本发明属于天然高分子聚合物应用领域，具体涉及一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
聚谷氨酸是由D-/L-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合的链状阴离子多肽型聚合物。聚谷氨酸最初从日本传统的发酵食品纳豆的粘液中被发现。聚谷氨酸无免疫原性，在自然界或人体内均能被完全降解，食用、医药或化妆品用均安全无毒。目前聚谷氨酸可通过微生物发酵规模化制备。聚谷氨酸主链含有大量亲水基团，具有比透明质酸更强的吸水性。
美国专利US 8 486 467 B1公开了一种以分子量达100万以上的聚谷氨酸为原料的皮肤注射填充剂。该专利指出，与透明质酸填充剂相比，聚谷氨酸不是人体自身所含物质，它被机体降解消除的速度更慢，达到在体内留存更久的组织填充效果。另外，聚谷氨酸的发酵菌株为安全无毒的高产枯草芽孢杆菌，而透明质酸的发酵菌株为致病菌株兽疫链球菌，因此聚谷氨酸的使用安全性更高、发酵成本更低。该聚谷氨酸填充制剂专利的组成为1％～3％聚谷氨酸和0.1％～1％含钙盐溶液，用其对家兔皮肤进行48h填充实验，48h后填充物残留76％～77％。大于48h的填充情况没有进一步报道，若据48h填充物损失23.5％计算，到第32天(约1月)时填充物残留1％，推算出的填充维持时间约1个月。与目前应用的交联透明质酸填充剂维持时间6～12个月相比，该填充用聚谷氨酸制剂的维持时间短，需要改进制备方法延长填充维持时间，提高应用价值。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒的制备方法，得到可用于皮肤组织注射填充的安全有效聚谷氨酸注射制剂。
此外本发明还提供了一种上述注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒在用于增加组织容量的美容注射填充制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入去离子水中，搅拌均匀后，再加入聚谷氨酸盐，搅拌均匀，保温，得预混物；
(2)在步骤(1)所述的预混物中加入水性溶液进行匀浆，得匀浆物；
(3)在步骤(2)所述的匀浆物中加入pH调节剂和渗透压调节剂，得调节物；
(4)步骤(3)所述的调节物经分离收集凝胶颗粒物，灭菌处理即得。
上述制备方法，优选的操作方法为：
(1)将1.0～3.6份1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入90～110份去离子水中，搅拌均匀后，再加入20～35份聚谷氨酸盐，搅拌均匀，保温，得预混物，其中所述的份为质量份数；其中聚谷氨酸盐的重均分子量为150万～250万道尔顿；其中聚谷氨酸盐为聚谷氨酸钠、聚谷氨酸钾、聚谷氨酸镁、聚谷氨酸钙、聚谷氨酸锌中的一种或多种；其中保温温度为20～100℃；优选地，所述聚谷氨酸盐为聚谷氨酸钠，保温温度为40～80℃；
(2)在步骤(1)所述的预混物中加入水性溶液进行匀浆，匀浆至95％的凝胶颗粒粒径小于1.1mm，得匀浆物；其中水性溶液为含0～0.9％盐类水溶液；其中盐类为氯化钠(NaCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)中的一种或多种，包括含有结晶水的水合形式；优选地，80％的凝胶粒径在0.1～0.9mm之间；
(3)在步骤(2)所述的匀浆物中加入pH调节剂使pH为6.0～8.0，加入渗透压调节剂使渗透压为250～340mOsm/kg·H2O，得调节物；其中pH调节剂为NaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4、K2HPO4中的一种或多种，包括含有结晶水的水合形式；其中渗透压调节剂为NaCl、葡萄糖、甘露醇、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、山梨醇，包括含有结晶水的水合形式；优选地，所述的pH调节剂为NaH2PO4或Na2HPO4，pH为7.35～7.45，渗透压调节剂为NaCl，渗透压为280～310mOsm/kg·H2O；
(4)步骤(3)所述的调节物经过滤或离心法分离收集凝胶颗粒物，灭菌处理即得；其中灭菌条件为高压蒸汽110～160℃灭菌，时间为2s～40min；优选地，所述灭菌条件为120～155℃，时间为4s～30min。
一种如上所述的制备方法制备得到的交联聚谷氨酸凝胶颗粒。
一种如上所述的制备方法制备得到的交联聚谷氨酸凝胶颗粒，用于制备增加组织容量的美容填充注射剂中的应用。
