本发明涉及一类信号传导系统抑制剂化合物的制备及在治疗癌症临床应用方面的应用。
背景技术：
癌症已成为影响中国国民健康并造成重大经济损失的因素之一。传统治疗癌症的方法-手术、放疗、化疗和生物治疗对肿瘤病人病情的控制有一定的局限性。2001年，第一代靶向药物-格列卫的问世给癌症病人的临床治疗带来新的转机和希望，并具有临床疗效显著和毒副作用较小等优点。中国唯一自主研发的治疗非小细胞肺癌的靶向性药物-埃克替尼攻击的生物学靶点是表皮生长因子受体(egfr)，这与治疗非小细胞肺癌的吉非替尼的靶点雷同，缺乏靶点创新、适应症单一，总体反映了国内靶向原创药物的研发水平较欧美落后。加之，已问世的靶向药物在临床长期使用引起的病人耐药性和进口靶向药物价格昂贵，使得探求癌症新的生物靶点和研发新靶点靶向药物成为当务之急。signaltransducerandactivatoroftranscriptiontype3(简称为：stat3)是一种信号传导及转录激活因子，其蛋白作为治疗相关癌症的新靶点目前备受关注，stat3与头颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和白血病等诸多癌症的发生、转移和归巢密切相关。国际相关研究报道的stat3抑制剂还有：stat21(二代优化的化合物的生物活性没有提高)、stattic(没有化合物-蛋白相互作用的结构模型，结构优化无从着手)和香港中文大学研究报道的抑制鼻咽癌的葫芦素i(天然化合物修饰较难)。总之，现用于临床治疗的靶向性抗癌药物的靶点均趋于细胞信号传导通路的上游，容易引起耐药性，而基于stat3靶点的在研药物能有效的克服这一弱点。本项目采用国际先进的蛋白分子靶标的药物设计理念和高效的药物筛选流程，从近一百万个化合物构建的化合物库中筛选出第一代化合物，依据27个生物活性较高的化合物群建立了化合物的定量构效关系模型，优化后的先导化合物的生物活性较第一代显著提高，是国际stat3抑制剂研究领域的最新进展。项目申请人发现的第三代stat3抑制剂的活体生物活性评价较紫杉醇高两倍以上，符合口服药物的药代动力学标准及体内用药标准。本项目由河南省锐达医药科技有限公司研发，依托其一流的有机合成能力和先进的药物评价体系，并学习吸收世界先进的制剂工艺、药代、安全评价体系和丰富的药事管理经验等，必能达到预期效果，实现国家中长期科技规划的重点突破。
本发明人拟解决临床癌症靶向治疗中出现的药物耐药性问题。在参考世界先进的药物评价体系和制剂工艺的同时，运用其高效药研管理规范和临床转化方法开发中国独立知识产权的靶向型新药。本项目的研发成功将促成我国癌症治疗方法的重大突破，促进中国医药产业由仿制性模式向创新型模式转变，加速国家中长期科技发展规划的目标实现。同时我们将先进的药物筛选和具有中国特色的药物评价策略推广到国际制药领域，产品外销应用到癌症临床治疗，造就中国单品种靶向型药物在国际制药产业同类产品中的领先态势，同时申报中国cfda和美国fda的临床测试和生产批号，探求药物研发和申报“双轨道平行推进”的新型模式。本项目研发的stat3抑制剂突破了目前国内外癌症靶向治疗以表皮生长因子受体(egfr)、abelson酪氨酸激酶(abl)等信号传导上游靶点为主的局限，属于磺酰胺类，合成成本低廉，预计价格仅是埃克替尼价格的1/3，格列卫的1/20，研发成功有望成就中国第一个自主研发的新靶点靶向型新药，其特点为疗效显著、广谱抗癌、价格低廉和换代周期较短等特点，研发成功将提升中国医药产业的原创靶向型药物的研发水平，带动中国医药产业由仿制性产业模式向创新模式转化。本项目符合《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020)》重点领域优先课题：肿瘤及重大非传染性疾病的防治。
