Tilifodiolide及其衍生物在制备治疗或预防II型糖尿病药物中的应用的制作方法

本发明属于药物
技术领域：
，具体涉及tilifodiolide及其衍生物作为有效成分及其与药学上可药用载体和赋形剂制成的制剂，以及它们在治疗或预防ii型糖尿病药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病主要分为两类，ⅰ型糖尿病和ⅱ型糖尿病。其中，ⅱ型糖尿病约占糖尿病总体人群的90‐95％以上。糖尿病发病率的不断升高，主要是由于ⅱ型糖尿病发病率的大幅攀升。ⅱ型糖尿病是一组发病机制仅部分获知的复杂代谢紊乱，其临床表征为胰岛素拮抗，过量肝糖生成，以及葡萄糖诱导的胰岛素在β细胞中分泌衰减。目前用于治疗ⅱ型糖尿病的口服药物主要包括五类：噻唑烷二酮类化合物(提高胰岛素灵敏度)；metformin等双胍类药物(降低血糖浓度)；α‐葡萄糖苷酶抑制剂(延缓肠内糖吸收和消化)；以及磺酰脲和非磺酰脲促分泌素(促进胰岛素分泌)。此外，dppiv抑制剂类药物(抑制体内glp‐1降解、促进胰岛素分泌)、glp‐1类似物类药物(促进胰岛素分泌)和sglt2抑制剂类药物(促进尿糖排出)是近10年来新上市使用的抗糖尿病药物。然而，这些药物都有各自的副作用和局限性，且均无法长期有效的治疗糖尿病。通过联合疗法以控制病人的血糖浓度，尽管可以在一定程度上治疗糖尿病，但研究证实仅靠这一种单一的方法，很难完全治愈糖尿病。因此，发现高效低毒的糖尿病治疗药物仍然是重大社会需求。tilifodiolide为tetraline型克罗烷二萜类天然产物，最早从墨西哥产的椴叶鼠尾草(salviatiliifoliavahl)中分离得到(j.org.chem.1990,55,3522‐3525)。椴叶鼠尾草(salviatiliifoliavahl)在我国是属于外来入侵植物，可能在对外种子交换时逸出而生植物，早期被鉴定为宾鼠尾草或杜氏鼠尾草(salviadugesiifernald)，后又被向春雷等人鉴定为椴叶鼠尾草(salviatiliifoliavahl)。tilifodiolide作为在植物中含量占干燥植物样品的0.2％(helveticachimicaacta.2004,87,949‐955)。tilifodiolide对夜蛾(spodopteralittoralis)有明显拒食作用(pestic.sci.1996,47,17‐23)，并可减轻粘虫(pseudaletiaseparatawalker)对蚕豆嫩叶的啃食(nat.prod.bioprospect.2011,1,81‐86)。到目前为止，未见tilifodiolide在糖尿病和ii型糖尿病方面相关的活性报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供式(i)所示的化合物tilifodiolide及其衍生物作为有效成分在治疗或预防ii型糖尿病药物中的应用，以它们为活性成分组成的药物组合物，以及它们的制备方法。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：式(i)所示的化合物tilifodiolide及其衍生物在制备治疗或预防ii型糖尿病药物中的应用，其中，x，y为氧或者氮原子；当x和y均为氧时r1和r2不存在，此时化合物为tilifodiolide；当x为氧原子时，r1不存在，y为氮原子，r2选自h、c1‐c10直链、环状(三元～十元环)或支链烷基、芳基和酰基；当y为氧原子时，r2不存在，x为氮原子，r1选自h、c1‐c10直链、环状(三元～十元环)或支链烷基、芳基和酰基；当x和y同时为氮原子时，r1和r2分别或同时选自h、c1‐c10直链、环状(三元～十元环)或支链烷基、芳基和酰基。如下结构式所示的tilifodiolide及其衍生物在制备治疗或预防ii型糖尿病药物中的应用，tilifodiolide及其衍生物与药学上可药用载体或赋形剂组成的药物组合物。