本发明涉及中药领域，特别涉及一种乌骨藤提取物及其用途。
背景技术：
：白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。我国白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)属于淋巴组织恶性肿瘤，根据免疫表型将急性淋巴细胞白血病分为B细胞型、T细胞型及T/B混合型，其中T细胞型ALL(T-ALL)是以T细胞增殖失控，大量分化障碍的T细胞恶性克隆性增生、积聚，从而大量T细胞浸润组织为特征的血液系统恶性疾病，占ALL的15％-25％。T-ALL患者预后差，特别是一些患儿。医学发展到今天，多种抗肿瘤药物联合的化疗方案及大剂量化疗的临床应用，使得T-ALL的预后相比过去有了较大改善，但总体缓解率仍是所有白血病类型中最低的，因此T-ALL的治疗仍是目前白血病治疗的难点和重点。由于肿瘤的发生发展是一个多基因互相调控的过程，白血病的分子病理学机制研究也已从过往的单基因的研究逐渐转移到多基因的信号通路调控及其信号网络调控的研究中。乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通光藤的藤茎，其化学成分主要有甾体酯苷、多糖、树脂、色素、有机酸以及生物碱等，药理作用广泛，有抗癌、平喘、降压、免疫调节、止痛、保肝利尿等，乌骨藤提取物在肝癌、胃癌、食管癌等消化系统肿瘤已有较好疗效，但乌骨藤提取物在血液病中的研究仍然缺乏，疗效不明确。技术实现要素：为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种治疗白血病效果良好、副作用小的乌骨藤提取物、其制备方法和用途。为解决上述技术问题，本发明一方面提供：一种含有乌骨藤提取物的药物组合物，所述乌骨藤提取物的提取方法为：取乌骨藤干燥藤茎，粉碎，用体积比为50-95％乙醇浸提2-4次，将浸提液合并减压蒸馏，浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏，将浸膏加入蒸馏水制成混悬液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重复萃取1-3次，有机相减压浓缩，即得乌骨藤提取物。在优选的实施方式中，所述药物组合物还含有其他活性成分。在优选的实施方式中，所述其他活性成分为雷公藤甲素、雷公藤乙素中的一种或多种。在优选的实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。在优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊剂、注射液、冻干粉针。本发明第二方面提供：一种乌骨藤提取物的制备方法：取乌骨藤干燥藤茎，粉碎，用体积比为50-95％乙醇浸提2-4次，将浸提液合并减压蒸馏，浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏，将浸膏加入蒸馏水制成混悬液后加入乙酸乙酯和/或丙酮萃取，重复萃取1-3次，有机相减压浓缩，即得乌骨藤提取物。在优选的实施方式中，所述萃取部分使用的有机溶剂为乙酸乙酯和丙酮的混合物。在优选的实施方式中，所述有机溶剂为乙酸乙酯和丙酮体积比为1：1的混合物。在优选的实施方式中，所述浸提使用的乙醇优选体积比为75％的乙醇，浸提次数优选为4次，每次5天。在优选的实施方式中，所述萃取步骤中加入的蒸馏水与有机溶剂的体积比为5:1～1:1，优选为4:1；重复萃取次数优选为3次。本发明第三方面提供：上述含有乌骨藤提取物的药物组合物在制备治疗白血病药物中的应用。在优选的实施方式中，所述的白血病为急性淋巴细胞白血病。在优选的实施方式中，所述的白血病与人早幼粒白血病细胞株HL-60相关。在优选的实施方式中，所述的白血病与人髓性白血病细胞株K562相关。本发明取得的优点和积极效果：1、本发明通过优化乌骨藤的提取方法，最终确定先采用一定浓度乙醇提取，在使用乙酸乙酯和/或丙酮萃取的方法制备乌骨藤提取物。使用上述方法获得的乌骨藤提取物对多种白血病细胞株均具有显著的增殖抑制作用，为新型抗癌药物的研发奠定了基础。