stat家族及生理机制：signaltransducerandactivatoroftranscription简称为stat，是信号传导及转录激活因子。stat家族包括stat1，2，3，4，5a，5b和6，是一组内源性的细胞转录因子。januskinase简称为jak，包括jak1，2，3和tyk2，是一组与stats息息相关的非受体型酪氨酸激酶。jak-stat有机配合构建一组重要的哺乳类动物的细胞信号传导途径，并能将许多重要的细胞因子信号从细胞体外传递于核内，从而控制靶标基因的转录和下游蛋白质的表达。多项相关的研究文献报道：jak-stat信号传导途径参于调节正常细胞的繁殖、分化和凋亡。所有哺乳动物的七个stats蛋白质都具有六个结构区域：n初端区(nd)，复合螺旋区(cc)，dna结合区(dbd)，连接区(ld)，src同源结构域2(sh2)，c终端区的转录激活域(cd)。细胞因子(cytokine)与受体结合触发受体的二聚体化(dimerization)或多聚体化(oligomerization)并让jaks磷酸化(phosphorylation)从而激活jak-stat信号，通过受体细胞膜内c终端区多处的特定酪氨酸的磷酸化并与stat的sh2区域结合，从而完成受体-stat的结合。stat的激活将未磷酸化的冬眠态stat的n段相互作用，形成的反向平行二聚体构象转化为磷酸化的激活态stat的sh2区域的双向交叉相互作用的平行构象。活化的stat3二聚体通过相关的输入载体(importin-alpha)的协助转移到细胞核内，并与特定的dna靶标结合(见图一)。核蛋白酪氨酸磷酸化(n-ptps)协助stat脱离dna并使stat非磷酸化，从而完成stat的激活态向冬眠态转化，并最终完成stat冬眠态-激活态-冬眠态的循环。细胞因子信号蛋白抑制因子(socs2)形成负调节循环，切断jak-stat信号的传导。活化stat蛋白抑制因子(pias)通过阻断dna和stat3的结合来抑制stat的活性(1)。
stat3与stat1与癌症的关系：在细胞繁殖和分化中，stat3在抑制细胞凋亡的白介素6(il-6)-gp130信号传导途径中起关键作用，例如，(白介素6(il-6))-gp130-stat3信号传导参与调控b细胞分化形成抗体的浆细胞。stat3参于多种白介素6(il-6)家族的信号传导途径，包括白介素6(il-6)，白血病抑制因子(lif)，睫状神经营养因子(cntf)，抑瘤素-m(osm)，心肌营养因子1(ct1)。stat3是多种激酶的下游调节因子，如：v-ab1，lmp1，v-eyk，htlv-1，c-src和jak家族。jak-stat3无间歇的亢奋可引起很多癌症，如：头颈部肿瘤(＞90％)，乳腺癌，急性骨髓性白血病(aml)，慢性淋巴性白血病(cll)。stat1是唯一的参与干扰素γ的信号传导来抑制细胞繁殖的stat家族成员，虽然stat1有时可与stat3一起激活，但主要是抑制细胞生长，stat1被认为是肿瘤抑制因子。剔除stat1基因并携带恶性肿瘤的小鼠，其肿瘤生长比野生型的发展更迅猛(2)。
stat3sh2区域作为药理学靶标的理论依据：stat蛋白由冬眠态转化为激活态并参于相关细胞因子的信号传导，其中包括两个重要环节：其一，通过自身细胞膜内终端多处特定磷酸化的酪氨酸与statsh2区域相互作用来完成受体招募stat的过程；其二，通过stat的c端特定磷酸化的酪氨酸(ptyr705)与对应stat的sh2区域的双向交叉相互作用，stat-stat形成平行构象的激活态二聚体。利用stat3，stat5在ptyr-sh2区相互作用的机理来阻断stat3，stat5的活性，以实现抑制异常stat3，stat5的信号在癌细胞中传导，是一诱导癌细胞凋亡并治愈癌症的极好的概念性框架(1-4)。
statsh2区域是一类拥有大约100个氨基酸的蛋白质模块。sh2区域的功能是特异性识别磷酸化的酪氨酸，并使其定位。在jak-stat信号传导途径中，酪氨酸磷酸化导致蛋白之间的相互作用，并形成瀑布式地活化。其中包括statsh2区域与胞浆内细胞因子受体的c-端磷酸化的酪氨酸的相互作用和二聚体中sh2区域与特定磷酸化的酪氨酸(ptyr705)交叉相互作用(3，4)。
sh2区主要的二级结构包括：两个α-螺旋和一个大的β-板状结构。细胞因子受体胞浆c端的多肽序列pyxxq与stat3sh2区域结合的特征和激活态二聚体中stat3c-端磷酸化的络氨酸多肽序列ppylktk与stat3sh2区域结合的特征共同展示stat3sh2与其它分子相互作用的特点。位于β-板状结构中央的n-端，精氨酸argβb5(r609/stat3，r618/stat5)是与磷酸化酪氨酸结合的关键部位，磷酸化酪氨酸侧链的两个氧分子与argβb5碱性氨基的侧链形成极性加静电的相互作用。磷酸化酪氨酸多肽的c端的氨基酸与statsh2一个深的疏水区域(其包括重要的特征氨基酸有w623/stat3，w641/stat5)相互作用。