化合物tilifodiolide的制备方法，该方法包括：取椴叶鼠尾草地上部分，干燥粉碎后以甲醇、乙醇、丙酮在室温下冷浸提取三次，每次24h，减压浓缩得提取物浸膏，该提取物用80‐100目1∶1.5聚酰胺拌样后，使用聚苯乙烯树脂柱层析对其进行分离，先采用50％乙醇‐水进行洗脱，然后用75％乙醇‐水洗脱，收集75％乙醇‐水洗脱部分，减压浓缩后用甲醇或乙醇结晶和重结晶获得tilifodiolide，母液部分用硅胶层析进一步纯化得到tilifodiolide。化合物2‐5的制备方法，该方法包括：取椴叶鼠尾草地上部分，干燥粉碎后以甲醇、乙醇、丙酮在室温下冷浸提取三次，每次24h，减压浓缩得提取物浸膏，该提取物用80‐100目1∶1.5聚酰胺拌样后，使用聚苯乙烯树脂柱层析对其进行分离，先采用50％乙醇‐水进行洗脱，然后用75％乙醇‐水洗脱，收集75％乙醇‐水洗脱部分，减压浓缩后用甲醇或乙醇结晶和重结晶获得tilifodiolide(1)，母液部分用硅胶层析进一步纯化得到1，然后再按如下流程制备得化合物2‐5：上述发明是在天然化合物库基础上，经过化学信息和生物信息筛选，选用ⅱ型糖尿病小鼠c57bl/ksjdb/db为模型，开展体内活性筛选发现的治疗糖尿病新型活性化合物。由于tilifodiolide在植物中含量高，而相关的植物是属于唇形科鼠尾草属植物，该植物是一年生草本植物，易于栽培，因此具有重要的应用价值。tilifodiolide可从中国产的椴叶鼠尾草(salviatiliifoliavahl)分离制备，tilifodiolide结构中含有两个内酯环，tilifodiolide在碱催化下与氨或胺反应生成内酰胺衍生物。式i所示tilifodiolide衍生物与药学上可药用载体和赋形剂制成的制剂在治疗或预防ii型糖尿病药物中的应用。可药用载体包括但不限于卵磷脂、维生素e、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、吐温或其他药物制剂用的表明活性剂、氧化铝、硬脂酸铝、离子交换材料、缓冲物质如磷酸盐、山梨酸、聚乙烯吡咯酮、纤维素物质、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、羊毛脂、环糊精等可用于促进本发明所述化合物、其药用盐或前药药物传递的载体。本发明所述的药物，可以包含tilifodiolide或其衍生物以及其它可药用辅料。可药用辅料包括但不限于：崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠等，粘合剂如聚维酮k30、微晶纤维素、褐藻酸钠等，填充剂如无水乳糖、淀粉、葡萄糖、乳糖珠粒等，润滑剂如十二烷基硫酸镁、硬脂酸镁等，以及其他赋形剂、增溶剂、香味剂、着色剂等。本发明所述结构式(i)的化合物tilifodiolide及其衍生物或其可药用盐及药物组合物可通过肠道或者非肠道途径给药，给药剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊、片剂等。本发明选用ⅱ型糖尿病小鼠c57bl/ksjdb/db为模型,连续灌胃给予tilifodiolide，实验结果提示tilifodiolide能显著减轻给药的db/db小鼠体重，与对照组相比显著降低给药小鼠的空腹血糖，改善糖耐量和胰岛素耐量；部分减轻肝脏炎症；一定程度上降低血甘油三酯含量。本发明发现的tilifodiolide在ii型糖尿病方面的应用尚无报道，因此tilifodiolide及其衍生物药用盐极有应用前景。除非另有说明，本发明使用的术语“烷基”是指直链或者支链的饱和一价烃基，其中烷基可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方式中，烷基是具有1到20(c1‐20)、1到15(c1‐15)、1到12(c1‐12)、1到10(c1‐10)、或者1到6(c1‐6)个碳原子的直链饱和的一价烃基，或者具有3到20(c3‐20)、3到15(c3‐15)、3到12(c3‐12)、3到10(c3‐10)、或者3到6(c3‐6)个碳原子的支链的饱和一价烃基。本发明使用的直链c1‐6和支链c3‐6烷基也被称为“低级烷基”。烷基的实施方式包括但不限于甲基、乙基、丙基(包括所有同分异构形式)、n‐丙基、异丙基、丁基(包括所有同分异构形式)、n‐丁基、异丁基、t‐丁基、戊基(包括所有同分异构形式)、和己基(包括所有同分异构形式)。