作为广谱人类乳头状瘤病毒（HPV）疫苗的乳头状瘤病毒样颗粒（VLP）的制作方法

本申请是申请日为2010年4月12日的题为“作为广谱人类乳头状瘤病毒(hpv)疫苗的乳头状瘤病毒样颗粒(vlp)”的中国专利申请no.201080025772.0的分案申请。本申请要求于2009年4月10日提交的美国临时专利申请61/168,445的申请日的权益，将其全部内容以引用方式并入本文。本发明是在国家癌症研究所授予的基金号为p50ca098252的政府支持下完成的。政府具有本发明的某些权利。本发明涉及作为广谱人类乳头状瘤病毒(hpv)疫苗的乳头状瘤病毒样颗粒(vlp)。
背景技术：
：目前已鉴定的超过一百种人类乳头状瘤病毒(hpv)(devilliers等(2004)virology22,670-80)是皮肤和粘膜乳头状瘤或疣的病原。持续感染高危粘膜型通常为hpv16和hpv18，导致全世界女性第二大致命癌症——宫颈癌，其每年导致274,000人死亡。大量发病率由其它非宫颈hpv相关的疾病引起，如生殖器疣，外阴、阴道、阴茎、肛门或口咽癌。目前预防性乳头状瘤病毒疫苗的开发由重组性表达的主要衣壳蛋白l1自组装到病毒样颗粒(vlp)上的观察资料而发起。这些空病毒衣壳由360个l1分子构成，结构和免疫原性均与天然病毒体类似，但无致癌性和感染性。此外，由于在制备vlp的细胞中仅包含l1而无其它乳头状瘤病毒基因，因此vlp不能复制。亚单元vlp疫苗诱导针对构象l1表位的高效价和类型限制性的抗体应答(christensen等(1990)jvirol64,3151-3156)；kirnbauer等(1992)procnatlacadsciusa89,12180-12184；rose等(1994)jgenvirol75,2445-9；suzich等(1995)procnatlacadsciusa92,11553-11557)。在感染前将针对最流行的高危型hpv16和hpv18的现有疫苗用于妇女时，证明对持续感染和由所包括的类型引起的有关疾病高达100％有效，因此可潜在预防约70％的宫颈高度发育异常和癌症。因此，使用目前许可的l1疫苗需要对女性进行持续的细胞学宫颈癌筛查。预防96％的宫颈癌需要对7种高危hpv型(16/18/31/33/45/52/58)具有免疫力(munoz等(2004)intjcancer111,278-85)以及开发更多价(可能较昂贵)的l1vlp疫苗。对可替代的更广谱免疫原的寻找引起了对次要衣壳蛋白l2的注意，其在共表达的l1和l2衣壳中为免疫原性亚优势种(roden等(2000)virology270,254-257)。使用l2的氨基(n)-末端肽对动物进行的免疫证明了其引发低效价中和抗体的能力，该中和抗体可防止体内同源乳头状瘤病毒(pv)类型(embers等(2002)jvirol76,9798-805；gaukroger等(1996)jgenvirol77(pt7),1577-83)，体外交叉中和异源pv类型(kawana等(1999)jvirol73,6188-90；pastrana等(2005a)virology337,365-72；roden等(2000)(同上))的激发，并提供体内的交叉保护(gambhira的.(2007a)jvirol81,11585-92)。需要开发针对广谱hpv类型显示高效价中和抗体的免疫原或疫苗原。技术实现要素：本发明人在此处说明数个来自l2蛋白n末端的l2肽(表位)，例如hpv16l2的氨基酸残基17-36的肽，或来自其它乳头状瘤病毒(pv)类型的类似(等价)序列，当纳入乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白的de表面环中时，形成重组融合(嵌合)蛋白并组装至vlp中；当这些嵌合l1-l2vlp引入动物中时，可诱导针对大范围的粘膜高危型、低危型、皮肤型和β型乳头状瘤病毒的广谱中和抗体应答。强烈而持久的免疫应答远高于对线性融合蛋白的免疫应答。不希望被任何特定机制所约束，认为这些强烈的免疫应答是由在vlp的密集重复阵列上的表位展示所引起的。发明人还表明hpv16l2的氨基酸残基17-36的肽，或来自其它乳头状瘤病毒(pv)株的类似(等价)序列，当引入至l1的其它位点，并使得l2肽暴露于所形成的vlp表面时，也可组装至嵌合l1-l2vlp，当引入动物中时，其(该嵌合l1-l2vlp)诱导针对大范围的粘膜高危型、低危型、皮肤型和β型乳头状瘤病毒的广谱中和抗体应答。因此，l2肽的特定序列和/或引入了l2肽的l1位点，是有助于本发明所述vlp诱导强烈而广谱的交叉反应/中和的因素。在本发明的方面中，一个或多个本发明的vlp组合物用作免疫原性或疫苗组合物。在本发明的实施方式中，vlp组合物可用于预防(例如预防)或治疗乳头状瘤病毒感染和相关疾病，和/或可与药学载体结合。在某些方面中，在暴露于病毒之前、之后和/或过程中给予个体组合物以最小化或防止病毒感染或降低感染的严重程度并延缓或终止疾病进程，或通过免疫已感染宿主或未感染个体来防止病毒从已感染宿主传播至未感染该病毒的另一个体。本发明的vlp组合物，以及使用其免疫对象的方法的优势包括l2部分可引发针对广谱的hpv的中和抗体应答，而不干扰vlp诱导高效价抗l1抗体水平的能力。vlpl1疫苗载体具有良好的耐受性并提供长期免疫原性(目前至少6年)。因此，基于作为l2表位载体的hpv16l1vlp的疫苗以单一结构提供了诱导针对hpv16l1的类型限制性抗体和交叉反应中和抗l2抗体的优势。广泛的交叉反应性减少了对确定hpv感染和/或上皮内瘤样病变的筛选试验的需要，也减少了为覆盖所有致病hpv类型而制备l1vlp疫苗的高度多价配方的需要，从而降低了成本。本发明的组合物提供了低成本，具有广泛保护性的疫苗，其稳定，可大规模生产，并且可无针给予。低成本可实现在发展中国家的使用，其中80％的全球宫颈癌费用(负担)发生在发展中国家。本发明涉及例如病毒样颗粒(vlp)组合物，其组装自(包括)(一个)嵌合多肽(由嵌合多肽组成)，该嵌合多肽包括乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白，其中所述乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白中插入了由来自乳头状瘤病毒l2蛋白的以下序列组成的表面展示肽：a)(d/q/h/e)(l/i)y(k/p/r/q/s)(t/s/a/g)ck(q/i/v/l/a)(a/s/t)(g/n)(t/n)cppd(i/v)(i/v/q)(p/n/d)(k/r)(v/i/l)(seqidno:1)，或b)abycdckefghcppdijklm(seqidno:2)，其中a＝(d/q/h/e)；b＝(l/i)；c＝(k/p/r/q/s)；d＝(t/s/a/g)；e＝(q/i/v/l/a)；f＝(a/s/t)；g＝(g/n)；h＝(t/n)；i＝(i/v)；j＝(i/v/q)；k＝(p/n/d)；1＝(k/r)；m＝(v/i/l)，或c)与seqidno:1或seqidno:2具有至少50，60，70，75，80，85，90或95％同一性的序列。如此处所使用，除非本文另有明确规定，单数形式的“一个”，“一个”和“这个”包括复数指代对象。因此，例如，如上使用的术语“组装自(一个)嵌合多肽”包括一个以上的嵌合多肽。通过比对来自多个pv物种的l2蛋白该部分的高度保守序列，本发明人之一和共同研究者首先在gambhira等(2007b)jvirol81,13927-31中建立了l2的这一部分的共有序列。该原始比对显示在本文的图6中，并作为彩图1a发表于gambhira(2007b)论文中，以引用方式并入本文，尤其参照该图和来自其的共有序列。随后，本发明人对比对进行扩展以包括更多pv物种，如下表1中所示，并相应地对共有序列进行修饰。已修饰(修改)的共有序列由seqidno:1和seqidno:2表示。