一种如上所述的制备方法制备得到的交联聚谷氨酸凝胶颗粒，制备美容填充注射剂。所得注射剂以交联聚谷氨酸颗粒为主要成分，具有与人体相适应的pH和渗透压，通过高压蒸汽灭菌，可经针头注射于皮肤待填充部位。填充注射采用隧道注射法，针头斜面朝上，斜向进针，一边退一边推注，使交联聚谷氨酸颗粒进入皮肤待填充部位而发挥增加组织容量的作用；也可据需采用平铺、网状、点面结合等隧道组合方法注射，以更好达到立体注射效果。
聚谷氨酸在进行交联处理时，调节底物聚谷氨酸和交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚的比例，可获得不同交联程度的产物。一般情况下，交联底物和交联剂浓度越高，交联程度越大。在实验中发现，交联聚谷氨酸的交联程度不宜过低，否则会出现交联聚谷氨酸因不耐受灭菌高温而迅速液化的情况，液化产物易分散将削弱其作为组织填充剂的填充维持效果；交联聚谷氨酸的交联程度也不宜过高，否则在制备阶段会出现大量聚谷氨酸很难在少量水性溶液里搅拌混匀，甚至不能完全溶解的现象，最终不能获得均匀一致的交联聚谷氨酸。
本发明的制备方法首先通过制备特定交联程度的交联聚谷氨酸，再制成具有适宜pH、渗透压及粒径的凝胶颗粒，该凝胶颗粒能耐受高压蒸汽灭菌而不液化，最终使得注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒一方面能被安全地注射进入皮肤组织，另一方面也因其能以凝胶颗粒的形式驻留于皮肤组织而达到延长其填充维持时间的效果。
本发明的优点：(1)交联修饰后的聚谷氨酸，克服了聚谷氨酸易分散易降解的不足，具有延长组织填充维持时间的效果。将本发明制备的注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒用于增加组织容量的美容注射填充术中，临床疗效显著，安全性高。(2)聚谷氨酸是微生物来源、安全无毒的天然可降解聚合物，且具有超强的吸水保湿性能。本发明制备的注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒，是一类可用于注射美容的新型填充物，丰富了现有为数不多的可注射美容填充物品类，为广大对注射填充美容有需的患者提供更多选择，尤其是对现有注射美容填充物品类过敏的有需患者。
具体实施方式
结合实施例和对比例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚1.4g加入去离子水110g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量170万道尔顿的聚谷氨酸钠25g，搅拌均匀，100℃保温0.5h；加入0.9％NaCl水溶液1.0L进行匀浆，35000r/min匀浆约10s，至95％的凝胶颗粒粒径小于0.2mm，中位数为0.08mm；向匀浆物中加入约0.074g NaH2PO4和0.040g Na2HPO4，调节pH 6.5；再加入NaCl约0.65g，调节渗透压288mOsm/kg·H2O；5000r/min离心10min，收集沉淀层凝胶颗粒物；分装，157℃高压蒸汽灭菌3s即得。
实施例2
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚3.2g加入去离子水105g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量210万道尔顿的聚谷氨酸镁33g，搅拌均匀，90℃保温2h；加入0.9％NaCl水溶液0.9L进行匀浆，19000r/min匀浆约60s，至95％的凝胶颗粒粒径小于0.5mm；向匀浆物中加入约0.043g NaH2PO4和0.217g Na2HPO4，调节pH 7.40；再加入NaCl约0.815g，调节渗透压300mOsm/kg·H2O；过滤收集凝胶颗粒物；分装，115℃高压蒸汽灭菌38min即得。
实施例3
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚1.6g加入去离子水95g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量180万道尔顿的聚谷氨酸锌27g，搅拌均匀，80℃保温4h；加入去离子水1.5L进行匀浆，25000r/min匀浆约20s，至80％的凝胶颗粒粒径在0.01～0.6mm之间；向匀浆物中加入约0.091g的KH2PO4和0.145g的K2HPO4，调节pH 6.9；再加入甘露醇71.77g，调节渗透压260mOsm/kg·H2O；15000r/min离心5min，收集沉淀层凝胶颗粒物；分装，120℃高压蒸汽灭菌20min即得。
实施例4