所以，我们选择的计算机配位模拟(docking)的力场区域主要包括磷酸化酪氨酸作用位点argβb5(r609/stat3，r618/stat5)和疏水作用位点(w623/stat3，w641/stat5)(3，4)。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题是提供了一类stat3信号传导系统抑制剂化合物的制备以及治疗癌症临床应用方面的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了下列通式的化合物作为stat3信号传导抑制剂在制备，以及治疗癌症临床方面的应用。
式i
其中，
r1、r5选自c1-6烷基，c1-6烷氧基，c1-6烷氧基羰基；
r2、r4选自c1-6烷基，c1-6烷氧基，c1-6烷氧基羰基；
r3选自芳基，杂芳基，取代杂芳基，芳基氧基，卤素，氰基，c1-6烷基，c1-6烷氧基，c1-6烷氧基羰基；
r6选自氢或者c1-6烷基；
x选自碳或者氮原子。
本发明中使用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链一价烃基，具有1-8个碳原子(即c1-8烷基)，优选1-6个碳原子(即c1-6烷基)，1-4碳原子(即c1-4烷基)或1-3个碳原子(即c1-3烷基)。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙级、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。
本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选的卤素基团为氟、氯或溴。
本发明所用的术语“芳基”是指具有一个单环或多个稠合环的5-14个碳原子的芳族碳环基。所述芳基优选具有5-10，5-8或5-6或6个碳原子。“芳基”的实例包括但不限于苯基，萘基和蒽基等。
本发明所用的术语“杂芳基”是指具有5-14个成员的杂芳族环基团，包括单环杂芳族和多环芳族环，其中单环芳族环与一个或多个其他芳族环稠合。杂芳基具有一个或多个独立地选自n、o和s的环杂原子。本发明所用的术语“杂芳基”范围内还包括的是其中芳族环与一个或多个非芳族环(碳环或杂环)稠合的基团，其中连接基团或点位于芳族环上。“杂芳基”实例包括但不限于吡啶基、嘧啶基、咪唑基、吡咯基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹啉基等。
本发明另一方面涉及上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)以4-氨基-1-萘酚为原料，与r1-5取代的芳基磺酰氯在室温下反应3-6小时，得到中间体(ii)：
2)将中间体(ii)经氧化银氧化反应1-300分钟得到醌式中间体(iii)：
3)将醌式中间体(iii)与r6取代的巯基三唑在室温下反应3-6小时，得到最终目标产物：
其中，x、r1、r2、r3、r4、r5、r6如前所述；所述室温是指20-30℃。
本发明的另一个方面涉及上述的化合物衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物中与stat3信号因子相关疾病的药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。
根据本发明，完全可以预期本发明化合物可用于治疗stat3敏感癌症，如头颈部肿瘤，乳腺癌，急性骨髓性白血病，慢性淋巴性白血病等。本发明所述的衍生物能够调节stat蛋白由冬眠态转化为激活态并参于相关细胞因子的信号传导以实现抑制异常stat3，stat5信号在癌细胞中传导。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本发明，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
在本发明合成式i化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以做适当改变的。
本发明的式i化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。