2、本发明意外发现，将乌骨藤提取物与雷公藤甲素/雷公藤乙素等其他抗癌活性成分联合使用，治疗白血病的效果更佳，证实乌骨藤提取物与其他抗癌活性成分能产生协同增效效果，对使用复合制剂临床治疗白血病具有一定的指导意义。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。乌骨藤提取物的制备实施例1：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，95％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸馏水制成混悬液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，有机相减压浓缩得到乌骨藤提取物A1。实施例2：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸馏水制成混悬液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，有机相减压浓缩得到乌骨藤提取物A2。实施例3：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，50％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸馏水制成混悬液后加入0.5L乙酸乙酯萃取，重复萃取3次，有机相减压浓缩得到乌骨藤提取物A3。实施例4：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸馏水制成混悬液后加入0.5L丙酮萃取，重复萃取3次，有机相减压浓缩得到乌骨藤提取物A4。实施例5：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤粗提物浸膏。浸膏加入2L蒸馏水制成混悬液后加入0.25L乙酸乙酯和0.25L丙酮的混合溶剂萃取，重复萃取3次，有机相减压浓缩得到乌骨藤提取物A5。实施例6：取乌骨藤干燥藤茎10kg，粉碎，75％乙醇浸提4次，每次5天，将浸提液合并减压蒸馏浓缩并回收乙醇，得到乌骨藤提取物A6。试验例1：乌骨藤提取物治疗白血病效果初筛为筛选乌骨藤提取物对人白血病细胞的抑制作用，分别选择人早幼粒白血病细胞株HL-60和人髓性白血病细胞株K562进行试验。一、人早幼粒白血病细胞株HL-60试验当HL-60细胞长满时，分别给予相同体积的实施例1-6制备的乌骨藤提取物A1-A6，浓度均为10μg/ml，未加乌骨藤提取物组作为空白对照组，各组孵育24小时后采用新型四氮唑盐(MTS)还原法测定对乌骨藤提取物对HL-60细胞增殖的影响，记录吸光度(OD)值，并计算各组乌骨藤提取物对HL-60细胞的抑制率。每组乌骨藤提取物均实验重复3次，取3次实验数据的平均值作为最终抑制率结果，具体结果见表1。表1乌骨藤提取物对HL-60细胞增殖抑制率实验组HL-60细胞增殖抑制率A142.3％A250.7％A345.9％A455.8％A561.2％A621.8％试验结果显示，乌骨藤提取物A1-A5对HL-60细胞均有显著的增殖抑制作用，而未采用有机溶剂萃取的乌骨藤提取物A6对HL-60细胞的增殖抑制作用较小，证实仅采用乙醇提取后的乌骨藤提取物药理效果较弱。此外，与其他实验组相比，A2、A4和A5组增殖抑制作用更加明显，其中尤以A5组最佳，相比其他实验组具有统计学显著性差异，说明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作为萃取溶剂的方法得到的乌骨藤提取物药效最好。二、人髓性白血病细胞株K562试验当K562细胞长满时，分别给予相同体积的实施例1-6制备的乌骨藤提取物A1-A6，浓度均为10μg/ml，未加乌骨藤提取物组作为空白对照组，各组孵育24小时后采用新型四氮唑盐(MTS)还原法测定对乌骨藤提取物对K562细胞增殖的影响，记录吸光度(OD)值，并计算各组乌骨藤提取物对K562细胞的抑制率。每组乌骨藤提取物均实验重复3次，取3次实验数据的平均值作为最终抑制率结果，具体结果见表2。