表1hpv16l2表位rgl(l217-36)在粘膜(对高危型下划线)和皮肤型hpv中高度保守，并诱导交叉中和(√)seqidl2序列可来自任意多种pv物种。典型的合适的l2肽包括，例如列于图6和表1中的那些。在本发明的一个实施方式中，l2肽选自本文所示的交叉反应(交叉中和)的肽。在本发明的其它实施方式中，l2肽选自粘膜高危型(例如，导致宫颈癌的最常见类型：hpv16，18，31，33，45，52或58)，或选自皮肤型hpv。例如，合适的l2肽包括：来自hpv16l2蛋白的氨基酸17-36的肽，其具有氨基酸序列qlyktckqagtcppdiipkv(seqidno:9)；来自hpv18l2蛋白的相应氨基酸的肽，其具有氨基酸序列dlyktckqsgtcppdvvpkv(seqidno:10)；来自bpv1l2蛋白的相应氨基酸的肽，其具有氨基酸序列dlyrtckqagtcppdvipkv(seqidno:22)；来自hpv38l2蛋白的相应氨基酸的肽，其具有氨基酸序列diyrgckasntcppdvinkv(seqidno:52)；来自hpv1l2蛋白的相应氨基酸的肽，其具有氨基酸序列diypsckisntcppdiqnki(seqidno:3)；或来自hpv4l2蛋白的相应氨基酸的肽，其具有氨基酸序列nlyakcqlsgnclpdvknkv(seqidno:53)。在本发明该方面的实施方式中，将l2肽插入至l1蛋白的环中，以使l2肽展示在所形成的vlp表面上。例如，可将l2肽插入至l1蛋白的de环或螺旋b4环中。在本发明的实施方式中，l1蛋白来自hpv16(包括hpv16而不是本文举例说明的114k变体)，l2肽插入至l1蛋白de环的氨基酸136和137间(hpv16l1蛋白的序列为seqidno:85)；或l1蛋白来自bpv1，l2肽插入至l1蛋白de环的氨基酸133和134间(bpv16l1蛋白的序列为seqidno:83)。本发明的另一个方面是组装自(包括，由其组成)包括hpv16l1蛋白的嵌合多肽，其中所述hpv16l1蛋白的de环中插入了由以下序列组成的肽：a)(d/q/h/e)(l/i)y(k/p/r/q/s)(t/s/a/g)ck(q/i/v/l/a)(a/s/t)(g/n)(t/n)cppd(i/v)(i/v/q)(p/n/d)(k/r)(v/i/l)eg(seqidno:54)，或b)abycdckefghcppdijklmeg(seqidno:55)，其中a＝(d/q/h/e)；b＝(l/i)；c＝(k/p/r/q/s)；d＝(t/s/a/g)；e＝(q/i/v/l/a)；f＝(a/s/t)；g＝(g/n)；h＝(t/n)；i＝(i/v)；j＝(i/v/q)；k＝(p/n/d)；1＝(k/r)；m＝(v/i/l)，或c)seqidno:54或seqidno:55的变体，其n末端缺少一个氨基酸和/或c末端缺少一个或两个氨基酸，或d)与seqidno:54或seqidno:55至少50，60，70，75，80，85，90或95％同一的序列，或e)与针对hpv16l2(17-36)(seqidno:9)的抗血清(例如，兔抗血清)，或与针对肽hpv16l2(17-36)(seqidno:9)的单克隆抗体反应的肽。在本发明的实施方式中，插入至de环的肽由来自hpv16l2(氨基酸17-38)的以下序列组成：qlyktckqagtcppdiipkveg(seqidno:56)；或seqidno:56的变体，其n末端缺少一个氨基酸和/或c末端缺少一个或两个氨基酸。该变体肽的实例包括hpv16l2肽(17-36)，其序列为qlyktckqagtcppdiipkv(seqidno:9)，以及hpv16l2肽(18-38)，其序列为lyktckqagtcppdiipkveg(seqidno:57)。在本发明该方面的实施方式中，l2肽插入至l1的de环中，l1蛋白来自hpv16，l2肽插入至l1蛋白de环的氨基酸136和137之间。出于参考目的，在本文其它地方提供了完整的hpv16l1氨基酸序列，其为seqidno:85；或l1蛋白来自bpv1，l2肽插入至l1蛋白de环的氨基酸133和134之间。出于参考目的，在本文其他地方提供了完整的bpv16l1氨基酸序列，其为seqidno:83。对于任意本发明所述的vlp组合物，可使用l1和l2蛋白/肽的各种组合。例如，l1和l2蛋白可来自人类乳头状瘤病毒(hpv)；l1蛋白可来自bpv，如bpv1，非常密切相关的bpv2，或已鉴定的至少10种bpv类型之一(例如，bpv4)；或l1蛋白和/或l2蛋白可来自pv而不是hpv。在本发明的方面中，l1蛋白是本文举例说明的l1的变体。在本文的其它地方对某些该变体进行了讨论。这些包括，例如来自不同hpv类型的作为骨架的l1基因嵌合体，以及组装至vlp或壳粒中的l1的截短形式。在本发明的方面中，本发明的vlp为免疫原性组合物，其诱导例如抗原特异性或固有性体液或细胞免疫应答。本发明所述的vlp可具有针对1，2，3，4，5或更多个乳头状瘤病毒的粘膜高危型(例如hpv16，18，31，33，45，52，58，68或76)，粘膜低危型(例如hpv6和11)，导致赫克病(口腔黏膜局灶性上皮增生)的hpv13、32，导致皮肤疣的皮肤低危型(亲皮肤型)(例如hpv1，2，3，4，7，10，27，57等)和/或皮肤β型(例如hpv5，8，9，12，14，15，38等)或动物乳头状瘤病毒的免疫原性。在pv命名方面，所有β-pv为皮肤型。然而，通常认为皮肤型是诱发常见，手掌，足底或扁平皮肤疣的那些(这些是α，γ，μ，ν型)。β型通常仅在ev患者或免疫抑制患者中诱发皮肤疣(或皮肤癌)。本发明的另一个方面是进一步包括佐剂的本发明所述的vlp或壳粒组合物，或包括本发明所述vlp组合物和佐剂的疫苗。本发明所述疫苗可有效对抗人类乳头状瘤病毒(例如，对抗粘膜高危型，低危型，皮肤型和β型(例如，β型hpv5)乳头状瘤病毒)。本发明所述疫苗可以多种方式配制，包括冻干或粉末形式，通过吸入、口服(例如，丸剂)，在病毒或细菌载体中，或作为性交润滑剂组分的方式给予的配方。一种给予模式与目前现有的hpv疫苗相似，与佐剂(例如，明矾或明矾-mpl)一起肌肉注射接种。对于缺乏足够冷冻设备的发展中国家，冻干、吸入、口服，或病毒或细菌载体的配方将更合适。本发明的另一个方面是包括乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白(例如，hpv16l1蛋白)的嵌合多肽，其中所述乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白中插入了由来自乳头状瘤病毒l2蛋白的以下序列组成的表面展示肽：a)(d/q/h/e)(l/i)y(k/p/r/q/s)(t/s/a/g)ck(q/i/v/l/a)(a/s/t)(g/n)(t/n)cppd(i/v)(i/v/q)(p/n/d)(k/r)(v/i/l)(seqidno:1)，或b)abycdckefghcppdijklm(seqidno:2)，其中a＝(d/q/h/e)；b＝(l/i)；c＝(k/p/r/q/s)；d＝(t/s/a/g)；e＝(q/i/v/l/a)；f＝(a/s/t)；g＝(g/n)；h＝(t/n)；i＝(i/v)；j＝(i/v/q)；k＝(p/n/d)；1＝(k/r)；m＝(v/i/l)，或c)与seqidno:1或seqidno:2具有至少50，60，70，75，80，85，90或95％同一性的序列，或组装自(包括，由其组成)乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白的嵌合多肽，其中所述乳头状瘤病毒(pv)l1蛋白的de环中插入了由以下序列组成的肽：d)(d/q/h/e)(l/i)y(k/p/r/q/s)(t/s/a/g)ck(q/i/v/l/a)(a/s/t)(g/n)(t/n)cppd(i/v)(i/v/q)(p/n/d)(k/r)(v/i/l)eg(seqidno:54)，或e)abycdckefghcppdijklmeg(seqidno:55)，其中a＝(d/q/h/e)；b＝(l/i)；c＝(k/p/r/q/s)；d＝(t/s/a/g)；e＝(q/i/v/l/a)；f＝(a/s/t)；g＝(g/n)；h＝(t/n)；i＝(i/v)；j＝(i/v/q)；k＝(p/n/d)；1＝(k/r)；m＝(v/i/l)，或f)seqidno:54或seqidno:55的变体，其n末端缺少一个氨基酸和/或c末端缺少一个或两个氨基酸，或g)与seqidno:54或seqidno:55至少50，60，70，75，80，85，90或95％同一的序列，或h)与针对hpv16l2(17-36)(seqidno:9)的抗血清(例如，兔抗血清)，或与针对肽hpv16l2(17-36)(seqidno:9)的单克隆抗体反应的肽。