本发明式i所示的活性化合物可作为抗癌药物单独使用，或者可以与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
本发明人发现，分子对接的实验结果表明实施例化合物能与stat3蛋白sh2区间(domain)的关键氨基酸-赖氨酸k591和精氨酸r609，及sh2区间的疏水穴(主要由缬氨酸v637，谷氨酰胺q635，色氨酸w632，酪氨酸y640和酪氨酸y657构成)产生强相互作用，从而阻断多肽中磷酸化酪氨酸与该区间的相互作用，导致阻断stat3蛋白在细胞因子受体上面的附集和stat3蛋白活化双体构象的形成，进而达到抑制stat3信号传导，并起到诱导癌细胞凋亡的作用(见图2)。mtt细胞凋亡实验证据证明所述化合物能在亚微摩尔浓度下诱导一系列的对stat3信号传导依赖性强的乳腺癌癌细胞的细胞凋亡。蛋白免疫印迹(westernblot)的实验证据证明所述化合物能在亚微摩尔浓度下有效的抑制stat3的磷酸化和下游的信号传导。反转录聚合酶链式反应试验(rt-pcr)实验证据证明所述化合物可在亚微摩尔浓度下抑制stat3下游抗凋亡基因的表达。
附图说明
图1是stat3信号传导系统示意图；细胞因子(cytokine)与受体结合触发受体的二聚体化(dimerization)或多聚体化(oligomerization)，并使jaks磷酸化(phosphorylation)从而激活jak-stat信号，通过受体细胞膜内c终端区的特定酪氨酸的磷酸化使stat附集于受体上；被磷酸后，stat形成双向交叉相互作用的双体平行构象；转移到细胞核内，并与特定的dna靶标结合，诱导dna转录和下游蛋白的表达。
图2是实施例1中化合物s0460与stat3蛋白sh2功能域分子对接的实验结果，化合物s0460呈现在功能域盒子里，骨架碳原子(c)和末段氢原子(h)均无标记，其余各类原子均用原子符号标记-氧(o)，氮(n)和硫(s)；在stat3蛋白sh2区间上面，与stat3-i-q分子相互作用的关键氨基酸有：赖氨酸k591和精氨酸r609和色氨酸w632分别用k591，r609和w632标记；stat3蛋白sh2区间的beta-折叠，alpha螺旋和无规则卷曲分别用缓直带，螺旋带和细管表示。
图3是诱导乳腺癌癌细胞凋亡mtt实验和蛋白免疫印迹的结果。图中mtt细胞实验的结果以ic50(mmol/l)值进行表征，蛋白免疫印迹实验的结果以将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物膜上，根据抗原抗体特异原理，分别通过stat3、p-stat3、β-actin抗体检测相应蛋白表达量，结果如图，可以看到在不同药物作用下，随药物深度增加，mcf-7表达stat3、β-actin蛋白量不变，而p-stat3表达量呈下降趋势，药物明显抑制了p-stat3的表达。
图4是反转录聚合酶链式反应试验(pcr)结果。利用半定量rt-pcr测定相关抗调亡基因表达情况，验证不同药物浓度作用下mcf-7的生理情况；分别将不同浓度作用下的mcf-7，通过rna样品抽提、测定rna含量、样品反转录cdna、pcr扩增β-actin、bcl-2、survivin表达；分别对比抗调亡基因在不同药物作下表达情况，可以看出药物作用情况。
具体实施方式
下面通过具体的制备实施例和模拟以及生物学试验例进一步描述本发明，但是，应当理解为，这些实施例和试验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明的目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用的材料和操作方法是本领域公知的。
在本发明中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温环境下进行；更具体地，所述室温是指20-30℃；(ii)有机溶剂用常用干燥方法干燥，溶剂的蒸发使用旋转蒸发仪减压蒸发，浴温不高于60℃；(iii)反应过程用薄层色谱(tlc)跟踪；(iv)终产物具有满意的质子核磁共振(1h-nmr)和质谱(ms)数据。
实施例1：n-(3-((1h-1，2，4-三氮唑-5-)硫基)-4-羟基萘-1-基)-4-溴苯磺酰胺(化合物s060117)的合成