例如，c1‐6烷基指具有1到6个碳原子的直链饱和一价烃基或者具有3到6个碳原子的支链饱和一价烃基。除非另作说明，本发明使用的术语“环烷基”是指环状饱和桥和/或非桥的一价烃基，其可以任选地被一个或多个本发明所述的取代基取代。在某些实施方式中，环烷基具有从3到20(c3‐20)、从3到15(c3‐15)、从3到12(c3‐12)、从3到10(c3‐10)、或者从3到7(c3‐7)个碳原子。环烷烃基的实施方式包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、十氢萘基和金刚烷基。除非另作说明，本发明使用的术语“酰基”是指直链、支链或环状的饱和一价酰基，其中烷基部分可以任选地被一个或多个取代基取代。在某些实施方式中，对酰基的烷基部分的要求如上对“烷基”的定义。除非另作说明，本发明使用的术语“芳基”是指单环芳基和/或包含至少一个芳香烃环的多环单价芳基。在某些实施方式中，芳基具有从6到20(c6‐20)、从6到15(c6‐15)、或者从6到10(c6‐10)个环原子。芳基的实施方式包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基(azulenyl)、蒽基、菲基、芘基、联苯基和三联苯基。芳基也指其中一个环是芳香族的和其他环可以是饱和的，部分不饱和的或者芳香族的二环或者三环的碳环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基或者四氢萘基(萘满基(tetralinyl))。在某些实施方式中，芳基也可以任选地被一个或多个取代基取代。附图说明：图1各组小鼠组织重量统计图；图2各组小鼠体重变化曲线图；图3各组小鼠血糖测定结果示意图；图4ogtt曲线及曲线下面积示意图；图5itt曲线及曲线下面积示意图；图6各组小鼠血清相关指标测定结果示意图。具体实施方式：以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不以任何形式限制本发明。除非另有说明，本发明中所使用的术语为本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合附图，用本发明的具体实施例并参照数据进一步来详细描述本发明，以下的实施例仅为举例说明本发明，不以任何形式限制本发明的范围。实施例1：tilifodiolide的分离提取：椴叶鼠尾草(salviatiliifoliavahl)地上部分10kg，干燥粉碎后以100％丙酮在室温下冷浸提取三次，每次24h，减压浓缩得浸膏230g。该浸膏用80‐100目聚酰胺(1：1.5)拌样后，使用树脂mcigelchp20p柱层析对其进行分离，先采用50％乙醇‐水进行洗脱，然后用75％乙醇‐水洗脱，收集75％乙醇‐水洗脱部分，减压浓缩后用甲醇或乙醇结晶和重结晶，母液部分可用硅胶层析进一步纯化，共可得25克化合物tilifodiolide。实施例2：化合物4的制备：将化合物tilifodiolide(20.0mg)溶于甲醇(5ml)中，加入三乙胺(8.5μl)和25％氨水(5μl)，封管加热至180℃反应24小时，减压蒸馏除去甲醇，加水5ml，用ch2cl2萃取三次(5ml×3)，合并有机相，用na2so4干燥。过滤，蒸干滤液，装硅胶柱色谱，用石油醚：乙酸乙酯(2:8)洗脱得化合物4(5.6mg)。esi‐ms:358[m+na]+；693[2m+na]+；核磁数据见表1实施例3：化合物5的制备：将化合物1(5.0mg)溶于四氢呋喃(5ml)中，冰浴中加入nah(0.5mg)半小时后，加入ch3i(1μl),恢复至室温，反应2小时。加水5ml，用ch2cl2萃取三次(5ml×3)，合并有机相，用na2so4干燥。过滤，减压蒸干滤液，装硅胶柱色谱，用石油醚：乙酸乙酯(2:8)洗脱得化合物5(3.2mg)。