壳聚糖作为胰脂肪酶抑制剂的用途的制作方法

文档序号：11090843阅读：838来源：国知局

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种壳聚糖作为胰脂肪酶抑制剂的用途。

背景技术：

肥胖是由机体能量代谢失衡导致的一种慢性营养性疾病，全球肥胖人群人数逐年攀升。研究表明肥胖是引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化(AS)、肿瘤、睡眠障碍、骨关节炎等多种疾病的重要因素。胰脂肪酶是水解膳食脂肪最重要的酶，能够将人体摄入的脂肪逐步水解转化为甘油和游离的脂肪酸，对人体脂肪堆积、肥胖形成具有重要意义，因此通过抑制胰脂肪酶的活性可以控制高脂饮食引起的肥胖。壳聚糖是一种天然的碱性多糖，由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。由于壳聚糖来源丰富，生理活性广泛，安全无毒，且具有良好的生物兼容性，在食品医药、农业、材料科学等领域具有很大的应用潜力。我们在实验中发现，平均分子量300kDa-1800kDa，最优选1200kDa±3kDa的壳聚糖可以有效抑制胰脂肪酶活性，这一发现，不仅拓宽了壳聚糖的应用范围，也为筛选具胰脂肪酶活性抑制功能的天然活性物质开辟新途径。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种壳聚糖作为胰脂肪酶抑制剂的用途。

本发明实现目的的方案如下：

壳聚糖作为胰脂肪酶抑制剂的用途，所述壳聚糖的结构式如式Ⅰ所示，式中n＝1800-11200。

优选的；所述壳聚糖的平均分子量为1200kDa±3kDa。

壳聚糖抑制胰脂肪酶活性的实验方法为：将壳聚糖用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解并稀释，得到壳聚糖溶液。然后向胰脂肪酶溶液中加入壳聚糖溶液，使壳聚糖与胰脂肪酶的质量比大于或等于2:1，37℃预处理15min后，向以上混合物中加入底物4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)启动反应，37℃恒温振荡15min。反应结束后，立即沸水浴终止实验，冷却后用酶标仪测量A_405nm。根据对硝基苯酚浓度吸光度(A_405nm)标准曲线，得到反应结束后体系中对硝基苯酚浓度，根据以下公式计算胰脂肪酶活性及壳聚糖对胰脂肪酶的抑制率：

式中：酶活力，U；对硝基苯酚浓度，μmol/L；反应终体积，mL；反应时间，min；酶液用量，mL。

本发明的优点：

1)本发明利用平均分子量300kDa-1800kDa，最优选1200kDa±3kDa的壳聚糖抑制胰脂肪酶活性，指出壳聚糖可作为胰脂肪酶抑制剂使用，扩展了壳聚糖的应用范围。

2)本发明明确了壳聚糖平均分子量与胰脂肪酶活性之间的关系，为筛选具胰脂肪酶活性抑制功能的天然活性物质开辟新途径。

附图说明

图1为本发明中使用的平均分子量为1800kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图2为本发明中使用的平均分子量为1500kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图3为本发明中使用的平均分子量为1200kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图4为本发明中使用的平均分子量为900kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图5为本发明中使用的平均分子量为600kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图6为本发明中使用的平均分子量为300kDa的壳聚糖样品的高效液相色谱图谱；

图7为本发明实施例提供的平均分子量300kDa-1800kDa的壳聚糖与胰脂肪酶在不同质量比条件下，壳聚糖抑制胰脂肪酶活力图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

不同平均分子量壳聚糖的制备方法：将高分子量壳聚糖(平均分子量为1800kDa，脱乙酰度为98.73％，记作CTS1)10g溶解于300mL 2％(体积分数)盐酸得壳聚糖溶液，向壳聚糖溶液中加入300ml 2％(体积分数)双氧水，60℃水浴分别反应10min、15min、25min、40min、50min，将反应后溶液用碱液中和至中性后，醇沉，离心后收集沉淀，冷冻干燥后即可得到平均分子量分别为1500kDa、1200kDa、900kDa、600kDa、300kDa的壳聚糖，分别记作CTS2-6。平均分子量的测定采用高效液相色谱法，如图1至图6所示，以平均分子量64650，80000，135350，300600，2000000，2100000Da的右旋糖酐标准品作为标准。

100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的CTS1溶液的制备方法：称取100mg CTS1，用100mL 50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解，配制成浓度为1000μg/mL的CTS1溶液；再分别量取适量1000μg/mL的CTS1溶液，分别用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)稀释，配制成100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL的CTS1溶液。

100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的CTS2-6溶液的制备方法同上述CTS1溶液的制备方法。

50μg/mL胰脂肪酶液的配制方法：称取10mg胰脂肪酶酶粉(15-30units/mg)，用200mL 50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解，配制成浓度50μg/mL的胰脂肪酶液，置于冰箱中备用。

0.01mol/LPNPB溶液配制方法：精确称取209mg PNPB，用100mL二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度0.01mol/L的PNPB溶液，置于4℃冰箱中备用。

对硝基苯酚浓度吸光度(A_405nm)标准曲线的绘制：称取适量对硝基苯酚，用50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解，并配制一系列具有一定浓度梯度的对硝基苯酚溶液，用未加对硝基苯酚的空白溶液作为参比，分别用酶标仪测量A_405nm，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A_405nm为纵坐标作图，即得到对硝基苯酚浓度吸光度(A_405nm)标准曲线(参考：江慧芳,王雅琴,刘春国,三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进.化学与生物工程2007,24(8),72-75)。

胰脂肪酶活性的测定采用对硝基苯酚法(参考：江慧芳,王雅琴,刘春国,三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进.化学与生物工程2007,24(8),72-75)，以对硝基苯酚作为标准。壳聚糖抑制胰脂肪酶活性的实验方法为：将壳聚糖用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解并稀释，得到壳聚糖溶液。然后向胰脂肪酶溶液中加入壳聚糖溶液，使壳聚糖与胰脂肪酶的质量比大于或等于2:1，37℃预处理15min后，向以上混合物中加入底物PNPB启动反应，37℃恒温振荡15min。反应结束后，立即沸水浴终止实验，冷却后用酶标仪测量A_405nm。根据对硝基苯酚浓度吸光度(A_405nm)标准曲线，得到反应结束后体系中对硝基苯酚浓度，根据以下公式计算胰脂肪酶活性及壳聚糖对胰脂肪酶的抑制率：

式中：酶活力，U；对硝基苯酚浓度，μmol/L；反应终体积，mL；反应时间，min；酶液用量，mL。

实施例1

分别取100μL各浓度的CTS1溶液(100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)或100μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液(空白对照)与100μL胰脂肪酶酶液(50μg/mL)、700μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液在37℃下预处理15min，充分混匀，CTS1与胰脂肪酶的质量比分别为2:1、5:1、10:1、20:1，然后分别向以上混合物中加入100μL 0.01mol/L PNPB溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下恒温振荡15min。反应结束后，立即沸水浴终止实验，冷却后用酶标仪测量A_405nm，反应设置三个平行。根据对硝基苯酚浓度吸光度(A_405nm)标准曲线，可得到反应结束后体系中对硝基苯酚浓度，根据以下公式计算胰脂肪酶活性及CTS1对胰脂肪酶的抑制率：