化合物s060117
1)n-(4-(4h)萘酮亚胺)-4-溴-苯磺酰胺的合成：
4-氨基-1-萘酚盐酸盐(1.95g，10mmol)固体溶解在15ml吡啶中，加入4-溴苯磺酰氯(3.82g，15mmol)，反应搅拌5小时后；tlc检测反应完全，蒸除吡啶，水洗残留固体并在乙酸乙酯中重结晶得到黄色固体，为n-(4-羟基-1-萘基)-4-溴苯磺酰胺。
将n-(4-羟基-1-萘基)-4-溴苯磺酰胺(3.76g，10mmol)分散于50ml二氯甲烷中，加入ag2o(2.78g，12mmol)，搅拌反应30分钟，tlc检测反应完全，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤，将滤液蒸干并使用乙酸乙酯进行重结晶，得到黄色固体粉末，即n-(4-(4h)萘酮亚胺)-4-溴-苯磺酰胺。
2)n-(3-((1h-1，2，4-三氮唑-3-基)硫基)-4-羟基萘-1-基)-4-溴苯磺酰胺(化合物s060117)的合成：
3-巯基-1，2，4-三氮唑(2.53g，25mmol)溶于10mln，n-二甲基甲酰胺中，n-(4-(4h)萘酮亚胺)-4-溴-苯磺酰胺(3.76g，10mmol)投入该溶液，搅拌反应4小时，tlc检测反应完全后，将溶液倒入200ml蒸馏水中，有淡黄色固体析出，过滤并使用甲醇重结晶固体，得到淡黄色固体粉末1.76g，即n-(3-((1h-1，2，4-三氮唑-3-基)硫基)-4-羟基萘-1-基)-4-溴苯磺酰胺(化合物s060117)。1hnmr(300mhz，dmso)614.21(s，1h)，10.18(s，1h)，10.01(s，1h)，8.60(s，1h)，8.18(d，j＝7.3hz，1h)，7.90(d，j＝6.5hz，1h)，7.65(s，2h)，7.50(d，j＝7.4hz，4h)，6.90(s，1h).
与实施例1类似的方法，可以得到如下表所示化合物。
试验例1：分子对接(docking)实验
方法：为了提供一组合理的计算机预测的选择性靶标攻击stat3的化学探针，发明人用stat3sh2区的磷酸化络氨酸(py-705)结合区域作为计算机配位模拟(docking)位点，主要包括磷酸化酪氨酸作用位点r609和疏水作用位点w623。stat3sh2的结构坐标取于蛋白质结构数据库(pdbdatabank，id：1bg1)。分子对接(docking)的方法：所有的计算机配位模拟(docking)的实验均在discoverystudio2.5的操作平台上完成，所用的计算机配位模拟(docking)的工具为libdock。依据所选的位点(主要包括磷酸化酪氨酸作用位点rf09和疏水作用位点w623)计算，确定势能面(potentialgradient)并作计算机配位模拟(docking)的实验(3-5)。依据模拟(docking)的分数(score)和构象及相互作用分析。发明人选取最优的16个化合物作下游的实验测试。化合物s0460构象见图2。
试验例2：诱导乳腺癌癌细胞凋亡mtt的实验
方法：收集对数生长期mcf-7细胞，计数，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液即每孔5000个细胞；mcf-7细胞加化合物药物处理，加药终浓度为0.1、0.3、1、3、10、30、100、300(um/l)几个梯度，并继续培养48h；药物处理后，每孔加入噻唑蓝试剂50ul(1mg/ml)，37度孵育4小时，甩板弃去孔中液体，沥干水份，用滤纸吸净残留液，然后加入100ul二甲基亚砜，在水平震荡器上反应7-8分钟，至蓝紫色结晶完全溶解，上酶标仪读值，吸收波长为570nm，记录结果。
试验例3：蛋白免疫印迹(westernblot)实验
1、细胞培养及加药：
(1)取对数生长期mcf-7细胞，以胰酶消化后，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基制成密度为300000个/ml的单细胞悬液，以每孔加入2ml细胞悬液接种至6孔平底板中。
(2)37℃、5％co2培养箱孵育，待细胞贴壁后，实验组加入含不同浓度的药物，3，10，0，100(um)，1小时后加入浓度为1mg/ml白介素6(il-6)30ul刺激细胞，白介素6(il-6)终浓度为30ng/ml。
(3)继续培养0.5小时后，用ripa裂解液裂解细胞收集蛋白。