表2乌骨藤提取物对K562细胞增殖抑制率实验组K562细胞增殖抑制率A138.7％A252.4％A343.6％A449.2％A559.9％A624.7％试验结果显示，乌骨藤提取物A1-A5对K562细胞均有显著的增殖抑制作用，而未采用有机溶剂萃取的乌骨藤提取物A6对HL-60细胞的增殖抑制作用较小。此外，与其他实验组相比，A2和A5组增殖抑制作用更加明显，其中尤以A5组最佳，相比其他实验组具有统计学显著性差异，说明采用乙酸乙酯和丙酮混合物作为萃取溶剂的方法得到的乌骨藤提取物药效最好。试验例2：乌骨藤提取物与其他药物联用治疗白血病效果为验证乌骨藤提取物与其他抗癌药物对人白血病细胞的联合抑制作用，分别选择人早幼粒白血病细胞株HL-60和人髓性白血病细胞株K562进行试验。当HL-60和K562细胞长满时，分别给予相同体积的10μg/ml乌骨藤提取物A5、10μg/ml雷公藤甲素、10μg/ml雷公藤乙素、5μg/ml乌骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤甲素、5μg/ml乌骨藤提取物A5+5μg/ml雷公藤乙素，未加药物组作为空白对照组，各组孵育24小时后采用新型四氮唑盐(MTS)还原法测定对乌骨藤提取物对HL-60和K562细胞增殖的影响，记录吸光度(OD)值，并计算各组乌骨藤提取物对HL-60和K562细胞的抑制率。每组乌骨藤提取物均实验重复3次，取3次实验数据的平均值作为最终抑制率结果，具体结果见表3。表3乌骨藤提取物与其他药物联合对HL-60和K562细胞的增殖抑制率试验结果显示，各实验组对HL-60和K562细胞均具有明显的增殖抑制作用。此外，在给药量相同的前提下，乌骨藤提取物A5与雷公藤甲素、雷公藤乙素联合使用对白血病细胞的增殖抑制均产生了协同增效作用，细胞增殖抑制率均显著高于单独使用相同用量的乌骨藤提取物A5、雷公藤甲素或雷公藤乙素，产生了难以预料的优异增殖抑制效果。试验例3：乌骨藤提取物治疗白血病患者临床试验效果采用本发明实施例5制备的乌骨藤提取物对白血病患者临床治疗效果如下：病历1：何某某，男，16岁，浙江杭州人。一年前诊断为急性粒细胞白血病，实验室检查：红细胞2.91*1012/L，血小板60*109/L，白细胞92.0*109/L，其中原粒细胞占43％。骨髓象：有核细胞显著增生，原粒加早幼粒细胞为84％。经化疗药物和本发明药物联合治疗，七个疗程后，病情好转，不再出血，体温正常，食欲增加，临床检查无白细胞浸润表现，复查血象：红细胞4.2*1012/L，血小板210*109/L，白细胞1.6*109/L，其中原粒1％，早幼粒2％，晚幼粒3％，杆核7％，分叶核30％；骨髓象复查：有核细胞显著增生，原粒加早幼粒5.5％。患者自述服药后无明显不适。病历2：段某某，男，44岁，一年前诊断为淋巴细胞性白血病，实验室检查：红细胞1.2*1012/L，白细胞1.08*1010/L，血红蛋白71g/L，血小板计数98*109/L。骨髓象：骨髓有核细胞增生活跃，粒系以成熟期细胞为主；红系中晚幼红常见；偶见幼稚巨细胞，血小板少见。经化疗药物和本发明药物联合治疗，五个疗程后，病情好转，不再出血，体温正常，食欲增加，复查血象：红细胞3.2*1012/L，白细胞3.2*109/L，血红蛋白115g/L，血小板计数110*109/L。骨髓象复查：骨髓有核细胞增生活跃，可见粒系各期，以中晚期幼细胞为主，红系以中晚期幼红居多，可见血小板成堆。病历3：李某某，女，13岁，诊断为急性淋巴细胞白血病，实验室检查：红细胞2.8*1012/L，白细胞2.5*109/L，血红蛋白70g/L，血小板计数67*109/L。骨髓象：增生明显活跃，淋巴系增生异常，原始及幼稚淋巴细胞76％，血小板散在可见。确诊后经化疗药物(VDLDEX)和本发明药物联合治疗，七个疗程后，骨髓象完全缓解。试验结论：本发明制备的乌骨藤提取物能对临床急性白血病患者的淋巴细胞、人早幼粒白血病细胞株HL-60、人髓性白血病细胞株K562等均起到稳定、显著的抑制增殖，促进凋亡等作用；同时对正常人淋巴细胞安全，毒性小，适合作为白血病的治疗药物。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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