下搅拌45min。添加(溴甲基)环丙烷(2.45ml,25.24mmol)并将反应混合物在室温下搅拌18h。在真空中去除溶剂并将残余物悬浮于thf(40ml)中。向该混合物中添加5m氢氧化钠水溶液(20ml,100mmol)并将混合物在50℃下搅拌18h。在真空中去除溶剂并用5m盐酸水溶液(20ml)酸化剩余材料，同时在冰浴中搅拌。将悬浮液搅拌10min，然后通过真空过滤收集沉淀物。将固体用水(2×100ml)洗涤并干燥以获得3.48g(76.5%)作为白色粉末的1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸ev-aq1977-001。lcms(方法d)：保留时间：1.02min,m/z=217(m+1)。
2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸甲酯ev-at1616-001–步骤2
向1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(ev-aq1977-001,700mg,3.24mmol)于干燥dmf(15ml)中的搅拌溶液中添加hatu(1.57g,4.05mmol)和dipea(712µl,4.05mmol)。将混合物在室温下搅拌2h，然后添加5-氨基-6-(甲基氨基)吡啶-3-甲酸甲酯(cas211915-53-6,91%,709mg,3.56mmol)并将混合物在室温下搅拌16h并在50℃下搅拌4h。添加另外的5-氨基-6-(甲基氨基)吡啶-3-甲酸甲酯(91%,129mg,0.65mmol)并在50℃下继续搅拌16h。在真空中去除溶剂，将所得褐色油状物溶解于乙酸(15ml)中并在80℃下加热10h并在70℃下加热16h。将反应混合物在减压下浓缩以获得褐色油状物，其通过快速柱色谱(17-85%etoac/庚烷)纯化以获得650mg(55.6%)作为黄色粉末的2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸甲酯ev-at1616-001。lcms(方法d)：保留时间：1.22min,m/z=362(m+1)。
2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸ev-at1617-001–步骤3
向2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸甲酯(ev-at1616-001,650mg,1.80mmol)/meoh(20ml)中添加2mnaoh(10ml)。将混合物在50℃搅拌3h。在真空中去除溶剂，并将所得浑浊水溶液用5mhcl(5ml)酸化，同时搅拌。继续搅拌5min，然后通过真空过滤收集沉淀物，用水(2×10ml)洗涤并干燥，以获得610mg(97.6%)作为浅黄色粉末的2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸ev-at1617-001。lcms(方法d)：保留时间：1.11min,m/z=348(m+1)。
6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-001–步骤4
在室温下，将2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-甲酸(ev-at1617-001,100mg,0.29mmol)和hatu(126mg,0.33mmol)于dmso(2.4ml)和mecn(1.5ml)中的搅拌溶液用dipea(61µl,0.35mmol)处理。将混合物搅拌2h，然后添加八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯(949559-11-9,72mg,0.32mmol)并将反应混合物在室温搅拌1.5h。将反应混合物用水(0.3ml)稀释并通过制备型hplc(基本(basic)方法)纯化，以获得137mg(84.8%)作为白色粉末的6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-001。lcms(方法d)：保留时间：1.34min,m/z=556(m+1)。
2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-6-{八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基}-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶ev-at1623-001(eoai3440740)–步骤5
将1.25mhcl/etoh(0.5ml)添加至6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯(ev-at1622-001,99%,20mg,0.04mmol)于etoh(1ml)中的溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌4h，然后在减压下浓缩成白色残余物。从水(3ml)中冻干该材料以获得20.8mg(定量)作为黄色粉末的2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-6-{八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基}-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶盐酸盐ev-at1623-001。lcms(方法a)：保留时间：1.79min,m/z=456(m+1)。
手性hplc以获得(3as,7ar)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-002和(3ar,7as)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-003–步骤6
