本发明属于民族药领域，具体涉及一种用于糖尿病肾病的朝药复方提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
本发明是以中国朝鲜族民族医药学(简称：朝医药学)理论为指导，借鉴“组分中药”的概念，采用独特的药物提取分离技术，制备一种用于防治糖尿病肾病的提取物，该提取物可以单独或者填加适宜辅料后制备药物制剂。该提取物的原料药味组成主要依据朝医药学中的“四象医学”理论，参考临床防治“太阴人”“下消”的传统复方加减药味而成。以复方中总黄酮、总多糖及总皂苷的提取量和成分保留率为指标，优化复方提取、精制工艺。提取精制后通过大孔吸附树脂柱，分离出复方中7个有效组分。将各有效组分及总提取物作用于高糖诱导的hk-2细胞，考察其对高糖诱导hk-2细胞氧化应激的影响和对细胞纤维化的作用，以mda含量、sod活性和α-sma蛋白表达为指标，通过单因素实验筛选确定最佳有效组分比例，制备提取物。
糖尿病肾病(diabetickidneydisease，dkd)是由糖尿病引发的危害性较大的一类慢性并发症，亦是胰岛素依赖型糖尿病(insulindependentdiabetesmellitus，iddm)患者主要死因，其特点之一是糖尿病引起微血管病变最终致使肾小球硬化。在治疗糖尿病的进程中，随着治疗技术的不断提升，死于糖尿病急性并发症患者逐步减少，而近些年来，糖尿病慢性并发症如肾脏病变、眼底病变、心血管疾病已成为糖尿病患者致死、致残的关键原因。据统计，糖尿病患者中，dkd患者死亡率达60％，由于dkd致使肾功能衰竭的死亡人数比非糖尿病患者多17倍。近几年研究发现，不只是ⅰ型糖尿病会发展成为dkd，dkd也会出现于ⅱ型糖尿病中。
当今社会，在人们生活方式变更以及严重的人口老龄化等方面的影响下，dkd危害人类健康的趋势逐年上升，故积极治疗dkd显得格外重要。中老年易患有dkd，最初没有显著的临床症状，当肾病综合征呈现时，糖尿病病程已有10年之久。dkd患者发病早期会产生白蛋白尿，随后逐步出现大量蛋白尿，3-5年即进入尿毒症。目前尽管糖尿病患者出现dkd症状，却没有十分有效的治疗手段。因此，唯一奏效的方法就是早期诊断治疗。
目前，对于糖尿病肾病的发病机制仍未完全阐明，普遍认为是由众多因素联合作用所致，主要与肾内血流动力学异常、葡萄糖代谢紊乱、某些细胞因子的参与、氧化应激、遗传等因素相关。现代研究表明，糖尿病肾病肾脏病变涉及肾小球、肾小管、肾血管及间质，而肾间质纤维化(renalinterstitialfibrosis，rif)是dkd病理变化的主要原因之一。越来越多的人们开始研究rif的发生机制，原因在于rif在许多慢性肾病中可作为肾脏功能恶化的预测指标，并且较为准确。肌成纤维细胞(myofibroblast,myof)在肾间质中的累积是发生rif的重要因素之一，myof是由间质成纤维细胞激活产生，而间质成纤维细胞中36％是由肾小管上皮细胞向间充质细胞转化(epithelialtomesenchymaltransition,emt)而来。所以，研究emt在dkd的rif进程中所起的作用是十分必要的内容。
1995年，有人成功克隆出啮齿动物肾成纤维细胞的成纤维特异蛋白(fibroblastspecificprotein,fsp1)，发现这些蛋白在肾脏纤维化终末期的小管上皮细胞中有所表达，且上皮细胞标志物角蛋白表达降低，从而率先提出了emt的概念。此后，越来越多的emt研究中发现，肾小管上皮细胞在炎症、免疫反应等一定条件刺激下可转化为myof，其生理病理过程是一种分化完全的细胞，丢失了其原有的表型特点，转变为其他类型的细胞。emt的标志包括：(1)细胞间紧密连接消失。转分化的过程中，肾小管上皮细胞表皮黏附分子e-cadherin表达下降，黏附特性逐步消散，基底膜断裂从而导致细胞间紧密连接消失。(2)细胞极性消失。上皮细胞存在端-基极性，当上皮细胞转变为成纤维细胞时，极性会逐渐消失，破坏了肾小管上皮细胞的完整性，细胞易从基底膜脱落。(3)波形蛋白表达增多。在emt过程中，波形纤维蛋白(vimentin)会在细胞特异性中间纤维蛋白消失与细胞骨架蛋白微丝重组时出现，它是细胞骨架的中间纤维，在emt中表达增多。(4)α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)表达增多。α-sma是肾脏细胞转分化成为myof后合成的一种特征性蛋白，是myof的表型特征，α-sma蛋白的表达量间接表现了myof的数量以及肾脏纤维化的程度，在正常的细胞中微量表达，在emt过程中含量升高。此外，emt的发生机制尚未完全阐明，其有关的可能机制有：(1)某些间充质细胞决定基因被激活。纤维细胞特异蛋白-1(fsp1)、v-src、v-ras、v-mos、c-fos基因被激活，导致上皮细胞标识物如e-cadherin表达降低，间充质标识物如vimentin和α-sma表达明显上升，从而发生了emt。(2)emt受基质胶原成分的调节。ⅰ型胶原会促进emt的发生，ⅳ型胶原可保留近曲小管上皮细胞的细胞表型，但重组的α1链非胶原1(α1nc1)的结构会抑制ⅳ型胶原的原体，阻碍ⅳ型胶原的聚积，从而发生emt，在近曲小管上皮细胞中生成了大量的促纤维化因子转化生长因子-β(tgf-β)，进一步推动了emt的发生。(3)某些细胞因子及代谢产物的参与。细胞因子影响细胞纤维化主要是推动和控制两方面。有推进纤维化作用的因子如tgf-β，普遍认为是诱导emt的关键细胞因子。
大量研究表明，dkd发病机制中的另一种因素氧化应激(oxidativestress，os)也可引致组织细胞受损。os是指化学及环境等特定因素引发的机体内自由基数量增加，os产物如活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ros)过多生成，抗氧能力减弱，导致氧化及抗氧化系统无法均衡，进而造成机体组织细胞受损。众多的dkd发病机制中，糖代谢紊乱、糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，ages)途径、蛋白激酶c(proteinkinasec，pkc)激活途径以及肾小球毛细血管内压的提高均可激活os。ros可通过上述途径，增加细胞外基质(extracellularmatrixc，ecm)的合成，减少其降解，促进dkd的发展。当血糖浓度过高时，通过线粒体电子传递链产生大量的ros，ros损伤足细胞，使肾小球基底膜阴性电荷消失，肾小球滤过能力丧失，蛋白漏出。导致肾损伤的ros包括超氧阴离子(superoxideanion,o2-)，过氧化氢(peroxide,h2o2)和羟基自由基(hydroxylradicals,·ho)。清除此类超氧化物的酶包括谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,gsh-px)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)和过氧化氢酶(catalase,cat)，它们会催化超氧化物转化为o2和h2o，但血糖浓度过高时，超氧化物的形成速度会超过其被清除的速度随即发生os。检测os的指标有很多，糖尿病通常检测的是ros、rns和脂质过氧化物。
目前，西医治疗dkd主要以纠正代谢紊乱、消除症状为主，尚无特效治法和直接针对dkd的有效药物。通常主要是控制血糖、血压和血脂，同时配以血管紧张素ii受体拮抗剂(angiotensinⅱreceptorblockers，arb)或者血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymeinhibitors，acei)降低肾小球跨膜压力。在dkd的初期，缓解疾病的发展还可依靠药物的治疗，一旦进入肾病终末期，由于肾小球的硬化，依赖药物进行抗纤维化难以起效。药物治疗方案包括：利用降血糖药物或胰岛素控制血糖；用acei、钙拮抗剂等药物控制高血压；血小板黏附和凝集能力通过第3代降糖药物及抗凝药物的应用降低；以aris调节多元醇旁路异常；用氨基胍、苯甲酰噻唑、噻唑类衍生物等清除糖基化最终产物。