本发明的其它方面为编码本发明所述多肽的核酸(例如dna、rna、或其它形式的核酸)；包括该核酸的表达载体(例如，来自病毒或细菌的控制序列)，其可操作地连接于表达控制序列；和包括该多肽、核酸或表达载体的宿主细胞。本发明的另一个方面是制备vlp或壳粒组合物的方法，其包括在合适条件下孵化如上所述的嵌合多肽以自组装。本发明的另一个方面是免疫或接种对象以对抗pv(例如hpv)的方法，其包括给予对象有效量的如本发明所述的vlp或壳粒组合物。本发明的另一个方面是诱导对象体内针对hpv的免疫应答的方法，其包括给予对象有效量的如本发明所述的vlp或壳粒组合物(例如免疫原性组合物或疫苗)。免疫应答为抗原特异性或固有性体液免疫应答或细胞免疫应答。本发明的另一个方面是用于治疗已感染pv或具有暴露于pv的风险的对象的方法，其包括给予对象有效量的本发明所述的vlp或壳粒组合物(例如免疫原性组合物或疫苗)。本发明的另一个方面是用于预防对象的宫颈癌，生殖器癌，口咽癌或初癌的方法，其包括给予对象有效量的如本发明所述的vlp组合物。此处所使用的“初癌”是指宫颈癌和其它生殖器癌的前体，如高度和低度上皮内病变，hsil，lsil(或cin，vin，ain等，分别与解剖区域宫颈，外阴和肛门有关)。已知可通过现有的l1vlp疫苗预防这些疾病，并有望通过本发明所述的vlp组合物预防。本发明的另一个方面是试剂盒，其包括如本发明所述的vlp或壳粒组合物，或包括结合了本发明所述vlp组合物的抗体。本发明的另一个方面是通过接种如本发明所述的vlp组合物而产生的预防性或治疗性抗体或免疫血清，可将其分别给予健康或患病对象以预防或治疗pv感染。本发明的另一个方面是壳粒组合物，其包括自组装至壳粒(壳粒，五聚体l1结构亚单元)而不组装至vlp的本发明所述的l1/l2嵌合多肽。产生该壳粒的方法在本领域中常见。参见例如jvirol1998jan；72(1):32-41；jvirol1998mar；72(3):2160-7；thones等(2007)virology369,375-388；或bishop等(2007),thejournalofbioogicalchemistry282,31803-31811，将所有文献以引用方式并入，尤其是其对产生壳粒的方法的描述。产生壳粒的一种方法是截短l1蛋白，或使用抑制其形成vlp能力的突变的l1基因(例如，携带突变体c175aabdc428a)。参见例如jmoibio2001mar16；307(l):173-82；jvirol1997apr；71(4):2988-95，将两者以引用方式并入，尤其是与该方法相关的。本发明的另一个方面是诱导对象体内针对α皮肤型hpv(例如hpv2，3)的免疫反应(保护免受其感染)，其包括给予对象有效量的本发明所述的vlp组合物。hpv2与hpv27和57型密切相关，其连同hpv1是皮肤疣中最常见的类型。hpv3和密切相关的hpv10型是低危皮肤α型，常见于immuncompent患者、或免疫受损(例如肾移植)或ev患者的扁平皮肤疣中。如此处所使用，本发明所述的嵌合“病毒样颗粒(vlp)”是指由乳头状瘤病毒l1蛋白分子构成的空病毒衣壳，在所述乳头状瘤病毒l1蛋白分子中插入次要(minor，较小)病毒衣壳肽l2。所插入的肽插入至l1蛋白的适当区域以使其展示在vlp的表面。在本发明的一个实施方式中，l2肽插入至l1的de环中，例如，bpv1的氨基酸133和134间，hpv16l1的氨基酸136和137间，或来自其它乳头状瘤病毒的l1分子的等价位点间。所插入的肽包括一个或多个与广谱pv类型交叉反应的表位(例如，中和表位)。在一个实施方式中，l2肽包括hpv16l2蛋白的氨基酸17-36，或来自另一个乳头状瘤病毒的氨基酸的等价序列。嵌合l1蛋白自发地组装至vlp中，并且结构和免疫原性均与天然病毒体类似，但缺乏核酸，从而无致癌性和感染性。插入了l2肽的l1蛋白可来自任意多种乳头状瘤病毒(pv)类型(菌株)。例如，vlp用于保护任意多种动物免受pv感染，包括，例如家畜或犬科动物；对于该vlp，l1可来自已知会感染那些动物的pv菌株，例如bpv1，bpv2，bpv4，bpv6或犬口腔乳头状瘤病毒(copv)。在一个实施方式中，vlp用于保护人类免受hpv感染；对于该vlp，l1可来自任意类型的hpv(例如hpv16，18，45，6，11，1，2，4，5或8)。另外，bpv是用于人类的合适的疫苗载体，尤其是先前暴露于通常用于形成vlp的hpv菌株的患者。本文举例说明了l1蛋白来自bpv和hpv16的vlp；包括l1蛋白的其它来源的结构对于技术人员是显而易见的。在本文的实施例中，除了插入的l2肽，l1蛋白基本上是野生型。然而，技术人员将认识到也可使用l1蛋白的变体，只要该蛋白可耐受合适l2肽的插入而不失去抗原性，并且可组装至vlp中，或至少组装至五聚体(壳粒)中。已描述几个该变体的实例。例如，一个实例可使用截短的l1，其n端缺少多达10个氨基酸或c末端缺少多达30个氨基酸。(参见例如jmoibio2001mar16；307(l):173-82,或bishoop等(2007)thejournalofbiologicalchemistry282,31803-31811，将两者对制备和使用该截短l1蛋白的公开以引用方式并入。)在另一个实施方式中，可使用具有约60个氨基酸的小型融合肽。(参见例如virology1997jui21；234(1):93-111，将其对该融合肽的公开以引用方式并入。)在另一个实施方式中，可使用杂交l1分子，其中来自第一pv菌株的分子的一部分替换为来自第二pv菌株的l1分子。例如，l1分子的某些功能性部分，如暴露在蛋白外部的“环”，可替换为来自不同pv菌株的分子。对于该杂交l1蛋白的实例，见例如virology2001dec20:291(2):324-34或oroczo等(2005)jvirol79,9503-9514，将两者对该杂交l1蛋白的公开以引用方式并入。其它类型的变体对于技术人员是显而易见的。参见例如jvirol2006may；80(10):4664-72；white等(1999)jvirology73,4882-4889；或roden等(1997)jvirol71,6247-52，将所有文献中对合适l1变体的其它类型的公开以引用方式并入。只要插入物展示在vlp表面并且插入物不干扰l1蛋白的抗原性或蛋白组装至vlp中的能力，就可以在l1蛋白的任意多个位点将l2肽插入l1蛋白中。l1hpv16vlp的结晶显示了病毒衣壳的原子结构，特别是包含免疫显性和构象依赖性表位的高度易变的表面环，所述表位可被中和抗体识别并决定病毒的血清型(chen等(2000)molecularcell5,557-567)。因此，l2肽插入至l1蛋白的合适的位点对于技术人员是显而易见的。这些包括，例如螺旋b4环(例如，在hpv16l1的氨基酸430和433之间)。在本发明的实施方式中，l2肽插入至de环中(例如，在本文举例说明的bpv的氨基酸133/134之间，或hpv的等价氨基酸136/137之间)。也可使用其它pv的等价插入位点。