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚2.0g加入去离子水100g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量220万道尔顿的聚谷氨酸钠28g，搅拌均匀，60℃保温5h；加入0.021％K2HPO4·3H2O水溶液1.6L进行匀浆，10000r/min匀浆约3min，至80％的凝胶颗粒粒径在0.05～0.8mm之间，中位数为0.1mm；向匀浆物中加入NaH2PO4·2H2O约0.065g，调节pH 7.35；再加入CaCl226.88g，调节渗透压280mOsm/kg·H2O；3000r/min离心3min，收集沉淀层凝胶颗粒物；分装，121℃高压蒸汽灭菌15min即得。
实施例5
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚2.5g加入去离子水100g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量240万道尔顿的聚谷氨酸钠30g，搅拌均匀，50℃保温6h；加入0.053％Na2HPO4·12H2O水溶液0.5L进行匀浆，30000r/min匀浆约15s，至80％的凝胶颗粒粒径在0.05～1mm之间，中位数为0.2mm；向匀浆物中加入KH2PO4约0.022g，调节pH 7.45；再加入山梨醇28.35g，调节渗透压310mOsm/kg·H2O；过滤收集凝胶颗粒物；分装，140℃高压蒸汽灭菌10s即得。
实施例6
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚2.8g加入去离子水100g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量200万道尔顿的聚谷氨酸钠31g，搅拌均匀，40℃保温8h；加入0.025％K2HPO4·3H2O水溶液2.0L进行匀浆，15000r/min匀浆约2min，至80％的凝胶颗粒粒径在0.1～0.9mm之间，中位数为0.4mm；向匀浆物中加入约0.242g的KH2PO4，调节pH7.7；再加入KCl 23.66g，调节渗透压320mOsm/kg·H2O；过滤收集凝胶颗粒物；分装，155℃高压蒸汽灭菌4s即得。
实施例7
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚3.6g加入去离子水100g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量250万道尔顿的聚谷氨酸钙35g，搅拌均匀，30℃保温9h；加入0.037％Na2HPO4·2H2O水溶液1.3L进行匀浆，18000r/min匀浆约60s，至80％的凝胶颗粒粒径在0.1～1mm之间；向匀浆物中加入约0.021g NaH2PO4·H2O，调节pH 8.0；再加入葡萄糖约64.07g，调节渗透压250mOsm/kg·H2O；过滤收集凝胶颗粒物；分装，160℃高压蒸汽灭菌2s即得。
实施例8
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚1.0g加入去离子水90g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量150万道尔顿的聚谷氨酸钾和聚谷氨酸钙各10g，搅拌均匀，20℃保温10h；加入0.9％NaCl水溶液1.2L进行匀浆，21000r/min匀浆约30s，至95％的凝胶颗粒粒径小于1.1mm；向匀浆物中加入约0.101g NaH2PO4和0.017g Na2HPO4，调节pH 6.0；再加入NaCl约2.76g，调节渗透压340mOsm/kg·H2O；9000r/min离心1min，收集沉淀层凝胶颗粒物；分装，110℃高压蒸汽灭菌40min即得。
对比例1
将1g重均分子量150万聚谷氨酸钠溶于80mL水溶液，再加入1g氯化钙，用水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min即得。
对比例2
将2g重均分子量210万聚谷氨酸钠溶于80mL水溶液，再加入0.9g氯化钙，用水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min即得。
对比例3
将3g重均分子量280万聚谷氨酸钠溶于80mL水溶液，再加入0.8g氯化钙，用水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min即得。
功效测试：兔耳皮肤填充试验