dkd中医学统一定名为“消渴病肾病”，中医认为dkd主要由消渴日久，缠绵不愈，使脏腑功能衰退，主要是阴、阳、气、血虚衰而致病。在病因病机理论上普遍统一为正虚邪实，气阴两虚为其根本，瘀血阻滞为其标。脾气衰弱，肝肾不足，淤血水阻为主要发病机制。中医诊治方法多以益肾健脾、活血利水为主。在临床个体化治疗中取得了一定疗效，但适合群体化治疗的药物开发尚未取得突破性进展，缺乏针对性强的具体产品。因此，积极探求dkd的防治方法和开发针对性强的药物成了世界各国急需解决的难题。
朝医药学有着自己独特的风格，它以东医理论为基础，结合中医药学理论，确立了本民族的医药学理论体系。体质辨证为朝医学当中独到的治病防病理论。按照每个人具有不同的体质特点，将社会人群分为四种人，分别是太阳人、太阴人、少阳人、少阴人，统计结果表明太阴人居多，占人群的50％以上。朝医临床曾调查糖尿病患者中患dkd的人数，结果显示太阴人占70％以上。
朝医学将dkd归于“消渴门”范围。查阅朝医药学经典著作和文献，消渴病肾病的命名来源于机体消渴日久，变为消瘅期的肾消显现的水肿、尿浊等相应临床症状，其病机特点是：禀赋有亏，气阴两虚，久之阴阳两虚，痰热郁瘀，聚积络脉，形成微小瘕，肺、脾、肾、肝、心渐次受伤。治疗dkd患者的过程中，根据朝医学理论结合患者体质特点和疾病本身给患者用药，选用的处方具有明显的治疗效果。
本发明提取物的原料药味包括：葛根、黄芩、山药、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麦门冬。葛根为豆科植物野葛(puerarialobate(willd.)ohwi)的干燥根；黄芩为唇形科草本植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi.)的干燥根；山药为薯蓣科植物薯蓣(dioscoreaoppositathunb.)的干燥根茎；藁本为伞形科植物藁本(ligusticumsinenseoliv.)干燥根和根茎；五味子为木兰科植物五味子(schisandrachinensis(turez.baill.))的干燥成熟果实；桔梗为桔梗科植物桔梗(platycodongrandiflorum(jacq.)a.dc.)的干燥根；升麻为毛茛科植物兴安升麻(cimicifugadahurica(t-urcz.)maxim.)的干燥根茎；白芷为伞形科植物白芷(angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.)的干燥根；麦门冬为百合科植物麦冬(ophiopogonjaponicus(thumb.)ker-gawl.)的干燥块根。
以上药味中，葛根清热解毒，生津止渴；黄芩收敛肺元，清热解毒；藁本发散表邪，祛风止痛；升麻发散风热，解毒升阳之效；麦门冬补肺和肺，五味子健肺直肺；山药以壮肺而有内守之力，桔梗以壮肺而有外攘之势；白芷具有祛风解表止痛作用。诸药合用，共奏补肺敛肺、润燥化痰、生津解表之功。
本发明原料药味的组成参考了传统朝药复方，该复方主要针对太阴人“肝大肺小”的体质特点、不良的饮食习惯及其特有的病机特征等，基于“大者泻之”、“小者补之”的综合治疗原则，结合“通利补肺泻肝”的临床治疗思路，选取了上述9味太阴人要药组成方剂。发明人在临床上将该方剂应用于太阴人的消渴病下消和消渴病肾病，已经取得了一定疗效。在该方剂以往的应用过程中，仅采用汤剂水煎服，日2次的简单制备和使用方法，并没有充分提取和富集药物的有效成分，使得有效成分含量相对偏低且不稳定。同时汤剂还存在患者顺应性差，携带运输不方便，长期贮存容易变质等问题。因此，有必要以药理活性为指标，依据处方中各药味的活性成分对该方剂制备工艺进行研究并优化出具体工艺参数，同时确定主要成分的含量范围，以期在提高药效、减少药物服用量的基础上确保质量稳定，为患者提供更好的防治dkd的药物。
“组分中药”的概念是在长期对中药的研究应用过程中提出的，以传统中医方剂为主，在中药药效理论指导下，依据中药复方的功能主治和临床应用，得出精简中药化学组分，简称为“组分中药”。“组分中药”是复方制剂，形式类似于天然药物，可作为新药研发的方向，其药理研究包括有效性、安全性、配伍合理性以及药理机制。本发明借鉴“组分中药”的概念，通过特定的提取、精制和富集工艺获得了上述方剂的“有效组分”提取物，该提取物的几种有效组分在特定配比时呈现出最佳药理活性。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种用于防治dkd的朝药复方提取物。一种用于防治dkd的朝药复方提取物中主要有效组分及重量配比为：总多糖100份、总黄酮5～15份、总皂苷3～12份。它是以葛根、黄芩、山药、藁本、五味子、桔梗、升麻、白芷、麦门冬为原料按一定比例配伍，采用特定方法制备的提取物。
本发明的另一个目的在于提供一种上述提取物的制备方法。与朝药复方现有的水煎煮法比较，本发明所述制备方法采用特定的提取、精制和有效组分分离纯化方法，使得有效成分含量相对提高，同时保持各有效组分之间的含量比例稳定，从而显著提高药效、减少药物服用量并确保药物质量稳定。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
所述的防治dkd的朝药复方提取物的制备方法，其特征在于，所述提取物的原料药组成及重量配比为：
葛根2～4份，黄芩2～4份，山药2～4份，藁本2～4份，五味子1～2份，桔梗1～2份，升麻1～2份，白芷1～2份，麦门冬1～2份。
所述制备方法包括如下步骤：
(1)按照所述重量份准备各原料药，各原料质量均应符合《中华人民共和国药典》2015版(一部)的规定；
(2)取上述原料药，采用20％～40％乙醇为溶剂提取，得提取液；
(3)采用吸附澄清法对提取液进行精制，得精制液；
(4)精制液通过d101型大孔吸附树脂柱，进行有效组分分离纯化，收集洗脱液；
(5)洗脱液浓缩干燥，得提取物。
上述原料药的单位处方组成优选为：葛根20g、黄芩20g、山药20g、藁本20g、五味子10g、桔梗10g、升麻10g、白芷10g、麦门冬10g。
所述步骤(2)中，原料药用20％～40％乙醇为溶剂提取2次，优选的，乙醇浓度为30％；
优选的，所述步骤(2)中，第一次提取溶剂用量为药材重量的8～12倍，提取时间为1h～2h；优选的，溶剂用量为药材重量的10倍，提取时间为1.5h；
优选的，所述步骤(2)中，第二次溶剂用量为药材重量的6～10倍，提取时间为0.5h～1.5h；优选的，溶剂用量为药材重量的8倍，提取时间为1h。
所述步骤(2)优选的技术方案为：
取上述原料药，采用30％乙醇为溶剂提取2次，第一次溶剂用量为药材重量的10倍，提取1.5h，滤过，第二次溶剂用量为药材重量的8倍量，提取1h，滤过，合并滤液，得提取液。
所述步骤(3)中，采用吸附澄清法进行精制，提取液浓缩程度为浓缩至料液比1:1～1:2，吸附澄清操作温度为60℃～65℃，先加入ztc1+1天然澄清剂b组分，用量为浓缩后提取液体积的5％～9％，吸附澄清后冷藏静置时间为12h～48h，取上清液离心，滤过，滤液加入澄清剂a组分，a组分用量为b组分的0.5倍，静置4h，滤过，得精制液；
优选的，提取液浓缩程度为浓缩至料液比1:1，吸附澄清操作温度为60℃，ztc1+1天然澄清剂b组分用量为浓缩后提取液体积的7％，吸附澄清后冷藏静置时间为24h；