任意多种l2肽可插入l1蛋白中以形成本发明所述的vlp。在一个实施方式中，肽延伸自hpv16l2的氨基酸17-36，并具有序列qlyktckqagtcppdiipkv(seqidno:9)。技术人员应认识到该序列在多种pv菌株中高度保守，并且类似肽可选自任意多种l2蛋白的等价区域以插入l1蛋白中。例如，hpvl2表位可包括等价序列，其来自乳头状瘤病毒的α型，或β，γ，δ，ε，ζ，η，θ，ι，κ，λ，μ，v，ξ，o，π型(参见例如devilliers等(2004)virology324,17-27)；和/或来自人类乳头状瘤病毒：hpv1，hpv2，hpv3，hpv4，hpv5，hpv6，hpv7，hpv8，hpv9，hpv10，hpv11，hpv12，hpv13，hpv14，hpv15，hpv16，hpv17，hpv18，hpv19，hpv20，hpv21，hpv22，hpv23，hpv24，hpv25，hpv26，hpv27，hpv28，hpv29，hpv30，hpv31，hpv32，hpv33，hpv34，hpv35，hpv36，hpv37，hpv38，hpv39，hpv40，hpv41，hpv42，hpv43，hpv44，hpv45，hpv46，hpv47，hpv48，hpv49，hpv50，hpv51，hpv52，hpv53，hpv54，hpv55，hpv56，hpv57，hpv58，hpv59，hpv60，hpv61，hpv62，hpv63，hpv64，hpv65，hpv66，hpv67，hpv68，hpv69，hpv70，hpv71，hpv72，hpv73，hpv74，hpv75，hpv76，hpv77，hpv78，hpv79，hpv80，hpv81，hpv82，hpv83，hpv84，hpv85，hpv86，hpv87，hpv88，hpv89，hpv90，hpv91，hpv92，hpv93，hpv94，hpv95，hpv96，hpv97，hpv98，hpv99，hpv100至hpv127；和/或动物乳头状瘤病毒：牛乳头状瘤病毒1型(bpv1)，牛乳头状瘤病毒2型(bpv2)，牛乳头状瘤病毒4型(bpv4)，棉尾兔乳头状瘤病毒(crpv)，鹿乳头状瘤病毒(dpv)，欧洲麋鹿乳头状瘤病毒，犬口腔乳头状瘤病毒(copv)，猕猴乳头状瘤病毒(rhpv)和兔口腔乳头状瘤病毒(ropv)。本发明所述hpv抗原或表位或肽可包括连续氨基酸序列，从hpv16l2多肽seqidno:81的氨基酸x至氨基酸y，其中x为12，13，14，15，16，17，18，19，20，21或22，y为氨基酸26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42或43。本发明所述hpv抗原或表位或肽可包括约20个氨基酸，例如15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25个连续氨基酸。在某些实施方式中，l2肽为hpv16表位(seqidno:9)，hpv18表位(seqidno:10)，或hpv45表位(seqidno:11)。在其它方面，l2肽包括seqidno:81的氨基酸17-36(hpv16l217-36(seqidno:9))。虽然该片段指定为基于hpv16的17-36，但来自其它hpv类型的实际氨基酸位置会不同，但易通过与本文所公开的hpv16序列进行比对而鉴定(“等价”或“类似”序列)。在某些方面，l2肽至少或超过50％，60％，70％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％与seqidno:9相同。在某些实施方式中，l2肽包括共有氨基酸序列(d/q/h/e)(l/i)y(k/p/r/q/s)(t/s/a/g)ck(q/i/v/l/a)(a/s/t)(g/n)(t/n)cppd(i/v)(i/v/q)(p/n/d)(k/r)(v/i/l)(seqidno:1)，或abycdckefghcppdijklm(seqidno:2)，其中a＝(d/q/h/e)；b＝(l/i)；c＝(k/p/r/q/s)；d＝(t/s/a/g)；e＝(q/i/v/l/a)；f＝(a/s/t)；g＝(g/n)；h＝(t/n)；i＝(i/v)；j＝(i/v/q)；k＝(p/n/d)；1＝(k/r)；m＝(v/i/l)。如此处所使用，术语“抗原”是能够被抗体或t细胞受体结合的分子。抗原还能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致b和/或t淋巴细胞的激活。引起生物应答的抗原的结构方面在本文中是指“抗原决定簇”或“表位”，两者含义相同。b淋巴细胞通过产生抗体应答外来抗原决定簇，而t淋巴细胞介导细胞免疫。因此，抗原决定簇或表位是被抗体识别的抗原部分，或对于mhc，是被t细胞受体识别的抗原部分。抗原决定簇或表位不必是毗邻的/连续的蛋白质序列或片段，并且可能包括各种彼此不紧邻的序列。对于特定氨基酸序列，“表位”是一组涉及被特定免疫球蛋白识别的氨基酸残基，或对于t细胞，那些残基是被t细胞受体蛋白和/或主要组织相容性复合体(mhc)受体识别所必要的。表位的氨基酸残基不必毗邻/连续。在体内或体外免疫系统装置中，表位是分子的共同特征，如一级，二级和三级肽结构，和电荷一起形成的被免疫球蛋白、t细胞受体或hla分子所识别的位点。在整个公开中，“表位”和“肽”常交替使用。如此处所使用，“b细胞表位”或“靶表位”(例如hpvl2)，是指在针对包括该抗原(例如hpvl2表位(免疫原或靶表位))的肽的免疫原性应答中，b细胞受体所识别的肽或蛋白的特征。如此处所使用，“辅助性t细胞表位”或“th表位”是指在启动针对包括该抗原的肽的免疫应答时，t细胞受体所识别的肽或蛋白的特征。通常认为t细胞对t细胞表位的识别是通过一种机制进行的，其中t细胞识别抗原的肽片段，其连接于在抗原呈递细胞上表达的i类或ii类主要组织相容性复合体(mhc)分子。在本发明的某些实施方式中，如本文所描述的已鉴定的表位或表位片段用于检测具有能够结合和展示表位或片段的mhc分子的抗原呈递细胞。如此处所使用，“hpv”和“人类乳头状瘤病毒”是指能够感染人类的乳头状瘤病毒家族的成员。有两个由其趋向性定义(生殖器/粘膜和皮肤族)的主要hpv族，每个家族包含多个病毒“型”或“株”(例如hpv16，hpv18，hpv31，hpv32等)。本发明特别关注的是与生殖器感染和恶性肿瘤相关的hpv型，以及在粘膜和皮肤上产生良性乳头状瘤，导致患者发病的hpv型。术语“疫苗”是指包含1、2、3、4、5或多个本发明所述vlp组合物的配方。vlp组合物通常以能够给予对象的形式存在，并诱导保护性或治疗性免疫应答，其足以诱导免疫力以防止和/或改善感染和/或降低至少一种感染症状和/或提高另一种抗hpv治疗或预防的功效。通常，疫苗包括常用的生理盐水或缓冲水溶液介质，本发明所述组合物悬浮或溶解在其中，虽然也考虑给予干粉，例如通过吸入，甚至与其它佐剂如明矾共同配制后给予。本发明所述组合物可方便地用于防止、改善或治疗感染。在引入宿主后，本发明所述的免疫原性组合物(例如，疫苗)能够引发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性t细胞、抗原呈递细胞、辅助性t细胞、树突状细胞的活化和/或其它细胞应答。通常，该应答在多种乳头状瘤病毒类型之间具有交叉反应性，包括但不限于本文所描述的2、3、4、5、6、7、8、9、10或多个hpv型。本文在别处讨论了特定的交叉反应的hpv型。如此处所使用，“预防性”和“预防性的”疫苗，抗体或免疫血清是设计并给予以防止由病原性生物，特别是hpv所导致的或与其相关的感染，疾病和/或任何有关的后遗症的疫苗，抗体或免疫血清。如此处所使用，“治疗性”疫苗是设计并给予已感染病原性生物如至少一种hpv菌株的患者的疫苗。治疗性疫苗(例如，治疗性hpv疫苗)用于防止和/或治疗这些已感染个体中良性或恶性肿瘤的发展。