将111mg6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-001溶解于甲醇中至14mg/ml且然后通过手性hplc(方法e)纯化以获得48.4mg(87.2%)作为白色粉末的(3as,7ar)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-002(绝对立体化学任意分配)和48.4mg(87.2%)作为白色粉末的(3ar,7as)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯ev-at1622-003(绝对立体化学任意分配)。
ev-at1622-002对映异构体过量：97.9，保留时间：7.99min(方法f)，lcms(方法a)：保留时间：3.51min,m/z=556(m+1)。
ev-at1622-003对映异构体过量：96.9，保留时间：9.92min(方法f)，lcms(方法a)：保留时间：3.51min,m/z=556(m+1)。
6-[(3ar,7ar)-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基]-2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶ev-at1627-001(eoai3441172，绝对立体化学任意分配)-步骤5
如步骤5，方案1中那样处理(3as,7ar)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯(ev-at1622-002,45mg,0.08mmol)以获得33.9mg(84.2%)作为黄色粉末的6-[(3ar,7ar)-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基]-2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶盐酸盐ev-at1627-001。lcms(方法a)：保留时间：1.77min,m/z=456(m+1)。
6-[(3as,7as)-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基]-2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶ev-at1628-001(eoai3441173，绝对立体化学任意分配)-步骤5
如步骤5，方案1中那样处理(3ar,7as)-6-{2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-1-甲酸叔丁酯(ev-at1622-003,45mg,0.08mmol)以获得35.1mg(87.2%)作为黄色粉末的6-[(3as,7as)-八氢-1h-吡咯并[2,3-c]吡啶-6-羰基]-2-[1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶盐酸盐ev-at1628-001。lcms(方法a)：保留时间：1.79min,m/z=456(m+1)。
(1r,4r,7r)-2-{2-[1-(环丙基甲基)-6-(二氟甲氧基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-6-羰基}-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-7-胺ev-ay5721-002(eoai3470057,plk-001205)
根据方案1中所述的程序经由如方案1.1中所述的1‐(环丙基甲基)‐6‐(二氟甲氧基)‐1h‐吡咯并[2,3‐b]吡啶‐2‐甲酸甲酯ev-ay2833-002的合成来进行合成：
方案1.1
1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸ev-ax5573-002-步骤1
将6-氯-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯(ev-ay7167-001，根据方案1合成，90%,1.45g,4.68mmol)、pd2(dba)3(214mg,0.23mmol)、tbu-bippyphos(237mg,0.47mmol)和氢氧化钾(788mg,14.0mmol)合并于压力管中的二氧杂环己烷(7.0ml)和水(7.0ml)中。将反应混合物用氮气吹扫5分钟，然后将容器密封并在70℃下加热1.5h。将反应混合物冷却至室温，然后通过玻璃纤维滤纸过滤。将滤液用水(10ml)稀释并用etoac(30ml)萃取。将水层用2mhcl酸化至ph5并过滤所得沉淀物并干燥以获得0.80g(62.2%)作为灰白色粉末的1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸ev-ax5573-002。lcms(方法d)：保留时间：0.95min,m/z=233(m+1)。
1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-ay4950-002-步骤2
在氮气气氛下，将2m(重氮基甲基)(三甲基)甲硅烷(1729µl，于乙醚中)添加至1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(ev-ax5573-002,73%,550mg,1.73mmol)于无水甲苯(6.0ml)和甲醇(无水，2.0ml,49.44mmol)中的搅拌悬浮液中。将所得混合物在室温下搅拌1.5h。添加乙酸(0.70ml)，直至亮黄色消失。将反应混合物在真空中浓缩并用dcm(5ml)研磨。将固体在真空下过滤掉并干燥以得到131mg(28.1%)作为浅米色固体的1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸ev-ay4950-001。lcms(方法d)：保留时间：1.13min,m/z=247(m+1)。
1-(环丙基甲基)-6-(二氟甲氧基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-ay2833-002-步骤3
