一种治疗脂多糖/D‑氨基半乳糖胺诱导肝损伤的药物的制作方法

本发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种治疗脂多糖/D-氨基半乳糖胺(LPS/GalN)诱导肝损伤的药物。

背景技术：

肝功能衰竭时往往发生内毒素血症和脓毒症几率要明显增高，并且常常因有效药物缺乏导致高死亡率。因此，迫切需要对肝损伤开发有靶向性的且明确有效的药物疗法。脂多糖和D-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤小鼠是一种广泛使用的肝损伤模型。它多年来已被用于潜在治疗药物的初步药理学研究。半乳糖胺是肝毒性试剂，肝毒性主要是通过抑制肝细胞RNA和蛋白合成。脂多糖是可以诱导炎性细胞因子的产生的内毒素。这些促炎介质能够导致肝组织损伤。连翘(作为中国最著名的中药材之一)已被广泛用于治疗各种感染性疾病，如肾炎，溃疡、丹毒。连翘是传统的中成药双黄连的主要成分。连翘酯苷A是从连翘果实风干后提取的一种活性成分，已报告其有多个药理活性，包括抗炎，抗氧化活性。以往的研究表明，连翘酯苷A可以保护防止过氧化氢诱导的细胞凋亡和PC12细胞的氧化应激。此外，连翘酯苷A被发现在抑制LPS诱导的小鼠急性肺损伤和抑制LPS诱导的鸡法氏囊炎症反应。另外，还有研究发现连翘酯苷A对衰老加速小鼠有神经保护作用。LPS/GalN诱导的肝损伤是目前公认的肝损伤模型，本发明采用连翘酯苷A治疗LPS/GalN诱导肝损伤，并进一步研究其起效的机制，为肝损伤的治疗探讨新的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导肝损伤的药物，旨在解决连翘酯苷A对脂多糖/氨基半乳糖胺诱导的肝损伤的影响仍不清楚的问题。

本发明是这样实现的，一种治疗脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导肝损伤的药物，所述治疗脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导肝损伤的药物为连翘酯苷A。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述治疗脂多糖/D-氨基半乳糖胺诱导肝损伤的药物的动物模型，所述动物模型为：D-氨基半乳糖胺(GalN)800毫克/千克和LPS 50微克/千克(溶解在PBS中)腹腔注射诱导肝损伤模型。

本发明的另一目的在于提供一种所述动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

步骤一，七十五个小鼠随机分成五组，每组含有15只小鼠；

步骤二，I组:正常对照组，小鼠接受等量的PBS；II组:模型对照组，小鼠接受GalN 800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V组:连翘酯苷A治疗组，给予小鼠腹腔注射连翘酯苷A，剂量分别为15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，给药时间为LPS/半乳糖胺处理前1小时；

步骤三，收集用于后续分析的血液和肝脏组织。

进一步，所述连翘酯苷A减轻LPS/GalN诱导的肝脏病理损伤、丙二醛含量以及血清ALT，AST水平；连翘酯苷A抑制LPS/GalN导致的NF-κB激活、血清TNF-α、肝脏TNF-α水平；连翘酯苷A上调Nrf2和血红素加氧酶1的表达；连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的肝损伤的保护作用是通过激活Nrf2和抑制NF-κB激活而实现。

本发明提供的治疗LPS/GalN诱导肝损伤的药物，连翘酯苷A是从连翘果实风干后提取的一种活性成分，已报告其有多个药理活性，包括抗炎，抗氧化活性。本发明为了明确连翘酯苷A对LPS/GalN所致的小鼠急性肝损伤的保护作用，LPS(50微克/千克)/GalN(800毫克/千克)诱导构建小鼠急性肝损伤模型。小鼠给药LPS/GalN后1小时再给药连翘酯苷A。结果表明，连翘酯苷A可以减轻LPS/GalN诱导的肝脏病理损伤、丙二醛(MDA)含量以及血清ALT，AST水平。此外，连翘酯苷A抑制LPS/GalN导致的NF-κB激活、血清TNF-α、肝脏TNF-α水平。此外，发现，连翘酯苷A上调Nrf2和血红素加氧酶1的表达。结果表明，连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的肝损伤的保护作用是通过激活Nrf2和抑制NF-κB激活而实现。

附图说明

图1是本发明实施例提供的验证治疗LPS/GalN诱导肝损伤的药物的模型构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的各组小鼠血清ALT、AST水平示意图。

图3是本发明实施例提供的HE染色(200×)示意图；

图中：A:正常对照组；B：LPS/GalN组；C：LPS/GalN+连翘酯苷A(15mg/kg)组；D：LPS/GalN+连翘酯苷A(30mg/kg)组；E组：LPS/GalN+连翘酯苷A(60mg/kg)组。

图4是本发明实施例提供的各组血清和肝脏组织TNF-α水平示意图。

图5是本发明实施例提供的各组肝脏组织MDA检测结果示意图。

图6是本发明实施例提供的连翘酯苷A能够抑制被LPS/GalN诱导的NF-κB激活状态示意图。

图7是本发明实施例提供的连翘酯苷A对Nrf2和HO-1的表达的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的验证治疗脂多糖/D-氨基半乳糖诱导肝损伤的药物的模型构建方法包括以下步骤：