当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”，“降低”或“防止”或这些术语的任意变体，包括任意可测量的减少或完全抑制以达到所需的结果，如抑制、降低或防止病毒感染、病毒播散、病毒生长或病毒传播。在本申请中，术语“约”用于表示数值包括所采用的测定数值的装置或方法的误差的标准偏差。认为本文所提供的列表中的一个或多个成员可特别地从要求保护的发明中排除或包括在要求保护的发明中。此处所使用的“对象”，包括任何感染了或具有感染乳头状瘤病毒风险的动物。合适的对象(患者)包括实验动物(如小鼠，大鼠，兔，豚鼠或猪)，耕畜(如牛)，竞技动物(如狗或马)和家畜或宠物(如马，狗或猫)。包括非人类灵长类和人类患者。此处所使用的术语“蛋白”，“多肽”和“肽”不局限于任意特定数量的氨基酸；这些术语有时在本文中交替使用。已熟知并且可通过常规方法测定本发明所述的蛋白性质和氨基酸序列以及编码它们的核酸的性质和序列，也可从多种已知数据库中下载。见，例如ncbigenbank数据库。本文提供了一些序列。此信息在提交该申请时是准确的。然而，某些序列信息会定期进行更新(例如，纠正之前条目中的错误)，因此本申请也包括对关于蛋白和编码蛋白的核酸的信息的更新(纠正)。本文讨论的序列数据库所提供的信息以引用方式并入本申请中。本文所讨论的嵌合蛋白有时在本文中称为“本发明所述蛋白(或本发明的蛋白)”。本发明的一个方面是制备本发明的vlp(或其多肽组分)的方法。在本发明的一个实施方式中，使用根据特定氨基酸序列进行调整的常用方法合成hpv表位。该技术包括，例如，肽合成领域技术人员熟知的方法，例如液相合成[见finn等proteins,3rded.,neurathandhill(eds),academicpress,ny,2,105-253,1976]，或固相合成[见barany等:thepeptides,grossandmeienhofer(eds.),academicpress,ny,3-284,1979]，或merrifield等[(1963)j.am.chem.soc.85,2149-2154]报导的逐步固相合成，将其内容以引用方式并入本文。关于肽合成技术的其它文献包括通过lu等人在(1981)j.org.chem.46,3433所公开的固相肽合成的fmoc-聚酰胺模式进行肽合成，使用fmoc/tbu程序进行肽合成(atherton等:solidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach,irlpress,oxford,1989)。fmoc氨基酸可购自多个供应商，例如chem-impexinternational(伍德代尔，111，usa)，merckbiosciences(诺丁汉，uk)，和bachemukltd.(圣海伦斯,uk)。另外，可重组地制备本发明所述多肽。本发明提供包含dna的重组克隆和表达载体，以及包含重组载体的宿主。包括dna的表达载体可用于制备本发明所述的由dna所编码的多肽或多肽片段。制备多肽的方法包括在能够促进多肽表达的条件下，对已被编码所述多肽的重组表达载体转化的宿主细胞进行培养，然后从培养物中回收所表达的多肽。技术人员将认识到根据所采用宿主细胞的类型，以及多肽是膜结合的还是宿主细胞所分泌的可溶性形式等因素，纯化所表达多肽的程序会有所不同。本发明所述多肽可包括各种前导序列，其引导运输或协助纯化。可采用任意合适的表达系统。载体包括编码本发明所述多肽或片段的dna，可操作地连接于合适的转录或翻译调控核苷酸序列，如来自哺乳动物细胞，微生物，病毒，昆虫基因的核苷酸序列。调控序列的实例包括转录启动子，操纵子，或增强子，mrna核糖体结合位点，和控制转录和翻译的启动和终止的合适序列。当调控序列与dna序列功能相关时，可操作地连接核苷酸序列。因此，如果启动子核苷酸序列控制dna序列的转录，则启动子核苷酸序列可操作地连接于dna序列。通常将赋予在所需宿主细胞中复制的能力的复制起点，和用于鉴定转化株的选择基因并入表达载体中。用于表达多肽的合适的宿主细胞包括原核生物，酵母或高等真核细胞。通常优选哺乳动物或昆虫细胞用作宿主细胞。用于细菌，真菌，酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体描述于，例如pouwels等:cloningvectors:alaboratorymanual,elsevier,ny,1985。也可使用来自本文所公开的dna结构的rna，采用无细胞翻译系统制备多肽。通常，本文所提及的分子生物学方法为本领域所熟知并描述于，例如sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,现行版,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny,和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,ny。可实现多肽组装至vlp的方法和对其进行纯化以用于对象的方法是熟知而常见的。对于“自组装的合适条件”参见例如在本文实施例中所描述的方法，或kirnbauer等(1993)jvirol67,6929-6936；volpers等(1994)virology200,504-512；或jmoibiol2001mar16；307(l):173-82，将所有文献对该方法的描述以引用方式并入。本发明所述方法包括预防和/或治疗由乳头状瘤病毒感染导致的或与其有关的病或疾病(例如，hpv感染)。可给予结合相同的免疫原性hpv肽和/或抗体以在已感染或怀疑曾暴露于hpv或具有感染hpv风险的对象中诱导或提供保护性和/或治疗性应答。对于暴露于hpv且测试呈阳性的个体或根据可能的暴露而被认为具有感染风险的个体，可采用该方法。在某些实施方式中，在佐剂或载体或其它抗原(hpv抗原或来自其它病原体的抗原)的存在下给予治疗。此外，在某些实例中，治疗包括给予常用于对抗病毒感染的其它药物，如一种或多种抗病毒剂。可通过使用其它非特异性免疫应答刺激因子增强vlp组合物的免疫原性，其称为佐剂。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激性化合物，如细胞因子，毒素，或合成成分如明矾。许多佐剂可用于增强针对本文所描述的vlp的抗体应答。佐剂可用于(1)在体内捕获抗原，导致缓慢释放；(2)将涉及免疫应答的细胞吸引至给予部位；(3)诱导免疫系统细胞的增殖或活化；或(4)提高抗原在对象体内的散布。佐剂包括但不限于，水包油乳剂，油包水乳剂，矿物盐，多核苷酸和天然物质。可使用的特异性佐剂包括il-i，il-2,，il-4，il-7，il-12，γ-干扰素，gm-csf，bcg，铝盐，如氢氧化铝或其它铝化合物，mdp化合物，如thur-mdp和nor-mdp，cgp(mtp-pe)，类脂a，和单磷酰脂质a(mpl)，或灭活的微生物菌剂。ribi是在2％鲨烯/吐温80乳剂中，包含提取自细菌的三种组分，mpl，海藻糖二霉菌酸酯(tdm)，和细胞壁骨架(cws)。甚至可使用mhc抗原。其它佐剂或方法在美国专利6,814,971，5,084,269，6,656,462中举例说明，将其每一个以引用方式并入本文。各种实现佐剂对疫苗作用的方法包括使用药物如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)，通常在磷酸盐缓冲盐水中作为约0.05至0.1％的溶液使用，与作为约0.25％溶液使用的合成性糖聚合物混合，通过在温度范围为约70°至约101℃下分别热处理30秒至2分钟使疫苗中蛋白聚集。可采用使用胃蛋白酶处理的(fab)白蛋白抗体再活化而聚集；与革兰氏阴性菌的细菌细胞(例如，微小隐孢子虫)，内毒素或脂多糖成分混合；在生理上可接受的油溶媒中进行乳化(例如，二缩甘露醇一油酸(aracela))；或使用用作封闭替代物的全氟化碳的20％溶液进行乳化以产生佐剂效应。