所述步骤(3)优选的技术方案为：
提取液浓缩至料液比1:1，在60℃下加入ztc1+1天然澄清剂b组分，同时搅拌，b组分用量为浓缩后提取液体积的7％，吸附澄清后冷藏静置24h，取上清液离心，滤过，滤液加入澄清剂a组分，a组分用量为b组分的0.5倍，静置4h，滤过，得精制液。
所述步骤(4)中，取精制液通过处理好的d101型大孔吸附树脂柱，洗脱剂为10％～50％乙醇，洗脱量为3～5bv，洗脱流速为2bv/h，收集洗脱液；优选的，洗脱剂乙醇浓度为30％，洗脱剂用量为3bv；
所述步骤(4)优选的技术方案为：
取精制液通过处理好的d101型大孔吸附树脂柱，采用30％乙醇，3bv洗脱量，2bv/h流速洗脱，收集洗脱液。
所述步骤(5)中，取洗脱液减压浓缩，真空干燥或者冷冻干燥，粉碎，得提取物；或者进行喷雾干燥，得提取物。
作为本发明的一个优选实施方式，所述制备方法的具体操作步骤如下：
(1)按照所述重量份准备各原料药；
(2)取上述原料，加入药材重量8～12倍量的20％～40％乙醇，浸泡1h，第一次提取1h～2h，滤过，药渣加入6～10倍量的20％～40％乙醇，继续提取0.5h～1.5h，滤过，合并滤液，得提取液；
(3)取提取液浓缩至料液比1:1～1:2，在60℃～65℃下加入ztc1+1天然澄清剂b组分，用量为浓缩后提取液体积的5％～9％，吸附澄清后冷藏静置12h～48h，取上清液离心，滤过，滤液加入澄清剂a组分，用量为b组分的0.5倍，静置4h，滤过，得精制液；
(4)取精制液通过处理好的d101型大孔吸附树脂柱，用10％～50％乙醇，3～5bv洗脱量，2bv/h流速洗脱，收集洗脱液；
(5)取洗脱液减压浓缩，真空干燥或者冷冻干燥，粉碎，得提取物；或者进行喷雾干燥，得提取物；
作为本发明的一个更优选的实施方式，所述制备方法的具体操作步骤如下：
(1)按照所述重量份准备各原料药；
(2)取上述原料，加入10倍量的30％乙醇，浸泡1h，第一次提取1.5，滤过，药渣加入8倍量的30％乙醇，继续提取1h，滤过，合并滤液，得提取液；
(3)取提取液浓缩至料液比1:1，在60℃下加入ztc1+1天然澄清剂b组分，同时搅拌，用量为7％，吸附澄清后冷藏静置24h，取上清液离心，滤过，滤液加入澄清剂a组分，用量为b组分的0.5倍，静置4h，滤过，得精制液；
(4)取精制液通过处理好的d101型大孔吸附树脂柱，用30％乙醇，3bv洗脱量，2bv/h流速洗脱，收集洗脱液；
(5)取洗脱液减压浓缩，真空干燥或者冷冻干燥，粉碎，得提取物；或者进行喷雾干燥，得提取物。
本发明还有一个目的在于，提供上述朝药复方提取物在制备防治dkd的药物中的应用。
上述应用中，所述防治dkd的朝药复方提取物加入或者不加入药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂。
本发明所述药学上可以接受的辅料，可以包括但不限于：
稀释剂或填充剂：如淀粉、糊精、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、蔗糖、甘露醇、山梨醇、无机盐类中的一种或多种；
润湿剂：如蒸馏水、乙醇、不同浓度的乙醇溶液；
粘合剂：淀粉浆、纤维素的衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠溶液、明胶、蔗糖中的一种或多种；
崩解剂：如干淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基淀粉钠、泡腾崩解剂中的一种或多种；
润滑剂：如聚乙二醇、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、氢化植物油中的一种或多种；
矫味剂：如甜味剂、香料、香精中的一种或多种。
本发明的有益技术效果在于：
(1)提供了一种防治dkd的朝药复方提取物，该提取物主要由特定的有效组分按特定的配比构成，并呈现出最佳药理活性。经细胞实验证明，本发明提取物用于高糖诱导的hk-2细胞后，增加了细胞的sod活性、减少了mda的产生，而且可降低hk-2细胞的α-sma的表达。提示该提取物可通过抑制高糖诱导的hk-2细胞氧化应激和肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化，从而改善肾纤维化，并提高肾功能。
(2)本发明提取物提取工艺中，以主要成分为指标筛选出适当的提取溶剂，在尽可能提高有效成分提取率的同时兼顾成分协同效应，从而提高疗效、节约中药资源。原料药中，葛根的黄酮类化合物具有显著降血糖作用；黄芩主要包括黄酮类化合物，其中黄芩苷可显著降低红细胞山梨醇含量，能抑制诱导多种糖尿病慢性综合并发症的醛糖还原酶；山药的主要有效成分为山药多糖，具有降血糖作用；五味子中的五味子油可增加sod，清除机体内自由基，减少脂质过氧化，减少胰岛β细胞损伤；桔梗主要含有皂苷类成分，可抑制血糖升高；升麻中阿魏酸类化合物阿魏酸钠有减少尿蛋白的作用；白芷中的白芷香豆素可起到降低血压的作用；麦冬多糖可以保护且修复损伤的胰岛β细胞，降低血糖；综上所述，本发明选用总黄酮、总多糖及总皂苷为提取工艺中的含量测定指标。
(3)本发明提取物精制工艺中采用“ztc1+1”天然吸附澄清剂，可以去除提取液中鞣质、蛋白质、胶体等无效成分，对黄酮、生物碱、多糖、皂苷类、萜类、维生素等有效成分无影响。该方法可以显著降低提取物杂质含量，为后续工艺提供了方便，且具有安全无毒、无异味、不残留、经济实用等优点。
(4)本发明提取物有效组分分离纯化工艺中采用d101型大孔吸附树脂柱，可兼顾黄酮、皂苷、生物碱等多种有效组分。大孔吸附树脂(macroprousadsorptionresin,mar)是非离子型高分子吸附剂，具有多孔网状结构和较大的比表面积。将药液通过相应型号树脂柱，利用物理吸附法，可有选择性地吸附其有效成分，去除无效成分，富集有效组分。mar具有多种类型，根据不同的单体分子结构和极性，可分为非极性、中极性和极性三类，每种类型具有不同的型号。d101型mar可兼顾黄酮、皂苷、生物碱等多种有效组分的分离纯化。本发明选用d101型mar对精制液进行分离纯化，以黄酮、多糖及皂苷为测定指标，对洗脱后得到的组分进行含量测定。
主要药效学实验显示，本发明提取物具有控制血糖、抑制肾脏异常增大、组织损伤修复、控制小鼠过氧化损伤、抑制小鼠血清肿瘤坏死因子α的作用，并呈现量效关系。
具体实施方式
以下结合实验例和实施例对本发明进行更为详细的说明。
实验例1提取工艺研究
本实验设计水提、醇提二种提取方法进行提取，以总黄酮、总多糖及总皂苷含量为考察指标，优化提取工艺参数。
1.1原料药成分分析
原料药中葛根的黄酮类化合物葛根素对血液中的血糖含量有明显地降低作用，可预防治疗糖尿病。黄芩主要包括黄酮类化合物，其中黄芩苷可显著降低糖红细胞山梨醇含量，能抑制诱导多种糖尿病慢性综合并发症的醛糖还原酶。山药的主要有效成分为山药多糖，具有显著的降血糖作用。五味子中的五味子油可增加sod，清除机体内自由基，减少脂质过氧化，减少胰岛β细胞损伤。桔梗主要含有皂苷类成分，桔梗提取物可抑制血糖升高。升麻中阿魏酸类化合物阿魏酸钠有减少尿蛋白的作用。白芷中的白芷香豆素可起到降低血压的作用。麦冬多糖在某种程度上可以保护且修复损伤的胰岛β细胞，可降低血糖。综上所述，本研究选用总黄酮、总多糖及总皂苷为含量测定指标。
1.2总黄酮的含量测定
采取紫外分光光度法，测定复方提取液中总黄酮的含量。
1.2.1溶液配制
对照品溶液：精密称量芦丁对照品适量，用甲醇溶解，配成浓度为0.2mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密量取待测品1ml，用提取溶液稀释10倍，摇匀，即得供试品溶液。