为突出和便于探查注射填充物的填充维持效果，选择在家兔耳部背侧皮肤进行皮内注射填充，局部集中的填充物使局部皮下组织量增加而使皮肤外表面呈明显隆起的外观，观察皮肤隆起状态的维持时间。选择健康新西兰家兔2只，1只作空白对照不注射，另1只进行注射填充试验。在接受注射的家兔左侧耳部选择4个注射部位，每个部位注射0.1mL生理盐水以及实施例1、实施例4、实施例5、实施例6制备的注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒。在接受注射的家兔右侧耳部相应4个部位，分别注射0.1mL生理盐水以及对比例1、对比例2和对比例3制备的注射填充用聚谷氨酸制剂。兔耳皮肤在填充物注射后观察48周，记录填充部位皮肤维持隆起状态的时间，其结果参见表1。填充部位皮肤维持隆起状态的检查，是通过目视和手指触觉检查填充物存在状态，拇指和食指同时触碰填充部位的上下两面，通过与注射部位周围平整表面、对照家兔同部位表面状况的对比来确认填充物的存在。
表1兔耳皮内注射填充不同聚谷氨酸制剂的维持时间
兔耳皮内注射填充聚谷氨酸制剂后，交联的聚谷氨酸制剂组和生理盐水组在注射部位会出现局部轻微发红现象，能在1～7天内自愈恢复正常；未交联的聚谷氨酸制剂组则出现局部红肿、皮肤发亮的现象，能在3～7日内自愈恢复正常。实验结束后，与空白对照的家兔相比，接受注射的家兔血常规正常，心、肝、脾、肺、肾等主要脏器经解剖未见明显异常。
由表1可见，未交联的聚谷氨酸制剂的对比例填充维持时间为1周，比生理盐水组略长，而交联聚谷氨酸凝胶颗粒的实施例的填充维持时间长达22～48周以上，填充维持时间明显长于未交联的聚谷氨酸制剂。未交联聚谷氨酸制剂呈溶液流体的状态，在注射部位受组织挤压易于分散和吸收，因此填充物维持效果不明显。
由表1进一步可见，在交联聚谷氨酸颗粒制备的步骤(1)得到预混物中，随聚谷氨酸钠和1,4-丁二醇二缩水甘油醚用量的逐渐增加(实施例1、实施例4、实施例5、实施例6)，以及步骤(2)得到匀浆物时交联聚谷氨酸颗粒粒径在一定范围内逐步增大(实施例1、实施例4、实施例5、实施例6)，最终获得的交联聚谷氨酸颗粒注射剂在兔耳皮内注射填充试验中显现更长的填充维持时间。这是由于一方面交联聚谷氨酸颗粒自身的交联度随交联处理时聚谷氨酸原料和交联剂的浓度增大而增加，交联度高则凝胶体的致密程度越高；另一方面，交联聚谷氨酸颗粒粒径的增大，实质上减小了与体液接触的表面积，两方面原因共同作用使得该颗粒抵抗高压灭菌高温降解和机体体液环境消化降解的能力越高，因此在填充试验中显现出更长的填充维持时间。
交联聚谷氨酸颗粒的注射推注试验
在美容注射填充术中，需要操作者精确控制注射速度和力量，为减小因注射中堵塞而使推注失控的风险，进行交联聚谷氨酸颗粒的注射推注试验。选取30G号注射针，安装在预灌装了不同交联聚谷氨酸颗粒的1.0mL注射针筒上，通过注射器推力试验仪设定推力10N，模拟皮肤内注射，观察注射活塞推进速率变化曲线。当注射活塞推进速率变化曲线为平稳平滑曲线，可认为注射推注连续均匀；如出现速率为0或出现波谷波峰起伏，则认为注射推注不连续均匀。交联聚谷氨酸颗粒实施例的注射推注速率变化情况参见表2。
表2灌装不同交联聚谷氨酸凝胶颗粒的注射推注测试
由表2可见，实施例制备的交联聚谷氨酸凝胶颗粒在注射推注测试中显现的推注连续均匀率≥98％，注射安全性较高。同时也可看到，随着交联聚谷氨酸凝胶颗粒粒径区间逐渐扩大，随大粒径颗粒特别是1.1mm左右的颗粒出现的几率逐渐增大，注射推注进程的连续均匀率稍微降低，即推注堵塞的风险有所上升，因此宜控制颗粒粒径95％的凝胶颗粒粒径在1.1mm以内。再结合兔耳皮肤填充试验表1结果可见，随交联聚谷氨酸颗粒粒径中位数减小，其在兔耳皮内填充维持时间逐渐缩短。综合考虑提高交联聚谷氨酸颗粒的推注安全性和延长填充维持时间，颗粒粒径不宜过大或过小。
聚谷氨酸的交联加热条件选择
交联聚谷氨酸颗粒制备步骤(1)得到预混物的过程中，升温有利于加速交联反应。为达到聚谷氨酸和交联剂的有效交联，观察到明显胶冻凝结的加热温度和耗费时间的关系见表3。
表3聚谷氨酸交联时所需的加热温度和凝结时间
由表3可见，在聚谷氨酸由流体交联转变为胶冻凝结的过程中，加热温度越高达到胶冻凝结的时间相应缩短。考虑到温度过高如实施例1可能带来操作烫伤的安全隐患，以及温度过低如实施例8耗用时间过长，综合优选适中的40～80℃，凝结时间自然随温度而确定。
另外，交联聚谷氨酸颗粒制备步骤(3)得到调节物中，选取pH调节至6.0～8.0，渗透压调节至250～340mOsm/kg·H2O，均是人体体液能接收的数据范围。为最大限度减小对人体注射部位生理环境的影响，优选人体组织液最适pH7.35～7.45，以及渗透压280～310mOsm/kg·H2O。
综上所述，本发明所公开的注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒在以增加皮肤组织容量为目的的注射填充制剂应用中，注射安全，不良反应情况发生率低，无严重并发症情况发生；其组织增容效果突出，且组织容量填充效果维持时间上显著长于未交联聚谷氨酸制剂的注射填充效果。