典型的佐剂是完全弗氏佐剂(含有已杀灭的结核分枝杆菌)，不完全弗氏佐剂和氢氧化铝。对于人类的给药，各种合适的佐剂对技术人员是显而易见的。这些包括作为佐剂的明矾-mpl，或类似的配方aso4，其用于已批准的hpvl1疫苗as03，as02，mf59，montanide，基于皂苷的佐剂，如gpi-0100，基于cpg的佐剂，或咪喹莫特。在本发明的实施方式中，佐剂物理耦合至vlp，或包封在vlp中，而不是简单地与其混合。除了佐剂，可能需要共给予生物应答调节剂(brm)以增强免疫应答。已显示brm可上调t细胞免疫性或下调抑制细胞活性。该brm包括但不限于，西咪替丁(cim；1200mg/d)(smith/kline，pa)或低剂量环磷酰胺(cyp；300mg/m2)(johnson/mead，nj)和细胞因子如γ-干扰素，il-2，或il-12或编码涉及免疫辅助功能蛋白的基因，如b-7。在本发明的实施方式中，这些基因包封于vlp中，以帮助其传送至对象。应用方式可大不相同。可应用任何给予疫苗的常规方法。认为其包括在生理上可接受的固体基质上或在生理上可接受的分散剂中口服给予，通过注射，吸入粉末，经皮贴剂，经阴道灌注等肠道外给予。疫苗的剂量取决于给予途径并根据对象的大小和健康情况有所不同。包含多肽或肽序列作为活性成分的疫苗的制备在本领域中通常是众所周知的，在美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792和4,578,770中举例说明，将所有文献已引用方式并入本文。通常，将该疫苗制备为液态溶液或混悬剂形式的注射剂：也可制备注射前适合溶于或混悬于液体的固体形式。制剂也可是乳化的。通常将活性免疫原性成分与药学上可接受并且与活性成分相容的辅料混合。合适的辅料为，例如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇或类似物及其组合。此外，如果需要，疫苗可包含一定量的辅助物质如润湿剂或乳化剂，ph缓冲剂，或增强疫苗效果的佐剂。在具体实施方式中，将疫苗配制为物质的组合物，如美国专利6,793,923和6,733,754所描述，将其以引用方式并入本文。可通过吸入给予疫苗。在某些实施方式中，疫苗可作为气雾剂给予。此处所使用的术语“气雾剂”或“雾化组合物”是指在气体中悬浮的固体或液体颗粒。通常使用该术语来指被汽化，雾化或由固体或液体形式转变为包括悬浮固体或液体药物颗粒的可吸入形式的组合物。该气雾剂可用于通过呼吸系统传送疫苗。如此处所使用，“呼吸系统”是指体内负责摄入氧气和呼出二氧化碳的器官系统。该系统通常包括从鼻到肺泡的所有呼吸道。在哺乳动物中，通常认为其包括肺，支气管，细支气管，气管，鼻道和膈。出于本发明公开的目的，将疫苗传送至呼吸系统表示将药物传送至一个或多个呼吸系统的呼吸道中，特别是传送至肺中。适合其它给予模式的其它配方包括栓剂(肛门或阴道使用)和在某些情况下口服制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯：该栓剂可由混合物形成，其包含的活性成分范围为约0.5％至约10％，优选为约1％至约2％。口服制剂包括通常采用的辅料如，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物可采用溶液剂，混悬剂，片剂，丸剂，胶囊剂缓释制剂或粉末剂的形式，并含有约10％至约95％活性成分，优选约25％至约70％。vlp组合物可配制为中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)和与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来自无机碱如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。在许多情况下，需要多次给予疫苗，通常最多，最少或不超过1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多次包括在其间的所有范围的接种。接种通常间隔1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12周/月/年，包括其间的所有值和范围，通常间隔为三至五周。通常会需要间隔1-15年，通常为十年的定期加强以维持抗体的保护水平。可通过测定针对抗原的抗体追踪免疫过程，如在前所述的美国专利3,791,932；4,174,384和3,949,064，其对该类型的测定进行了描述。本发明的组合物和有关方法，特别是将包括hpvl2表位的vlp给予患者/对象，也可与传统hpv筛查和/或其它疫苗组合使用，包括例如抗体或抗体片段，巴氏涂片，pcr，dna印迹法，给予cervarixtm，gardasiltm，hpv或其它传染原的疫苗，hpv病变的消融疗法，hpv病变的免疫调节疗法(例如aldaratm)等。在某些实施方式中，给予对象药物组合物。本发明的不同方面涉及给予对象有效量的组合物。在本发明的某些实施方式中，将包括hpvl2表位的vlp给予患者以保护其防止或治疗一种或多种hpv病原体感染。该组合物通常溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。如此处所使用，术语“药学上可接受的”或“药理上可接受的”是指在全面医学评价的范围内，化合物、材料、成分和/或剂型适合与人类和动物的组织接触而无过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它难处理的并发症，其相当于合理的收益/风险比。术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的、涉及运送或转运化学药物的材料、成分或媒介物，如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包封材料。药学上可接受的载体包括任意和所有溶剂，分散介质，包衣，抗菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延缓剂等。本领域熟知该介质和药物针对药学活性物质的使用。除非任意常用介质或药物与活性成分不相容，否则可考虑其用于免疫原性和治疗性组合物。可配制本发明所述活性化合物用于肠道外给药，例如配制通过静脉，肌内，皮下，或甚至腹膜内途径注射。除了配制用于气雾剂或肠道外给予的化合物，如用于静脉或肌内注射的那些，其它药学上可接受的形式包括，例如用于口服给予的片剂或其它固体；延时释放胶囊。作为游离碱或药理上可接受的盐的活性化合物的溶液可通过在水中与表面活性剂适当混合来制备，如羟丙基纤维素。也可在甘油，液态聚乙二醇，其混合物和油中制备分散剂。在普通条件下储存和使用时，该制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合注射用途的药学形式包括无菌水溶液或分散剂；包括芝麻油，花生油或水性丙二醇的配方；以及用于即时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。在所有情况下剂型必须无菌并且其流动程度必须易于注射。其还应在生产和储存条件下稳定，并且必须保存以免受微生物如细菌和真菌的污染作用。可将vlp组合物配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐，包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)和与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如醋酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来自无机碱如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺，三乙胺，组氨酸，普鲁卡因等。