1.2.2检测波长的确定精密量取芦丁对照品溶液2ml，置于25ml容量瓶中，加水至6ml，加入1.0ml5％亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加入1.0ml10％硝酸铝溶液，摇匀放置6min，继续加入10ml5％氢氧化钠试液，摇匀，加水定容，混匀后放置15min，以0.0ml对照品溶液为空白，于紫外可见分光光度计200-800nm处，测吸光度值。
测定结果表示在510nm处对照品溶液有最大吸收,故选择510nm作为测定波长。
1.2.3线性关系考察精密量取芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于25ml量瓶中，按1.2.2项下方法测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标(a)，对照品浓度为横坐标(μg/ml)，绘制标准曲线。得线性回归方程为：y＝0.0008x+0.0029,r＝0.9998。结果表明，总黄酮浓度在115～690μg/ml范围内与吸光度值线性关系良好。
1.2.4精密度考察精密量取芦丁对照品溶液2ml，按1.2.2项下方法重复5次测定吸光度，考察仪器的精密性。结果平均吸光度值为0.213，rsd值为0.281％。表明仪器精密性良好。
1.2.5稳定性考察精密量取样品溶液2ml，按1.2.2项下方法操作，在0，2，4，8，10，12h测定吸光度。结果平均吸光度值为0.560，rsd值为1.338％。表明待测样品液在一定时间内稳定。
1.2.6重复性考察分别精密量取样品溶液2ml5份，按1.2.2项下的方法测量吸光度值，验证方法的重复性。结果rsd值为0.905％。表明该法重复性良好。
1.2.7加样回收率考察量取已知含量样品溶液6份，分别精密加入适量芦丁对照品，制备不同含量的供试品溶液，计算回收率，结果总黄酮平均回收率为99.56％，rsd＝0.74％，表明本实验法具有较好的准确度及可行性。
1.3总多糖的含量测定
采用蒽酮-硫酸比色法，虽然蒽酮-硫酸试剂不稳定，但优于苯酚-硫酸比色法，苯酚更容易氧化，本实验显色剂现用现配，可避免显色剂被氧化。
1.3.1溶液的配制
蒽酮-硫酸溶液：量取蒽酮0.2g，加浓硫酸100ml，混匀即可(现配现用)。
葡萄糖对照品溶液：精确称取葡萄糖对照品100.0mg，置100ml容量瓶中,蒸馏水溶解稀释至刻度，从中精密量取10ml，置100ml量瓶中，继续稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：将提取液减压浓缩至500ml，待冷却至室温后，加入乙醇至醇含量在80％以上，不断搅拌，现象有大量沉淀生成，静置12h，离心，收集沉淀，沉淀用蒸馏水溶解并配成溶液，滤过，滤液定容至1000ml，摇匀，即得。
1.3.2检测波长的确定精确量取1ml葡萄糖对照品溶液，置于10ml具塞试管中，加入5ml蒽酮试剂，混匀,加塞密封，置于沸水浴中8min，取出流水冲洗冷却，室温静置10min。以未加葡萄糖的溶液为空白，于400-700nm波长范围扫描。
测定结果表示，580nm处对照品溶液有最大吸收，所以选择580nm作为测定波长。
1.3.3线性关系考察量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9ml葡萄糖对照品溶液，加水补足至1ml(冷水中进行)，摇匀，分别置10ml具塞试管中，按1.3.2项下方法测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标(a)，对照品浓度为横坐标(μg/ml)，绘制标准曲线。得回归方程为：y＝0.0069x-0.0128，r＝0.9998。结果表明，总多糖浓度在10.4-93.6μg/ml范围内与吸光度值线性关系良好。
1.3.4精密度考察精密量取葡萄糖对照品溶液1ml，按1.3.2项下方法，重复测定5次，测定吸光度，计算rsd值，考察仪器的精密性。结果平均吸光度值为0.827，rsd值为0.061％。表明仪器精密性良好。
1.3.5稳定性考察精密量取供试品溶液1ml，按1.3.2项下方法操作，分别于0，2，4，8，10，12h，测定吸光度，结果平均吸光度值为0.708，rsd值为0.509％。结果表明，溶液在一定时间内稳定。
1.3.6重复性考察精密量取同一批供试品溶液，按1.3.2项下的方法测量吸光度值，验证方法的重复性。结果rsd值为0.296％。表明该方法重复性良好。
1.3.7加样回收率考察量取已知含量的样品溶液6份，分别精密加入适量葡萄糖对照品，制备不同含量的供试品溶液，计算回收率，结果总多糖平均回收率为99.43％，rsd＝0.42％，表明本实验法具有较好的准确度及可行性。
1.4总皂苷的含量测定
对待测样品萃取后得到的皂苷类成分，采用紫外分光光度法，测定其吸光度值。
1.4.1溶液的配制
对照品溶液：精密称取三七皂苷标准品5mg，置于25.0ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即三七皂苷浓度为0.2mg/ml。
供试品溶液：提取液减压浓缩至500ml，从中精密量取10ml，置于分液漏斗中，加水至25ml，进行萃取。取水饱和正丁醇加至分液漏斗中，振摇萃取3次，每次20ml，分取正丁醇液，合并正丁醇液，用氨试液洗涤3次，每次20ml，分取正丁醇液蒸干，甲醇溶解其残渣，转移至25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4.2检测波长的确定精密量取三七皂苷对照品溶液1.0ml，置于10ml具塞试管中，在热水浴中蒸干溶剂，精密量取0.2ml5％香草醛-冰乙酸溶液，再加入0.8ml高氯酸，混匀，使残渣全部溶解，置于60℃水浴中，加热10min后取出于冰浴冷却，加入5.0ml冰乙酸，摇匀后，立即于400-700nm处波长范围扫描。
测定结果表示对照品溶液在560nm处有最大吸收，所以选择560nm作为测定波长。
1.4.3线性关系考察量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml三七皂苷对照品溶液，于10ml具塞比色管中按1.4.2项下方法测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标(a)，对照品浓度为横坐标(μg/ml)，绘制标准曲线。得回归方程为：y＝0.0039x-0.0298，r＝0.9994。结果表明总多糖浓度在19.2～96μg/ml范围具有较好的线性关系。
1.4.4精密度考察精密量取三七皂苷对照品溶液1ml，按1.4.2项下方法重复测定5次，测定吸光度，计算rsd值，考察仪器的精密性。结果平均吸光度值为0.301，rsd值为0.133％。表明仪器精密性良好。
1.4.5稳定性考察精密量取供试品溶液1ml，按1.4.2项下方法操作，分别于0，2，4，8，10，12h，测定吸光度，结果平均吸光度值为0.483，rsd值为1.066％。表明待测样品液在一定时间内稳定。
1.4.6重复性考察精密量取同一批供试品溶液5份，按1.4.2项下的方法测量吸光度值，验证方法的重复性。结果rsd值为0.234％，表明该方法重复性良好。
1.4.7加样回收率考察量取已知含量的样品溶液6份，分别精密加入适量三七皂苷对照品，制备不同含量的供试品溶液，计算回收率，结果总皂苷平均回收率为100.13％，rsd＝0.67％，表明本实验法具有较好的准确度及可行性。
1.5影响提取工艺的因素考察