esi‐ms:372[m+na]+；388[m+k]+；721[2m+na]+；737[2m+k]+；核磁数据见表1表1化合物4和5的核磁数据(600mhzincdcl3)实施例4：tilifodiolide在糖尿病及ii型糖尿病相关疾病方面的活性：实验动物与分组：c57bl/ksjdb/db小鼠(db/db小鼠)是leptin受体基因缺陷导致的先天性ⅱ型糖尿病小鼠，主要表现为下丘脑缺陷，对饱感物质(瘦素)缺乏反应，具有高血糖、高胰岛素血症、糖代谢异常、肥胖等特征，与人类ⅱ型糖尿病临床症状极为相似。受试c57bl/ksjdb/db小鼠为6周龄雄性小鼠，spf级，体重为20‐24g，购于中国科学院上海药物研究所。饲养条件按照spf级动物标准饲养操作规程饲养，除必要禁食时间外，自由饮食饮水，饲料为常规饲料。实验材料：化合物tilifodiolide米色晶体，采用peg400与水的混合液作为溶媒(vpeg400:v水＝3:7)。先用研钵研成细粉末状后分次加入peg400研磨至均匀，再分次加入适量水继续研磨至均一状。实验原则按标准操作规程。实验方法：1)动物分组：组1为模型对照组，组2为tilifodiolide给药组，组3为正常参照组，实验动物分组及给药剂量如表2所示。表2实验动物分组2)给药与检测空腹血糖检测：db/db小鼠常规监测，适应性喂养一周后，给予药物前1天(p‐1)再次进行血糖、体重检测；受试物按上述表格浓度溶解稀释，灌胃(po)给药，给药当天记为p0；每天14：00p.m.‐16:00p.m.之间给药。根据实际情况适当延长了给药时间(56天)，期间跟踪记录体重；给药后每3天测量耗食量，每7天测量空腹6h血糖。葡萄糖耐受(ogtt)检测：实验前1天，各组小鼠禁食12h检测血糖后，以0.3g/kg灌胃给予葡萄糖，在15min，30min，60min，90min，120min五个时间点分别尾静脉测量各组血糖；胰岛素耐受(itt)检测：实验当天各组小鼠禁食6h，腹腔注射0.8iu/kg胰岛素，在30min，60min，90min，120min四个时间点分别尾静脉测量各组血糖。血清甘油三酯、胆固醇水平等相关指标检测：实验结束后取血清测定相关指标；取心脏、肝脏、肾脏、胰腺、骨骼肌、脂肪待下一步检测。常规记录实验进行过程中动物表现、体重、摄食摄水量。3)统计方法所有统计均利用paswstatistics18(spss18.0)进行。以血糖值或者体重为纵坐标，给药组分别为横坐标作统计图。以时间为横坐标，血糖浓度为纵坐标坐ogtt、itt曲线。以血清指标为纵坐标，组别为横坐标作统计图。统计数据使用平均数±标准差表示，采用单因素方差分析(onewayanova)，p<0.05认为有显著性差异。实验结果：1)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠各器官及周围脂肪重量的影响：tilifodiolide灌胃给予db/db小鼠56天后，以剪断颈部的方式处死，检查各组织和脏器的病变并分别称重。tilifodiolide对db/db小鼠各脏器及周围脂肪重量的影响如表3和图1。表3各组小鼠组织重量数据*p<0.05,**p<0.01.实验结果显示，小鼠无明显异常，摄食量、摄水量无明显改变，解剖时各器官无显著肉眼可见变化。肝脏重量较对照组有明显下降(**p<0.01)，肠系膜脂肪、睾丸周围脂肪重量较对照组也有明显下降(*p<0.05)，肾周脂肪重量较对照组有一定下降趋势，但无统计学意义。说明tilifodiolide不引起小鼠内脏组织的明显病变，且具有显著减少内脏脂肪的作用。2)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠体重的影响：db/db小鼠于给药前1天记录体重，每3天称重一次，比较组1和组2小鼠体重。小鼠的体重变化曲线如表4和图2所示。表4各组小鼠体重变化数据表*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.实验结果显示，tilifodiolide给药组小鼠体重较对照组有明显下降(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)，说明tilifodiolide具有显著的减重作用。3)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠空腹血糖的影响：db/db小鼠于给药前1天检测空腹血糖，tilifodiolide连续给药后，每7天检测空腹6h血糖。