载体也可为溶剂或分散介质，其包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等)，其合适的混合物，和植物油。可通过例如使用包衣如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的微粒大小，通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现微生物作用的防止，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等。在许多情况下优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过在组合物中使用延缓吸收的物质实现注射组合物的持久吸收，例如单硬脂酸铝和明胶。通过将活性化合物加入具有如上列举的各种成分的所需量的合适溶剂中来制备无菌注射液，如需要，随后进行过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分加入含有基本分散介质和所需的如上列举的其它成分的无菌媒介物中来制备分散剂。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，由先前无菌过滤的溶液产生活性物质及任何其它所需成分的粉末。通常通过任意常见途径给予如本发明所述的组合物。这包括但不限于口服，鼻或含服给予。另外，给予可通过原位，皮内，皮下，肌内，腹膜内，呼吸道或静脉给予。在某些实施方式中，可吸入疫苗组合物(例如，美国专利6,651,655，以引用方式特意将其并入本文)。该组合物通常作为药学上可接受的组合物给予，其包括生理上可接受的载体，缓冲液或其它辅料。对于在水溶液中肠道外给予，应对溶液进行例如适当的缓冲，如必要，使用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合用于静脉，肌内，皮下和腹膜内给予。在这方面，本领域技术人员根据本公开将知悉可采用的无菌水性介质。例如，将一个剂量溶于等渗nacl溶液中并加入至皮下输液流体中或在建议的输注位置进行注射(参见例如remington'spharmaceuticalsciences,1990)。根据对象的条件，剂量必然会发生一些变化。负责给予的人在任何情况下都应确定针对个别对象的合适剂量。根据预期目标确定治疗性或预防性组合物的有效量。“有效量”是能够有效地产生所需结果(例如，可测定量的免疫应答的诱导，对象的免疫等)的量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的完全分离的单位，每个单位包含预定量的组合物，通过计算以产生如上所讨论的与给予相关的所需应答，即合适的途径和方案。根据治疗次数和单位剂量，待给予的量取决于所需的保护。组合物的精确的量还取决于医师的判断，并且对每个个体是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态，给予途径，治疗的预期目标(症状减轻与治愈)，和特定组合物的效价，稳定性和毒性。配制后，以与剂量配方相容的方式并且以治疗或预防有效的剂量给予溶液。以多种剂型容易地给予配方，如上面所述的注射液类型。在本发明的一个实施方式中，通过给予有效量的编码本发明所述嵌合蛋白的重组减毒细菌(如沙门氏菌)将vlp给予对象。vlp随后在体内通过细菌复制所在的肠道产生。对于使用该细菌载体实施方法的指导，参见例如nardelli-haefliger(2007)clinvaccineimmunol14,1285-1295，以引用方式将其特别针对该公开的内容并入。产生可在细菌(细菌载体)内表达的重组结构的方法是常见的；某些典型方法在本文其它地方有所描述。冻干的细菌可容易地运送到发展中国家，在那里可进行重悬并给予对象。该给予模式对于缺乏冷冻能力而需要其它vlp配方的国家是有利的。在另一个实施方式中，vlp在减毒病毒中给予，如减毒腺病毒，或本领域技术人员熟知的其它病毒载体。生产合适的可在病毒宿主中表达的重组核酸的方法是常见，在本文其它地方对某些这样的方法进行了讨论。本发明包括用于防止或减轻hpv感染的组合物。因此，本发明期望疫苗用于主动和被动免疫的实施方式中。本发明的一个实施方式是制备用于预防或治疗hpv感染的免疫球蛋白的方法，其包括用本发明所述疫苗对受体进行免疫，以及从受体中分离免疫球蛋白或抗体，和/或重组性地制备该免疫球蛋白或其片段的步骤。通过该方法制备的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。包括本发明所述的免疫球蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物是本发明的另一个方面，可用于生产治疗或预防hpv感染的药物。包括给予患者有效量的本发明所述的药物制剂的步骤的治疗或预防hpv感染的方法是本发明的另一个方面。通常通过将抗原组合物分散于生理上可耐受的稀释剂如盐水或其它适合人类使用的佐剂中以形成水性组合物来制备多克隆抗体产品的接种物。将免疫刺激量的接种物给予哺乳动物，例如人类，然后将已接种对象保持足以使抗原组合物诱导保护性抗体的时间。可通过众所周知的技术如亲和色谱法分离抗体至所需程度(harlow和lane,antibodies:alaboratorymanual1988)。抗体可包括来自各种常用动物的抗血清制剂，例如山羊，灵长类，驴，猪，马，豚鼠，大鼠或人。将动物放血并回收血清。根据本发明所制备的免疫球蛋白可包括全抗体，抗体片段或亚片段。抗体可为任意型的全免疫球蛋白，例如igg，igm，iga，igd或ige，具有针对两种或多种本发明所述抗原的双重特异性的嵌合抗体或杂交抗体。其也可为片段，例如包括杂交片段的f(ab')2，fab'，fab，fv等。免疫球蛋白也可包括天然，合成或基因工程蛋白，其通过结合于特异性抗原而形成复合物以起到抗体的作用。可将本发明所述hpv组合物或疫苗给予受体，其随后充当由于应答hpv组合物的激发而产生的免疫球蛋白的来源。这样处理的对象将提供血浆，通过常见的血浆分离方法从中获得超免疫球蛋白。将超免疫球蛋白给予另一个对象以赋予其抵抗hpv感染的能力或治疗hpv感染。本发明所述的超免疫球蛋白特别用于治疗或预防婴儿，免疫受损的个体或需要治疗而没有时间应答接种而产生抗体的个体的hpv感染。本发明的另一个方面是包括一种或多种单克隆抗体(或其片段；优选人类或人源化的)的药物组合物，其对抗本发明所述的免疫原性组合物的成分，可用于治疗或预防多种hpv类型的感染。本领域熟知制备单克隆抗体的方法，可包括脾细胞与骨髓瘤细胞的融合(kohler等(1975)nature256,495；harlow等antibodies:alaboratorymanual,1988)。另外，可通过筛选合适的噬菌体展示库获得单克隆fv片段(vaughan等(1998)natbiotech16,535-539)。单克隆抗体可为人的，人源化的，或通过已知方法部分人源化的。本发明的另一个方面是本发明所述的用于接种或治疗的试剂盒。在一个具体实施方式中，试剂盒包括药瓶和可选的指导给予的药品说明书，药瓶包括根据本发明所述方法给予的vlp组合物或疫苗。试剂盒中可包括本文所述的任意组合物。在非限制性实例中，试剂盒中可包括用于制备vlp和/或给予vlp的试剂，或通过接种vlp而产生的抗体。试剂盒可进一步包括用于评估vlp体内或体外活性的试剂。因此试剂盒可包括在合适容器中的vlp组合物。在某些方面，试剂盒可包括用于给予的试剂和/或装置，例如吸入器或雾化器。其也可包括一种或多种缓冲液，化合物或制备待给予的组合物的装置。