2、细胞收集和裂解
(1)去除上层培养基，六孔板中细胞用磷酸盐缓冲液(pbs)洗两次。加入预冷的ripa细胞裂解液(蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟与裂解液均以1∶100的比例提前加入混匀)160ul。用提前洗净的细胞刮子将细胞裂解液刮下来，收集到一个干净的1.5ml离心管中。
(2)在冰上放置，裂解30分钟，每隔一定的时间(6分钟)涡旋一次。
(3)4℃，12000rpm，离心12分钟。
(4)将细胞上清液移入到一个干净的离心管中。细胞上清分两部分：取5ul加入到1.5ml的离心管中用于bca测蛋白含量，再加入45ul的1×磷酸盐缓冲液(pbs)混匀备用；剩余的细胞上清定量都取140ul，加入5×sds上样缓冲液(loadingbuffer)35ul，混匀后在沸水中煮沸8分钟，离心后-20℃冰箱中保存。
(5)蛋白浓度测定步骤：
a、1×磷酸盐缓冲液(pbs)稀释蛋白标准品：
b、bca工作液配制：根据标准品和待测样品的个数，计算出总共所需a与b混合工作液的量。按bca试剂a与b体积比50∶1的比例，配制好工作液，涡旋振荡混匀备用。
c、将蛋白标准液和用磷酸盐缓冲液(pbs)稀释好的样品上清液(10倍稀释)各取25ul加入到新的96孔板中。然后再分别加入200μl的提前配好的bca工作液充分混匀。切记不要吹打产生气泡，盖紧96孔板板盖，在37℃恒温箱中反应30分钟。
d、取出96孔板恢复至室温3至5分钟，在酶标仪上测定在562nm波长的吸光度值，并作出标准曲线并计算出每个样品的1ul/protein含量以备蛋白上样。
3、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)
(1)固定制胶板，配制10％的sds-page分离胶。
按照下表配制分离胶：10ml
(2)将混好的分离胶分别加入到2块胶板中，加到离顶部1.0厘米的位置，用无水乙醇填满胶板，静置30至45分钟。
(3)分离胶凝好后，倒出剩余的无水乙醇，并用滤纸将剩余无水乙醇吸干净。
(4)按照下表配制5％浓缩胶5ml
(5)将配制好的浓缩胶缓慢地加入胶板中，避免产生气泡，插入样品梳，静置30至45分钟。
(6)取出蛋白样品，100℃水浴加热5分钟，转速10000rpm，离心10分钟。
(7)将胶板固定到电泳槽中，加入sds-page电泳缓冲液，拔出样品梳，按照顺序将处理好的蛋白样品加入到样品槽中。
(8)80v电泳40分钟。
(9)换电压120v电泳大约1.5小时直至溴酚蓝跑出胶体；
4、western-blot转膜
(1)将电泳完毕的sds-page胶放入tbst缓冲液中漂洗一次，蛋白胶放到转膜缓冲液中浸泡。
(2)将一层海绵垫在膜转移缓冲液中浸湿，用镊子夹到转膜仪上，按照海绵垫，三层滤纸，蛋白胶，聚偏氟乙烯(pvdf)膜，三层滤纸，海绵垫，顺序放好，对齐，夹起放到转膜仪上，操作时，滤纸、海绵垫均要在转膜缓冲液中浸湿。每层之间若有气泡应用玻璃试管轻轻滚动将其赶出。
(3)打开转膜仪，300ma转膜75分钟。
(4)将膜取出，放入tbst缓冲液中，60rpm水平震荡仪漂洗3次，每次8分钟。
(5)用5％牛血清白蛋白(bsa)封闭液20ml，60rpm水平震荡仪室温封闭2小时。
(6)用加有3μl一抗(stat3和p-stat31∶1000)的3ml抗体孵育液，4℃60rpm水平震荡仪过夜孵育。
(7)用10mltbst，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。
(8)用加有2μl二抗的20ml抗体孵育液，常温60rpm水平震荡仪孵育pvdf膜2小时。
(9)用10mltbst，常温60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10分钟。
(10)取化学发光底物试剂溶液a和溶液b各1ml，室温显色5分钟。
(11)用滤纸将膜上的液体吸干，机器曝片。
试验例4：反转录聚合酶链式反应试验(rt-pcr)
1、细胞培养及加药：
(1)取对数生长期mcf-7细胞，通过胰酶消化后，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基制成密度为100000个/ml的单细胞悬液，以每孔加入2ml细胞悬液接种至6孔平底板中。