S101：七十五个小鼠随机分成五组，每组含有15只小鼠；

S102：I组，正常对照组，小鼠接受等量的PBS；II组，模型对照组，小鼠接受GalN 800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V组，连翘酯苷A治疗组，给予小鼠腹腔注射连翘酯苷A，剂量分别为15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，给药时间为LPS/GalN处理前1小时；

S103：收集用于后续分析的血液和肝脏组织。

下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1.材料与方法

1.1.材料

连翘酯苷A购自中国药品生物制品检定所(中国北京)。小鼠TNF-αELISA试剂盒购自R&DSystems公司(明尼苏达州明尼阿波利斯)。LPS(大肠杆菌，O55：B5)和D-氨基半乳糖胺均购自Sigma公司(圣路易斯，密苏里州，美国)购买的。抗PNF-kB p65亚基、抗NF-κB p65亚基、抗HO-1、抗Nrf2和抗β肌动蛋白的单克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz公司，加利福尼亚，美国)。丙二醛(MDA)，谷草转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所(南京，江苏，中国)提供。其它试剂均为分析纯级。

1.2.动物

雄性BALB/c小鼠，体重约18～22g，购自郑州大学实验动物中心(中国郑州)购买。将小鼠圈养在环境受控的房间(24±1℃，40％-80％的湿度)。他们被允许自由获得食物和水。动物实验流程按照美国国立卫生研究院公布的《实验动物关怀与使用指南》进行。

1.3.实验设计

D-半乳糖胺800毫克/千克和LPS 50微克/千克(溶解在PBS中)腹腔注射诱导肝损伤模型。探讨连翘酯苷A对LPS/氨基半乳糖诱导的急性肝损伤的保护作用。七十五个小鼠随机分成五组，每组含有15只小鼠：I组，正常对照组，小鼠接受等量的PBS；II组，模型对照组，小鼠接受D-半乳糖胺800毫克/千克和LPS50微克/千克；III-V组，连翘酯苷A治疗组，给予小鼠腹腔注射连翘酯苷A，剂量分别为15毫克/千克，30毫克/千克，60毫克/千克，给药时间为LPS/半乳糖胺处理前1小时。

收集用于后续分析的血液和肝脏组织。

1.4.细胞因子测定

LPS/GalN给药2小时后，收集动物血清和肝组织，检测TNF-α水平。血清和肝组织TNF-α的水平检测，根据制造商提供的ELISA试剂盒(R&D)说明进行。

1.5.肝酶的分析

肝细胞的损害是通过检测ALT和AST水平进行评估。血清ALT及AST的检测是在LPS/GalN给药8小时后进行。ALT和AST检测按照南京建成生物工程研究所购买的测试试剂盒说明书进行。

1.6.MDA含量测定

丙二醛(脂质过氧化的终产物)，是用来评估在肝脏脂质过氧化。肝组织MDA含量检测是在LPS/GalN给药8小时后进行，按MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。

1.7.组织病理学评估

肝组织固定，用10％缓冲的福尔马林，包埋在石蜡中，切片。经过HE染色，光镜下观察肝组织病理变化。

1.8.Western blot分析

根据T-PER组织蛋白提取试剂盒(Thermo公司)说明书提取蛋白。核和细胞质蛋白提取根据NE-PER核和细胞质提取试剂盒(Thermo公司)进行。蛋白浓度通过BCA蛋白测定试剂盒来确定。12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白。然后蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜用5％脱脂牛奶在室温下2小时，随后一抗(1：1000)4℃孵育过夜。接着，将膜用辣根过氧化物酶(HRP)标志的二抗孵育。通过使用ECL蛋白质印迹检测试剂盒进行检测的免疫活性蛋白。

1.9.统计分析

实验数据均以(±S)表示。正态分布数据的平均值之间的差异是使用单因素方差分析(Dunnett法)。P<0.05时组间差异有统计学意义，P<0.01时组间显著差异。

2.结果

2.1.连翘酯苷A能够降低LPS/GalN诱导的肝损伤模型的血清ALT、AST水平。

如图2，LPS/GalN模型组ALT和AST水平较正常组显著增加。连翘酯苷A治疗组较模型组下降。

2.2.连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的肝损伤模型病理改变的保护作用

病理变化

为了观察连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的小鼠肝损伤的保护作用，观察到一个光镜下肝组织病理学改变。如图3，正常对照组的肝脏切片显示正常肝小叶结构和细胞结构，从LPS/GalN模型组获得的肝脏切片显示显著病理变化，包括门静脉炎症，细胞坏死和炎症细胞浸润广泛。然而，连翘酯苷A治疗组肝损伤显著减轻。

2.3.连翘酯苷A对TNF-α产生的影响

用ELISA法检测血清TNF-α在血清和肝脏样品的水平。结果表明，LPS/GalN模型组血清和肝脏组织的TNF-α水平较正常对照组显著增加。连翘酯苷A能够抑制LPS/GalN诱导的肝损伤导致的的TNF-α上升，具有剂量依赖性(图4)。