向1-(环丙基甲基)-6-羟基-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(ev-ay2828-001，根据步骤1和2合成，672mg,2.73mmol)于乙腈(15.0ml)中的搅拌悬浮液中添加2,2-二氟-2-(氟磺酰基)乙酸(0.71ml,6.82mmol)并将反应混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物过滤并将滤液在真空中浓缩。将粗残余物通过快速柱色谱(0-100%etoac/庚烷)纯化以获得450mg(55.7%)作为灰白色固体的1-(环丙基甲基)-6-(二氟甲氧基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-ay2833-002。lcms(方法d)：保留时间：1.39min,m/z=297(m+1)。
2-(2-{6-[(1r,4r,7r)-7-氨基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-羰基]-3-甲基-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基}-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-6-基)丙-2-醇ev-ay7152-001(eoai3476164,plk-001296)
根据方案1中所述的程序经由如方案1.2中所描述的1‐(环丙基甲基)‐6‐(2‐羟基丙烷‐2‐基)‐1h‐吡咯并[2,3‐b]吡啶‐2‐甲酸甲酯ev-aw6273-002的合成来进行合成：
方案1.2
6-乙酰基-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-aw6271-002-步骤1
向6-氯-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(ev-aw6269-001,90%,1.16g,3.93mmol)于无水二氧杂环己烷(3ml)中的溶液中添加三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(1.59ml,4.71mmol)、xantphos(0.17g,0.29mmol)和pd2dba3(0.09g,0.10mmol)。将反应混合物在90℃下搅拌17h。在真空中去除溶剂并将1mhcl(50ml)和dcm(50ml)添加至残余物中。将双相混合物搅拌20分钟，然后将有机层分离并在真空中浓缩。将粗残余物通过快速柱色谱(0-10%etoac/庚烷)纯化以获得0.512g(47%)作为灰白色固体的6-乙酰基-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-aw6271-002。lcms(方法d)：保留时间：1.40min,m/z=273(m+1)。
1-(环丙基甲基)-6-(2-羟基丙-2-基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-aw6273-002-步骤2
在-78℃下，将甲基氯化镁(3m，于thf中，642µl)逐滴添加至6-乙酰基-1-(环丙基甲基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(ev-aw6271-002,510mg,1.84mmol)于干燥thf(5ml)中的搅拌溶液中。将反应物在-78℃下搅拌2.5h。在-78℃下，添加另外的甲基氯化镁(3m，于thf中，61µl)并继续搅拌30分钟。用水(20ml)淬灭反应并在真空中去除thf。将1mhcl添加至水层中，直至ph3。将水层用etoac(2×30ml)萃取。将合并的萃取物经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗残余物通过快速柱色谱(0-35%etoac/庚烷)纯化以获得410mg(76%)作为灰白色固体的1-(环丙基甲基)-6-(2-羟基丙-2-基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯ev-aw6273-002。lcms(方法d)：保留时间：1.23min,m/z=289(m+1)。
根据方案1、方案1.1、方案1.2和上述程序来合成以下化合物：
生物测定
使用下文所描述的测定方案来测定作为pad4的抑制剂的本发明的化合物。
将化合物溶解于100%dmso中以实现100mm最终化合物浓度。将化合物储备溶液储存在室温下。在dmso中制备一系列稀释液并以20μl混合体积混合8次。最终测定条件如下：
反应体积：20µl
测定缓冲液(如前所提及)：100mmtris-hcl(ph7.6),2mmdtt,1mmcacl2
最终浓度：
-100nmhpad4酶
-50µm(8倍子-km)底物肽
-0.5%dmso
总孵育时间：65min，在37℃下
终止溶液：40µl5%tca/acn
将0.25µl化合物溶液添加至10µl200nmpad4/测定缓冲液(100mmtris-hclph7.6,2mmdtt)中。在5min之后，添加10µl100µm底物/缓冲液(100mmtris-hclph7.6,2mmdtt,2mmcacl2)并将反应物在37℃下孵育60min。通过添加40µl5%tca/acn(1.7%tca最终浓度)终止溶液来淬灭酶促反应。将含精氨酸底物和含瓜氨酸产物(+1da质量位移)在agilentrapidfire(rf)300系统上进行固相萃取并在耦合的三相四极agilent6460qqq质谱(ms)装置上在应用多反应监测(mrm)下检测用于定量。
下表2显示本发明的所选化合物在上述pad4测定中的活性。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“a”的活性的化合物提供ic50<1μm；具有指定为“b”的活性的化合物提供1.0-5.0μm的ic50；具有指定为“c”的活性的化合物提供5.0-10.0μm的ic50；且具有指定为“d”的活性的化合物提供>10.0μm的ic50。术语pic50=-log(ic50)。具有指定为“e”的活性的化合物提供pic50<4；具有指定为“f”的活性的化合物提供4.0-5.0的pic50；具有指定为“g”的活性的化合物提供5.0-6.0的pic50；且具有指定为“h”的活性的化合物提供>6的pic50。“na”代表“未测定”。
表2.pad4活性
尽管我们已描述了许多本发明的实施方案，但显而易见的是，可以改变我们的基本实施例以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施方案。因此，应理解，本发明的范围由随附的权利要求书而非由通过实例的方式所表示的具体实施方案来定义。