(2)37℃、5％co2培养箱孵育，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，实验组加入含不同浓度的药物，1，3，10，30(um)，1小时后加入浓度为1mg/ml白介素6(il-6)30ul刺激细胞，白介素6(il-6)终浓度为30ng/ml。
(3)继续培养24小时后，按照rna提取试剂盒说明提取各组细胞的总rna。
2、rna样品制备：
(1)6孔板细胞生长密度为90-100％时，从无菌室取出，去其上清，每孔加trizol总rna抽提试剂1ml，摇匀，冰上消化5分钟，使用移液枪头吹打，吸取各孔液体到1.5ml离心管中。
(2)加0.2ml氯仿，轻摇15s，室温静置3分钟。
(3)4℃，12000rpm离心，15分钟。离心后液体分为三层，上层为无色水样层rna，中间白色为dna，底层红色为蛋白质，小心吸取上层无色液体转移至一个新的离心管中。
(4)取上清约0.4ml加入等体积异丙醇，室温静置10分钟。
(5)4℃，12000rpm，离心10分钟。
(6)弃去离心管中液体，加入75％乙醇1ml。
(7)4℃，7500rpm，离心5分钟，小心弃去上清，放在超净台中，鼓风干燥5-10分钟。
(8)加入20-30ul焦炭酸二乙酯(depc)水溶液，分装保存于-70℃冰箱备用。
(9)取2ul的总rna用k5500超微量分光光度计检测浓度与纯度。根据od260/od280和od260/od230的比值鉴定总rna纯度。od260/od280介于1.8-2.0之间说明纯度较好。
(10)取5ul的总rna与上样缓冲液1ul混合，经1％琼脂糖凝胶(含glered)，120v，电泳30分钟(电泳缓冲液为1×tae)，凝胶成像分析系统下观察rna的质量。如果rna无降解可行下一步实验。
3、cdna的合成
逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)，实验原理为：首先提取各组细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，在逆转录酶的催化作用下，在随机引物或多聚胸腺嘧啶(oligo(dt))或基因特异性引物的引导下合成互补的dna单链(complementarydna)cdna。再以此cdna为模板，在特异引物的引导下，进行目的基因的pcr扩增反应。由于该cdna是以mrna为模板逆转录得到的，所以扩增的目的基因序列为不包含内含子的可编码基因序列。
(1)cdna的合成
a.取无核酸酶的离心管在冰浴下依次加入以下溶液：
脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dntpmix)2.5mm/each4ul；引物混合物(primermix)2ul；rna模板(rnatemplate)1ug；无rna酶水(rnase-freewater)加至15ul，反应条件：70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
b.在冰浴中依次加入以下组份，轻轻用移液器混匀：
5倍第一链缓冲液(5×first-strandbuffer)4ul；逆转录酶(m-mlv)1ul，反应条件：42℃温浴50分钟，85℃加热5分钟，终止反应。
c.取2-3ul直接用于pcr反应或保存于-20℃。
(2)半定量pcr扩增目的基因
a.在冰上按顺序在pcr管里加入以下反应体系：
cdna2.5ul；正向引物(forwardprimer)(10mm)1ul；反向引物(reverseprimer)(10mm)1ul；2倍pcr预混酶(2×taqpcrmix)12.5ul；双蒸水(ddh2o)补至25ul。
b.pcr反应循环条件：
按以下温度循环：
1)预变性94℃5分钟；2)变性94℃30秒；3)退火61℃30秒；4)延伸72℃1分钟；5)重复2-4步骤30个循环；6)延伸72℃5分钟；7)4℃保存。
c.结果检测：反应结束后取5ul反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。
引用文献
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