1.5.1提取溶剂的选择以总多糖、总黄酮及总皂苷吸光度值作为考察指标，提取溶剂选择水、30％、80％乙醇，采用水煎煮法和加热回流法进行提取。取单倍处方量药材，加12倍溶剂浸泡1h，加热回流1.5h，滤过，药渣再用10倍量溶剂加热回流1h，滤过，合并2次滤液，定容至1400ml，最终减压浓缩至500ml。各取1ml提取浓缩液，测定3种组分的吸光度，结果见表1。结果表明，采用高浓度乙醇时，多糖的提取量低，以水为溶剂皂苷提取量低，以低浓度乙醇为溶剂可以兼顾总黄酮、总多糖及总皂苷的提取量，故确定以30％乙醇为提取溶剂。
表1不同溶剂提取各组分吸光度测定结果(
1.5.2浸泡时间与溶剂吸收率的考察精密称取处方量药材饮片，洗净，加溶剂浸泡，每隔20min称量药渣重量，至吸湿增重无显著变化为止。结果表明药材在经过60min的浸泡后，溶剂吸收达到饱和，吸水率为84.71％。
1.6提取工艺参数优化
1.6.1正交试验设计选用正交设计实验，以供试品中总黄酮、总多糖和总皂苷吸光度值为指标，确定提取工艺参数。提取时间和溶剂用量被确认为影响提取工艺的主要因素，故最终采用l9(32)正交设计。正交试验因素水平设计见表2，正交实验安排及结果见表3。
表2正交试验设计
表3正交试验结果表
1.6.2正交实验结果分析以各实验组总黄酮、总多糖和总皂苷的含量为指标进行分析，方差分析结果见表4～6。结果，因素b对总黄酮提取量有显著性影响，因素a对总皂苷有显著性影响，因素a、b对总多糖提取量均无显著性影响；多水平均值检验结果表明，对总黄酮提取量的影响a2>a1>a3，a1与a2间无显著性差异；b1>b2>b3，b1与b2间无显著性差异；对总多糖的影响a1>a2>a3，a1与a2无显著性差异；b1>b3>b2，b1与b3间无显著性差异；对总皂苷的影响a2>a1>a3，a1与a2无显著性差异；b2>b1>b3，b1与b2间无显著性差异。综合考虑能源消耗和工作量以及提取时间和溶剂用量对三种考察指标的影响，确定的最佳提取方案为a2b2，即溶剂用量为10，8倍；煎煮时间为90min，60min。
表4总黄酮方差分析结果
表5总多糖方差分析结果
表6总皂苷方差分析结果
1.7验证性实验
称取处方量药材，按正交实验确定的最佳提取工艺进行提取。做3次平行试验，测得样品中总黄酮总量为574.80±0.12μg/ml；总多糖的含量56.11±0.21μg/ml；总皂苷总量为107.53±0.26μg/ml与正交实验最大值594.55μg/ml(abs为0.764)、56.51μg/ml(abs为0.699)、108.32μg/ml(abs为0.747)相近。结果表明优选的最佳提取工艺相对稳定，具有可行性。
1.8小结
本发明提取物的效成分总黄酮、总多糖及总皂苷在相关文献报道中均可降低血糖浓度，在提取时应同等考虑，故以三者含量为指标进行优选，确定提取工艺参数。提取工艺参数为：以30％乙醇为溶剂，回流提取2次，溶剂用量为药材量的10倍、8倍，提取时间为1.5h、1h，即得提取液。
实验例2精制工艺研究
2.1提取液制备
按比例称取原料，照实验例1所述提取工艺参数提取，得提取液。
2.2精制工艺研究
采用“ztc1+1”天然吸附澄清剂，可以去除中药提取液中鞣质、蛋白质、胶体等无效成分，对黄酮、生物碱、多糖、皂苷类、萜类、维生素等有效成分无影响。该方法可以显著降低提取物杂质含量，为后续工艺提供了方便，且具有安全无毒、无异味、不残留、经济实用等优点，故选用ztc1+1天然吸附澄清剂对药材提取液进行精制处理。
2.2.1澄清剂的配制
a组分：称量10ga组份，加入少量蒸馏水，持续搅拌成糊状，加蒸馏水至1000ml，静止24h，搅拌，配制成1％粘胶液。
b组分：称量10gb组份，配制1％醋酸1000ml，将少量的1％醋酸先加至b组份中，持续搅拌成糊状，再加入剩余的1％醋酸，静止24h，搅拌，配制成1％粘胶液。
2.2.2吸附澄清法实验方案设计吸附澄清效果受多方面因素影响，其中提取液浓缩程度、药液温度、吸附澄清剂的用量、加入澄清剂时的搅拌速度，在很大程度上会影响吸附澄清的效果。在实际生产过程中，药液的温度通常在50℃～80℃；吸附澄清剂的用量普遍在药液总体积的3％～8％，需要通过观察澄清过程中，药液出现的絮状沉淀量及其澄明度来确定最终用量。本实验主要考察因素为药液的不同浓缩程度、澄清剂的用法用量、药液温度，通过观察药液精制前后的澄明度来确定最优方案。
2.2.3吸附澄清剂的用法用量对澄清工艺的影响
方案1：只加入a组分(药液总体积的8％)，静置24h，滤过。
方案2：只加入b组分(药液总体积的8％)，静置24h，滤过。
方案3：先加入a组分(药液总体积的8％)，静置24h，滤过后加入b组分(a组分用量的0.5倍)，静置6h，滤过。
方案4：先加入b组分(药液总体积的8％)，静置24h，滤过后加入a组分(b组分用量的0.5倍)，静置6h，滤过。
分别按上述方案操作，结果表明，吸附澄清剂的用法对澄清效果影响较大。精制后的澄明度结果为4>2>3>1，故选择方案4，即先加b组分，再加a组分。由于a组分对药液的澄清效果影响较小，所以本实验只考察b组分的用量即可。
吸附澄清剂b组分用量为7％和8％时均达到使药液澄清的效果，从生产实际角度考虑，吸附澄清剂b组分用量选为7％，a组分为b组分用量的0.5倍即可。
2.2.4药液浓缩程度对澄清工艺的影响将提取液浓缩至不同程度(以相当于原料的料液比表示)，加入澄清剂，静置24h观察结果。结果表明，相同条件下，药液浓缩至料液比为1:1时澄清效果最佳。
2.2.5温度对澄清工艺的影响取料液比1:1的浓缩提取液，保持不同温度下加入澄清剂，静置24h观察结果。结果表明，相同条件下，药液温度在60℃对澄清效果最佳。
2.3精制前后有效成分保留率的考察
采取上述吸附澄清工艺参数对提取液进行精制，测定精制前后提取液的浸膏得率、总黄酮含量、总多糖、总皂苷含量，结果见表7。结果表明，精制前后药液的浸膏得率显著下降，总黄酮、总多糖及总皂苷的平均含量无显著变化。
表7提取液精制前后有效成分保留率及浸膏得率
2.4小结
本实验选用吸附澄清法精制提取液，考察结果显示，在提取液中加入ztc1+1吸附澄清剂后显著提高了提取液的澄明度，降低了浸膏得率，对有效成分的含量无显著性影响。
最优吸附澄清工艺参数为：药液浓缩料液比为1:1，60℃下加入吸附澄清剂b组分，用量为7％，静置，滤过，滤液加入a组分(用量为b组分的0.5倍)，静置，滤过，即得精制液。
实验例3有效组分的分离纯化工艺参数研究
mar是非离子型高分子吸附剂，具有多孔网状结构和较大的比表面积。将药材提取液通过相应型号树脂柱，利用物理吸附法，可有选择性地吸附其有效成分，去除无效成分，富集有效组分。mar具有多种类型，根据不同的单体分子结构和极性，可分为非极性、中极性和极性三类，每种类型具有不同的型号。d101型mar可兼顾黄酮、皂苷、生物碱等多种有效成分的分离纯化。故本实验选用d101型对精制液进行分离纯化，以黄酮、多糖及皂苷为测定指标，对洗脱后得到的组分进行含量测定。
3.1d101大孔吸附树脂的预处理
(1)将d101型mar用95％的无水乙醇浸泡24h，并不时搅拌
(2)按照湿法装柱法装入层析柱中，用去离子水进行洗脱，洗脱流速设置为2bv/h，流出液与水体积比为1:5的混合液不再浑浊时，继续用水洗至无醇味。
(3)5％hcl通过树脂柱，用2bv洗脱量，以2～3bv/h浸泡2～4h，水洗至中性
(4)2％naoh通过树脂柱，用2bv洗脱量，以2～3bv/h浸泡2～4h，水洗至中性后备用。
3.2精制液中有效组分的分离及含量测定