2.4.连翘酯苷A影响脂质过氧化作用

丙二醛(MDA)，脂质过氧化的最终产物，被称为氧化应激的标志物。如图5，LPS/GalN模型组肝脏组织丙二醛含量较正常组增加显著。然而，连翘酯苷A治疗组MDA水平较损伤模型组显著降低。

2.5.连翘酯苷A对NF-κB激活的影响

NF-κB是主导炎症的一个转录因子。脂多糖可以促进NF-κB的活化并诱导细胞因子的产生。本研究结果显示：与正常组比较，LPS/GalN模型组小鼠肝脏组织NF-κB p65亚基细胞核中表达增加，细胞质中表达降低；而连翘酯苷A治疗组小鼠肝脏组织的NF-κB p65亚基较模型组，细胞核中表达减少，细胞质中表达升高(图6)。

2.6.连翘酯苷促进Nrf2的和HO-1的表达

NRF-2在组织细胞抗氧化防御系统中发挥重要作用。在本发明中，发现连翘酯苷A对Nrf2的和HO-1表达的影响是积极的。结果表明，LPS/GalN模型组肝组织胞核内Nrf2和胞浆HO-1的表达被上调。连翘酯苷A组的Nrf2和HO-1的表达较模型组进一步增强(图7)。

连翘，活性成分从连翘风干水果中分离，已报道具有抗炎，抗氧化，和抗氧化活性。在本发明中，发现连翘酯苷A对脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/GalN)诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用。结果表明，连翘酯苷A可以减轻LPS/GalN诱导的肝脏病理损伤，MDA含量，血清ALT，AST和水平。此外，连翘酯苷A抑制NF-κB活性，可以降低LPS/GalN诱导的急性肝损伤模型小鼠血清和肝组织TNF-α水平。此外，连翘酯苷A可以上调肝脏Nrf2和血红素加氧酶-1的表达。连翘酯苷A可能是一个有希望的治疗急性肝损伤的潜在治疗剂。血清ALT和AST用作肝损伤的生化指标。在本发明中，血清ALT，AST和肝组织的组织学分析被用来评估连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的急性肝损伤的保护作用。结果表明，连翘酯苷A显著降低血清ALT和AST水平。同时，组织学分析表明，连翘酯苷A可以减轻细胞坏死和炎性细胞浸润，显著减轻肝损伤。这些结果表明，连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的肝损伤有保护作用。TNF-α已被证明在肝损伤的发病中起重要作用。它可引起肝细胞坏死和器官功能衰竭并有助于肝损伤的严重程度。同时，TNF-α可以诱导其它细胞因子的产生。这些细胞因子增强和延续了炎症反应。此外，以往的报告表明，抑制TNF-α可以减轻肝损伤。因此，在本发明中对血清和肝脏中TNF-α的水平进行检测。结果表明，连翘酯苷A大幅抑制血清和肝脏中TNF-α水平。丙二醛，是脂质过氧化的最后产物，被用作氧化应激的标志物。结果表明，连翘酯苷A显著抑制降低LPS/GalN诱导的急性肝损伤模型小鼠肝MDA水平。结果表明，连翘酯苷A通过减少炎症和氧化应激来减轻LPS/GalN诱导的肝损伤。NF-κB是各种参与炎症反应基因的多效性调节剂。通常情况下，NF-κB被一类称为NF-κB抑制剂(IκBs)家族的抑制蛋白隔离在细胞质中。一旦用LPS刺激，IκBs被磷酸化和降解，导致游离NF-κB的释放。然后NF-κB进入细胞核，调节炎症细胞因子的表达。通过观察连翘酯苷A对NF-κB活性及IκB-α降解的影响，可以明确连翘酯苷A对细胞因子产生的抑制效果。结果表明，连翘酯苷A可以抑制NF-κB活化，并具有剂量依赖性。Nrf2是通过调节抗氧化酶的表达，在细胞抗氧化防御系统中起重要作用的一个转录因子。Nrf2的控制重要的抗氧化和解毒基因，如HO-1的协同表达。已经报道，HO-1在机体分布广泛，是一种具有抗氧化活性和氧化还原敏感性的应激诱导蛋白。结果表明，在LPS/GalN注射1小时后，肝组织细胞核中的Nrf2和细胞质中HO-1的表达均上调。然而，连翘酯苷A的Nrf2和HO-1表达进一步增加。结果表明，连翘酯苷A可以通过诱导氧化防御系统能力增强来降低LPS/GalN诱导的氧化应激。同时，先前的研究提示有Nrf2的和NF-κB之间具有相互作用。Nrf2的激活能抑制NF-κB信号传导途径；Nrf2的缺陷的小鼠增加LPS刺激可导致NF-κB活化的增加。因此，连翘酯A中抑制NF-κB活化的机制可能是由于其增强Nrf2的活化。

总之，本发明的结果表明，连翘酯苷A对LPS/GalN诱导的肝损伤有保护作用。达到这种保护作用的机制可能与其抑制NF-κB激活和激活Nrf2的作用有关。连翘酯苷A是可以预防和治疗LPS/GalN诱导的肝损伤的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。