小鼠的空腹血糖测定结果如表5和图3所示。表5各组小鼠血糖含量测定值*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.组2、组3分别与组1比较。实验结果显示，与对照组相比tilifodiolide能够显著降低给药组小鼠的空腹血糖(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。4)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠口服糖耐量(ogtt)的影响：tilifodiolide给药第32天，进行ogtt检测，实验前1天各组小鼠禁食12h过夜，灌胃给予葡萄糖0.3g/kg。在灌糖前和灌糖后15min，30min，60min，90min，120min尾静脉测量血糖值，根据血糖值计算血糖曲线下面积(areaundercurve，auc)。小鼠的口服糖耐量曲线和曲线下面积统计结果如表6和图4所示。表6ogtt曲线下面积统计数据分组曲线下面积(auc，mean±sd)组12379.14±426.70组21706.53±193.27***组31015.00±133.47******p<0.001.组2、组3分别与组1比较。实验结果显示，tilifodiolide显著改善db/db给药小鼠的糖耐量(***p<0.001)。5)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠胰岛素耐量(itt)的影响：tilifodiolide给药第34天，进行itt检测，实验当天各组小鼠禁食6h，腹腔注射0.8iu/kg胰岛素，此时记为0min，在30min，60min，90min，120min四个时间点分别尾静脉测量各组血糖。各组小鼠的胰岛素耐量曲线和曲线下面积统计数据如表7和图5所示。表7itt曲线下面积统计数据分组曲线下面积(auc，mean±sd)组11392.30±442.89组21001.44±135.11*组3595.5±72.24****p<0.05，***p<0.001.组2、组3分别与组1比较。实验结果显示，tilifodiolide给药组db/db小鼠在相同剂量胰岛素作用下，血糖值明显低于对照组db/db小鼠(*p<0.05)，说明tilifodiolide能提高db/db小鼠胰岛素敏感性。6)本发明化合物(ⅰ)对db/db糖尿病小鼠血清各项指标的影响：tilifodiolide给药第56天，对各组小鼠血清进行了甘油三酯水平(tg)、总胆固醇含量(tc)、葡萄糖含量(glucose)、谷草转氨酶活性(ast)、谷丙转氨酶活性(alt)的相关测定。各组小鼠血清相关指标测定结果如表8和图6所示。表8各组小鼠血清相关指标测定数据**p<0.01，***p<0.001.组2、组3分别与组1比较。实验结果显示，化合物tilifodiolide无明显肝毒性，tilifodiolide给药组小鼠血清alt和ast有一定程度的下降说明tilifodiolide部分缓解了肝脏炎症；与对照组相比tilifodiolide给药组小鼠血清葡萄糖含量显著降低(*p<0.05)，同时血清甘油三酯水平降低(*p<0.05)；tilifodiolide对小鼠血清胆固醇含量无明显影响。实施例5：片剂的制备：按实施例1-3的方法先制得tilifodiolide及其衍生物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。实施例6：口服液制剂的制备：按实施例1-3的方法先制得tilifodiolide及其衍生物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。实施例7：胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备：按实施例1-3的方法先制得tilifodiolide及其衍生物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。当前第1页12