照“实验例2”方法制备精制液，通过处理好的d101型mar柱，用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇及100％乙醇，3bv洗脱量依次洗脱，得到7组有效组分，标记为1-7号。7组有效组分中的黄酮、多糖及皂苷的含量如表8所示。结果表明，第5、6、7组有效组分中未见多糖成分；1～4组有效组分中总多糖、总黄酮及总皂苷含量比分别为1:0.012:0.067、1:0.098:0.072、1:1:0.238、1:0.727:0.273；5～7组有效组分总黄酮与总皂苷含量比分别为1:0.833、1:0.974、1:0.3。
表87组组分中的黄酮、多糖及皂苷的含量
3.3小结
实验选用d101型mar对精制液中黄酮、多糖及皂苷进行初步分离，达到了较好的分离纯化有效部位组分的效果，得到了7组有效组分，标记为1-7号，并提供了主要工艺参数。实验例4不同有效组分对氧化应激的影响研究
4.1溶液配制
(1)胎牛血清(fbs)灭活：55℃灭活30min
(2)10×pbs缓冲液的配制：nacl80g、kcl2g、na2hpo4·12h2o15.12g、kh2po42g溶于1000ml去离子水中，ph调至7.4后，分装、高压灭菌，4℃保存备用。
(3)低糖培养液的配制：取不含血清的rpmi1640培养液与无糖rpmi1640培养基等比例混合，加入fbs及青链霉素配制成含10％fbs、100u/l青链霉素、葡萄糖浓度为5.5mmol/l的混合培养液。
(4)高糖培养液的配制：用1×pbs溶解无水葡萄糖，使葡萄糖溶液浓度为2.45mol/l，0.22μm滤过除菌，4℃保存。使用时与低糖培养液按照1:100比例稀释。
(5)甘露醇溶液配制：用1×pbs溶解甘露醇，使甘露醇溶液浓度为2.45mol/l，0.22μm滤过除菌，4℃保存。使用时与低糖培养液按照1:100比例稀释。
(6)mda试剂盒组成与配制：
试剂一：液体20ml×1瓶4℃保存。
试剂二：液体12ml×1瓶，用时加340ml双蒸水混匀，4℃冷藏(避免碰到皮肤上)
试剂三：粉剂×1支，溶于90℃～100℃的双蒸水中，充分溶解后，加双蒸水补足至60ml，再加冰醋酸60ml，混匀，避光冷藏。
标准品：10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶，4℃冷藏。
(7)t-sod试剂盒组成与配制：
试剂一：用双蒸水稀释贮备液，定容至100ml，4℃保存。
试剂二：液体10ml×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体10ml×1瓶，4℃保存。
试剂四：贮备液与稀释液按1:14进行配制，现用现配，4℃保存。
试剂五：粉剂×1支，使用70℃～80℃双蒸水进行溶解，充分溶解后，加双蒸水补足至75ml，避光4℃冷藏。
试剂六：粉剂×1支，用时溶于75ml双蒸水中，避光4℃保存。
显色剂：试剂五：试剂六：冰乙酸按3:3:2的体积比配制，现用现配，避光4℃保存。
4.2细胞复苏
所用肾小管上皮细胞(hk-2)购自上海博谷生物科技有限公司。取出冻存的hk-2细胞立即置于37℃水浴中，融化后放在细胞超净台上，将冻存液移至t25中，加入5ml低糖rpmi1640培养液，注意缓慢滴加培养液，过程中前后左右轻轻晃动，在显微镜下观察后放于37℃，5％二氧化碳条件下进行培养。
4.3细胞传代
细胞覆盖率达80％以上时，即可进行传代。从培养箱取出细胞，吸去原有培养基，用pbs清洗三次，加入胰酶在37℃、5％co2培养箱中消化3min，加入相应体积培养液，吹打后移至离心管中，3000×rpm离心3min。弃去上清液，加入等体积的培养液均匀打散细胞，吹打后转移至培养瓶，放于37℃，5％co2培养箱中继续培养。
4.4细胞冻存
将处于对数生长期的细胞从培养箱中取出，吸去原有培养基，加入pbs洗三次，加入胰酶消化3min，消化后加入培养基，吹打后转移至离心管中离心，弃去上清液，加入fbs与dmso的混合液，二者比例为900μl：100μl，吹打后分装至灭菌后的冻存管中，置于-20℃、30min，-80℃过夜，取出放于液氮罐中长久保存备用。
4.5细胞毒性测定
4.5.1试样处理将通过大孔吸附树脂柱得到的7种有效组分和精制液冷冻干燥，称取各有效组分及精制液冻干粉20mg，1、2号组分用1ml水溶解，3号～7号以及精制液冻干粉用1mldmso溶解，标记为试样1～8号，作用于高糖诱导的hk-2细胞。每种试样按照一定浓度梯度作用于正常hk-2细胞进行细胞毒性测定，浓度梯度设置为3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml。
4.5.2mtt测定采用mtt法评价各组试样在hk-2细胞中的细胞毒性。将hk-2细胞种到96孔板中，密度为1×104个/孔，在37℃，5％co2条件下培养24h后，每组试样按“4.5.1”项下的浓度梯度加入孔板中，按上述条件培养24h。每孔加入100μlmtt溶液继续培养4小时。弃上清液后，再加入100μl/孔dmso溶解结晶，避光振摇10min。选用570nm波长测定每孔的吸光度。
4.6氧化应激试验
4.6.1细胞培养及分组根据mtt测定结果，每组试样选择合适的浓度进行氧化应激实验。将细胞分为11组，分别为对照组(ng)、渗透压对照组(man)、高糖组(hg)、给药组(1～8号试样)。待细胞覆盖率达80％以上且状态良好时，按照以上分组加入不同试样进行干预。在37℃，5％co2条件下培养24h后，取细胞上清液测定mda含量及sod酶活性。
4.6.2细胞上清液mda测定
(1)测定原理及意义：mda是过氧化脂质降解的产物，可与硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid，tba)缩合，形成红色产物。测试mda的量可间接反映由脂质过氧化引起细胞损伤的程度。
(2)操作方法：按照表9操作加样。涡旋混匀，用保鲜膜扎紧试管口，针头刺一小孔，用锅开盖煮沸40min，取出流水冷却，532nm处测定吸光度值。按照公式mda含量(nmol/ml)＝(测定od值-对照od值)/(标准od值-空白od值)计算。
表9mda测定操作表
4.6.3细胞上清液sod活力测定
(1)测定原理及意义：sod能清除超氧阴离子自由基(o2-﹒)，避免细胞受损伤。o2-﹒可氧化羟胺形成亚硝酸盐，与显色剂反应显紫红色。若测试样品中含sod，o2-﹒可被sod抑制，进而减少了亚硝酸盐的产生。酶标仪测定吸光度，不同样品的吸光度值有差异且均低于对照管的吸光度值，通过公式即可求出sod的活力。
(2)操作方法：按照表10操作加样。涡旋混匀，室温放置10min，于550nm处测定吸光度值。按照公式总sod活力(u/ml)＝(对照od值-测定od值)/对照od值/50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数计算。
表10sod测定操作表
4.7统计分析
用graphpadprism5.0程序(graphpadsoftware，usa)进行统计分析，p<0.05具有显著性差异。
4.8实验结果
4.8.1细胞毒性试验本实验采用mtt法，测定细胞存活率，考察试样对细胞的毒性。在hk-2细胞系中，1～8号试样在不同浓度下都显示出较低的细胞毒性。细胞存活率随着浓度的升高而下降。
4.8.2试样对高糖诱导hk-2细胞mda的影响高糖刺激hk-2细胞24h后，其上清液mda含量与ng相比显著升高(p<0.05)。为排除氧化应激是由于高糖的高渗透压所引起，本实验设立了man，man组细胞上清液的mda含量与ng组比较无显著性差异。与hg比较，给药组细胞上清mda含量均下降，给药浓度50μg/ml的2～8号均有显著性差异(p<0.05)，结果见表11。
表11试样对高糖诱导的hk-2细胞mda影响(
#p<0.05vsng；*p<0.05,**p<0.01vshg.
4.8.3试样对高糖诱导hk-2细胞sod活力的影响高糖刺激hk-2细胞24h后，与ng组比较，man组sod活力无显著性差异，hg组sod含量显著下降(p<0.05)。与hg相比，除浓度为200μg/ml的6号之外，其他给药组的sod含量均上升，其中25μg/ml的2号、3号和4号均有极显著性差异(p<0.01)，结果见表12。
表12试样对高糖诱导的hk-2细胞sod活力的影响(
#p<0.05vsng；*p<0.05,**p<0.01vshg.
4.9小结
dkd主要是持续处在高糖状态下的血管产生微血管病变所致。研究发现，高糖引起的微血管病变多数是由于自由基过多产生，且清除自由基的酶如gsh-px、sod、cat、过氧化物酶(peroxidase，pod)等活性降低，导致不能及时清除的自由基在体内积储，基底膜被脂质过氧化物损伤，进而减弱肾脏功能。
本实验选择mda和sod活力作为检测氧化应激的指标。通过测定mda的含量，以反映机体内脂质过氧化程度，可以间接了解细胞受损程度。sod可清除致毒的超氧自由基。致病因子的作用下，会产生过多的超氧自由基或者降低sod活力，从而导致疾病的发生与发展。研究发现，高糖诱导hk-2细胞，可升高细胞上清的mda含量且明显降低sod活力，证实了高糖作用下hk-2的ros产生增多，脂质过氧化程度提高，抗氧化能力降低。
本研究在高糖刺激hk-2中发现总提取物浸膏及各有效组分均具有使细胞上清液中的mda含量下降，sod活性升高的趋势。综合评价，在给药浓度相同时有效组分2号、3号、4号对两项指标结果影响最显著。
实验例5不同有效组分体外蛋白质印迹(westernblot)检测研究
5.1溶液配制
(1)10×电泳缓冲液(runningbuffer)的配制：分别精密称取sds10g、tris30.28g、glycine144.14g，加ddw至1000ml，充分溶解混合后调节ph至8.3，室温保存。
(2)转印缓冲液(transferbuffer)的配制：分别精密称取tris3.03g、glycine14.42g、甲醇200ml，加ddw至1000ml，充分溶解混合后调节ph至8.3，4℃保存。
(3)pbst缓冲液的配制：量取10×pbs缓冲液500ml，加ddw至4500ml，加入5mltween20，充分溶解，调节ph至7.4，最终定容到5000ml。
5.2总蛋白提取
将hk-2细胞按照2×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞贴壁并且状态良好时，根据氧化应激的结果选择试样的最佳浓度，按照“4.6.1”项下分组给样。48h后弃去上清液，加入预冷的pbs轻轻清洗细胞，用细胞刮子收集细胞，放入1.5mltube中，4℃、15000rpm离心3min，弃上清。加入ripa裂解液及p8340(1‰，v/v)200μl，充分涡旋30min，4℃，15000rpm离心15min，收集上清液，置于-80℃冰箱贮存备用。
5.3蛋白定量
采用bca法测定蛋白浓度。待测蛋白用pbs稀释至20倍，标准品(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml)和稀释后的样品各加入3μl至96孔板中，每个样品设3个复孔。再加入200μlbca工作液(试剂a：试剂b＝50：1)，充分混匀后放置于60℃烘箱孵育30min，冷却后用酶标仪于562nm处测定样品吸光度，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
5.4westernblot实验
5.4.1聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)胶的制备：分离胶(2块胶)的配制：加入40％acrylamide3.75ml、1.5mtris-hcl(ph8.8)3.6ml、10％sds150μl、ddw7.5ml、10％aps67.5μl、temed13.5μl配制成10％的分离胶；浓缩胶(2块胶)的配制：加入40％acrylamide495μl、0.5mtris-hcl(ph8.8)1080μl、10％sds45μl、ddw2.835ml、10％aps45μl、temed9μl配制成5％的浓缩胶。
(2)灌胶与上样：玻璃板用酒精清洗擦拭干净后固定在胶架上，加入适量制备好的分离胶于玻璃板之间，用水饱和正丁醇液封。待分离胶聚合后，倒掉正丁醇，用蒸馏水清洗并用滤纸吸干。将制备好的浓缩胶灌入玻璃板之间，迅速插上干净的梳子，注意避免产生气泡。待浓缩胶完全凝固后，将梳子拔掉，用蒸馏水清洗梳子孔里的胶。将制胶器放入电泳仪中，加足够的电泳缓冲液。上样体积根据测出的蛋白浓度计算出来，加入适量的缓冲液，离心，涡旋，再离心后放入95℃金属浴中加热5min，使蛋白变性。待样品冷却后，排出加样孔内的气泡即可上样。
(3)电泳：上样完毕后，接通电泳仪，起始电压为80v，待样品跑至浓缩胶与分离胶连接处时，升高电压至100v。
5.4.2转印将转印夹、海绵、滤纸浸泡在transferbuffer中，两张pvdf膜浸泡在甲醇中。电泳结束后，取出玻璃板，弃去浓缩胶，小心取出分离胶，按照海绵、滤纸、pvdf膜、胶、滤纸、海绵的顺序放入转印夹中，夹好赶走气泡，放入转印装置中，加入转印缓冲液使转印夹完全浸没，电压调至30v、4℃冰箱过夜转印。
5.4.3封闭及一抗的孵育取出转印后的pvdf膜，放入5％的脱脂牛奶中，室温下摇床孵育1h。牛奶封闭后取出膜放在pbst中洗35min。在15min、10min、5min、5min的时间点换液。将一抗按照一定的比例进行稀释，贴在洗后的pvdf膜上，4℃、摇床上孵育一夜。
5.4.4二抗的孵育一抗孵育后，按照上述方法洗膜。根据一抗的种类选择二抗，按照一定的比例稀释，贴在膜上室温下摇床孵育1h。孵育后将膜取出放在pbst中洗45min，在15min、10min、5min、5min、5min、5min时换液。
5.4.5显影、定影显色试剂按1:1比例混合，均匀铺在膜上孵育1～2min后放入暗匣内，暗室夹片一定时间后取出胶片，按照显影液-水-定影液的顺序进行洗片，再用清水漂洗后晾干。
5.4.6统计分析用quantityone(bio-rad公司)进行灰度分析，graphpadprism5.0程序(graphpadsoftware，usa)进行统计分析，p<0.05具有显著性差异。
5.5实验结果
α-sma是myof表型的特异性标志物，通过westernblot实验，对dkd中α-sma的表达进行半定量分析。α-sma在对照组中蛋白微量表达，不同试样干预48h后，man组与ng组比较，α-sma表达无显著性差异，hg组与ng组比较α-sma表达显著升高(p<0.01)；与hg组比较，给药组α-sma表达均有极显著性差异(p<0.01)，结果见表13。
表13试样对高糖诱导hk-2细胞表达α-sma的影响(
#p<0.05vsng，*p<0.05；##p<0.01vsng，**p<0.01vshg.
5.6小结
在早期，dkd普遍认为是由于肾小球病变引起的，现代研究发现肾小球病变的同时也可能发生肾小管病变，而肾小管病变与糖尿病肾病的肾功能有更密切的关系。肾小管上皮细胞在尿糖、氧化应激、尿蛋白等刺激条件下可引起肾小管间质纤维化。myof的累积是发展成为肾间质纤维化的重要因素，而α-sma是myof的表型特征。α-sma是sma中最主要的肌动蛋白微丝，除血管外，在其他部位仅有微弱的表达，作为平滑肌的特征性标记物，α-sma反映了平滑肌数量以及收缩功能的改变，具有较强的合成胶原的能力，进而形成纤维化。体外培养高糖诱导的hk-2细胞中，α-sma蛋白表达显著升高。多项研究显示，高糖浓度为30mmol/l时，hk-2细胞tgf-β1表达显著升高，而tgf-β1被公认为是致细胞纤维化的生长因子，故本实验选取的高糖浓度为30mmol/l，作用于hk-2细胞来模拟dkd体内的高糖环境。
本实验选用30mmol/l的高糖作用于hk-2细胞48h，与正常组相比，α-sma蛋白表达显著提高。为排除emt是由于高糖环境的高渗透压所致，本研究设计man组，在相同渗透压、相同培养时间的条件下培养hk-2细胞，结果表明，α-sma蛋白微量表达，与ng组比较无显著性差异，故高渗透压不能直接引起emt。研究表明有效组分作用于高糖诱导的hk-2细胞，与hg比较，给药组α-sma表达显著降低，结合临床观察和前期体内实验研究结果，提示本发明提取物可抑制rif的发生，对emt具有保护作用，从而提高肾功能，有效组分2号、3号、4号、5号、6号在较低剂量下具有显著影响。
实施例1本发明提取物的制备
配方：
制法：
(1)原料准备：按配方剂量称取原料，各原料质量均应符合《中华人民共和国药典》2015版(一部)的规定。
(2)原料提取：取上述原料，加入10倍量的30％乙醇，浸泡1h，第一次提取1.5h，滤过，药渣加入8倍量的30％乙醇，继续提取1h，滤过，合并滤液，得提取液。
(3)提取液精制：采用吸附澄清法进行精制，提取液浓缩至料液比1:1，在60℃下缓缓加入ztc1+1天然澄清剂b组分，同时搅拌，用量为7％，吸附澄清后冷藏静置24h以上，取上清液离心，滤过，滤液加入澄清剂a组分(用量为b组分的1/2)，静置4h，滤过，得精制液。
(4)有效组分分离纯化：取精制液通过处理好的d101型mar柱，用30％乙醇，5bv洗脱量洗脱，收集洗脱液。
(5)洗脱液浓缩干燥：取上述洗脱液进行冷冻干燥，收集干燥物，即得。
实施例2本发明提取物分散片的制备
配方：
制法：
(1)原辅料过100目筛，按上述重量配比混匀；
(2)取混合物置于湿法制粒机中，以40％乙醇为润湿剂，制软材，制粒；
(3)湿颗粒干燥，整粒，得干颗粒，加入硬脂酸镁，混匀，测定其流动性、粒度分布、含水量，得总混物料；
(4)取总混物料置于压片机中，压片，即得提取物分散片。
实施例3本发明提取物对糖尿病动物模型肾功能的影响
1实验材料与试剂
1.1实验动物6周龄，spf级，体重20±2g的昆明小鼠雄性80只。
1.2受试样品受试样品为根据本发明生产的提取物(长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室制备)(批号：20151103、20151109、20151115)。制备工艺同实施例1。
1.3动物实验室环境实验环境为spf级动物实验室，实验环境温度22±2℃，相对湿度57±2％,每3日清扫1次以保持笼内清洁。
2实验方法
普通饲料常规适应性饲养一周后检测血糖和尿蛋白，均为阴性者用于实验。随机分为正常组10只和造模组70只。造模组小鼠禁食不禁水12h以上，以浓度为170mg/ml的stz溶液单次给予腹腔注射。给药后72h，测定其空腹血糖值是否高于11.1mmol/l，若出现饮水量加大、排尿量加大并且血糖值高于11.1mmol/l的试验小鼠视为模型成功。模型动物随机分为低、中、高剂量组和对照组，每组10只。
3给药剂量及指标测定
设置低、中、高三个剂量组，相当于人体口服剂量的5倍量、10倍量和20倍量，折算为灌胃剂量分别是65mg/kg、130mg/kg、260mg/kg；对照组和正常组灌胃10ml/kg的水，每天1次，连续灌胃28d。
3.1体重和血糖测定药物灌胃4周后，停止灌胃治疗，禁食、不禁水24h，收集24h内的总尿量，然后称体重及尾静脉采血测小鼠空腹血糖。
3.2相对肾重测定称量取小鼠的体重，解剖后取出右肾并精细称重，相对肾重数值上等于肾重(mg)与体重(g)的比值。
3.3小鼠肾脏组织sod活性和mda含量的测定将小鼠处死后取出右侧肾脏，利用生理盐水清洗干净肾脏，用滤纸吸干其上水分，用转速3000-4000r/min的离心机将匀浆器捣匀后的组织离心，取其上清液，置4℃冰箱保存备用。依照试剂盒进行进一步测定。
3.4小鼠血清tnf-α含量的测定小鼠眼眶取血3ml～5ml，此血液样本置于室温12h，用转速为2500r/min的离心机离心10min，收集血清并做标记，于-70℃的低温条件下保存备用；依照试剂盒说明书，用酶标仪测tnf-α的值。
4实验结果
4.1提取物对小鼠空腹血糖(fpg)的影响模型组与正常组比较有极显著性差异，血糖值均高于11.1mmol/l，表明造模成功。给药2周后给药组血糖有所降低，4周后给药组血糖显著降低，与对照组相比均有极显著性差异，并呈现量效关系，结果见表14。
表14提取物对小鼠空腹血糖(fpg)的影响(
注：##1.模型组与正常组比较有极显著性差异：p＜0.01
**2.给药组与对照组比较有极显著性差异：p＜0.01
4.2提取物对小鼠肾重指数的影响模型组肾重指数与正常组比较均升高，具有极显著差异，表明肾脏有不同程度的增大。给药组肾重指数与对照组相比均降低，具有极显著差异，给药后模型动物肾脏增大的程度与未给药的模型动物相比有所缓和，表明本提取物针对dkd所引起的肾脏异常增大有控制作用，结果见表15。
4.3提取物对小鼠肾脏sod活性的影响与正常组相比，模型组sod含量均降低，表明模型组均呈现不同程度肾脏组织损伤。给药组的sod含量均高于对照组，且具有显著性差异，表明提取物能够对dkd小鼠氧化应激反应引起的小鼠肾脏组织损伤具有修复作用，并呈现量效关系，结果见表15。
4.4对小鼠肾脏mda含量的影响与正常组比较，模型组mda含量均升高。给药组与对照组比较mda含量均降低，并存在显著性差异，表明本提取物具有降低肾脏组织mda含量的作用，并呈现量效关系，结果见表15。
4.5对小鼠血清肿瘤坏死因子α含量的影响与正常组比较，模型组肾脏组织中小鼠血清肿瘤坏死因子α水平均明显上升。给药组与对照组比较tnf-α的含量明显降低，均具有显著性差异。表明，本提取物对dkd导致的肾脏组织中小鼠血清肿瘤坏死因子α含量异常升高具抑制作用，结果见表15。
表15提取物对小鼠肾脏各项指标的影响(
注：#1.模型组与正常组比较有极显著性差异：p＜0.01
*2.给药组与对照组比较有极显著性差异：p＜0.01
5结果分析
本实施例结果表明，本发明提取物能够降低血糖值，改善肾重指数，增加sod的活性，降低mda的含量，提示该提取物能够保护并修复肾脏组织受到的氧化应激而带来的病变伤害；提取物显著降低了肾脏组织中血清肿瘤坏死因子α的含量，提示其可以通过降低血清肿瘤坏死因子α的含量，对dkd小鼠的肾脏组织产生保护作用。随着给药剂量的增加，对dkd模型的作用依次增强，说明该提取物对dkd的作用存在量效关系。
本发明的保护范围不能认为只局限于上述具体实施方式及具体实例。对所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的基本前提下，还可以做出若干简单推演或等同替换，这些等同替换方案仍然将被视为在本发明的保护范围之内。