试剂盒的组分可在水性介质中或以干粉形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个药瓶，试管，烧瓶，瓶，注射器或其它容器装置，将组分置于其中，优选进行适当分装。当试剂盒中有一种以上组分时，试剂盒可通常包括第二、第三或其它容器，单独放置其它组分。然而，在药瓶中可能包括多种组分的组合。本发明所述试剂盒通常也包括在密闭条件下包含容器的装置，以供商业销售。该容器可包括注塑或吹塑塑料容器，其中保存所需的药瓶。当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液为水溶液，特别优选无菌水溶液。然而，试剂盒的组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，可通过加入合适溶剂将粉末复溶。可以预见也在另一容器中提供溶剂。试剂盒也可包括使用试剂盒组分以及使用任意其它未包括在试剂盒中的试剂的使用说明。使用说明可能包括可以实施的变形。可考虑该试剂为本发明所述试剂盒的实施方式。然而，该试剂盒不限于如上确定的特定项目，并可包括任意用于制备和/或给予本发明所述vlp疫苗的试剂。对于其它用途，本发明所述试剂盒可用于实验性应用。技术人员可识别适于实施本发明所述方法的试剂盒的组分。附图说明图1显示了对嵌合l1-l2融合蛋白a-j的总结。将具有标示的氨基酸残基的hpv16l2肽插入至bpv1l1蛋白(在残基133/134之间)，或hpv16l1蛋白(在残基136/137之间)的de环中。实线表示l1蛋白。空心条表示l2蛋白。*表示2个氨基酸(pro和arg)将n末端和c末端分别加至由用于克隆的限制性内切酶位点所产生的肽上。图表未按比例绘制。图2-a)显示对嵌合融合蛋白的分析(通过感染了重组杆状病毒的sf-9细胞裂解液的蛋白质免疫印迹法)。在45-60kd范围内，mabaul或camvir-1检测到嵌合蛋白vlp的bpv1l1或hpv16l1为主要条带。对较低mw条带的反应可能是由于蛋白水解降解产物。两种mab均不与未感染的sf-9细胞裂解液或wt杆状病毒(acmnpv)感染的昆虫细胞裂解液反应。野生型bpv1l1或hpv16l1蛋白用作对照。图2-b)显示分别使用mabrg-i(a，b，j)或抗hpv16l2aa1-88(c)和hpv16l2aa11-200(d，e，f，g，h，i)的多克隆兔血清证实了所并入的l2肽的抗原性。d，e，f用作梯度纯化的融合蛋白。图3显示纯化的颗粒制剂的透射电子显微镜(tem)，x30,000：组装至vlp中的嵌合蛋白bl1-16l218-31(a)，17-36(b)，2-22(c)，75-112(e)，115-154(f)，149-175(g)和172-200(h)和16l1-16l217-36(j)，大小约为50-60nm。bl1-16l235-75(d)和bl1-16l213-107(i)未明确地形成壳粒或vlp。图4显示使用弗氏或明矾-mpl佐剂的bpvl1-hpv16l2(bl1-16l2)17-36兔和小鼠免疫，和使用明矾-mpl佐剂的hpv16l1-hpv16l2(16l1-16l2)17-36兔免疫：通过l2肽elisa进行评价。一式三份对100至7,812,500的5倍连续血清稀释液进行elisa。使用合成肽hpv16l2aa18-31作为抗原进行elisa。bl1-16l217-36抗血清的数据表明在nzw中使用弗氏佐剂的l2特异性抗体效价为62,500-312,500(图4-a))，在nzw中使用明矾-mpl的效价为12,500(图4-b))，在balb/c中使用明矾-mpl作为佐剂的效价为2,500-12,500(图4-c))。16l1-16l217-36抗血清的数据表明在nzw中使用明矾-mpl的l2特异性抗体效价为12,500(图4-d))。mabrg-i针对hpv16l2aa17-36(18)。数据显示为平均od+/-sd。图5显示使用抗rgl-vlp(hpv16l1/l2(17-36))血清对天然hpv2a病毒粒进行中和(rt-pcr中和试验)。hpv2a病毒粒分离自人类跖疣，在终稀释度为1:400的指定血清存在或未存在下孵化，并加至hacat细胞中(2-6道)。rna逆转录至cdna中，并且通过两轮巢式pcr检测到剪接的病毒rna，通过一轮pcr检测到作为对照的β-肌动蛋白rna。1道仅有hacat细胞；2道仅有hpv2，未加入血清；3道为抗-hpv2l1-vlp；4道为预免疫的抗rgl-vlp；5道为免疫的抗rgl-vlp；6道为抗-hpv16wtl1/wtl2-vlp。在终稀释度为1:400下对血清进行检测。图6显示来自多个(并非所有)人类和动物乳头状瘤病毒类型的l2肽的序列比对，其与hpv16l2的氨基酸17-36相对应。表中序列从上到下由seqidno:3至23表示。具体实施方式在之前的和以下实施例中，所有温度均表示为未校正的摄氏度；除非另有说明，所有部分和百分比均按重量计。实施例实施例i材料和方法a.杆状病毒表达嵌合l1-l2蛋白通过基因工程方法将hpv16的l2肽引入bpv1l1(通过插入至aa133/134之间)或hpv16l1(在136/137之间)的de表面环中。在构建中使用的引物对如下：(1.)5'-ctgtttgcatgttttataaagggtgacttttctattcacattttctgc-3'(seqidno:58)(编码hpv16l2aa18-24/bpvl1aa125-133)5'-gcaggtacatgtccacctgacacccaaacaacagatgacagg-3'(seqidno:59)(编码hpv16l2aa25-31/bpvl1aa134-140)(2.)5'-ccgctgaattcaatatggcgttgtggcaacaag-3'(seqidno:60)(编码ecori-bpvl1aa1-6)5'-gcatgaggtaccgcttttatttctttttcttttttgcaggc-3'(seqidno:61)(编码kpn1-终止-bpvl1aa489-495，野生型bpv1l1orf序列的胸腺嘧啶[nt]1476和[nt]1482被胞嘧啶代替)(3.)5'-gtataatgtcaggtggacatgtacctgcctgtttgcatgttttataaagttgggtgacttttctattcac-3'(seqidno:62)(编码hpv16l2aa17-33/bpvllaa128-133)5'-ctaaggttacccaaacaacagatgacaggaaacaaacaggcc-3'(seqidno:63)(编码hpv16l2aa34-36/bpvl1aa134-145)(4.)5'-cggccgcggggtgacttttctattc-3'(seqidno:64)(编码sstii-bpvl1aa129-133)5'-cggccgcggacccaaacaacagatg-3'(seqidno:65)(编码sstii-bpvl1aa134-138)(5.)5'-ggcgacacaaacgttctgcaaaacgcacaaaacgtgcatcggctacccaactttataaaacatgcccgc-3'(seqidno:66)(编码hpv16l2aa2-22-sstii)5'-gggcatgttttataaagttgggtagccgatgcacgttttgtgcgttttgcagaacgtttgtgtcgccgc-3'(seqidno:67)(编码hpv16l2aa2-22-sstii)(6.)5'-ggaaggttgaaggcaaaactattgctgatcaaatattacaatatggaagtatgggtgtattttttggtgggttaggaattggaacagggtcgggtacaggcggacgcactgggtatattccattgccgc-3'(seqidno:68)(编码hpv16l2aa35-75-sstii)5'-ggcaatggaatatacccagtgcgtccgcctgtacccgaccctgttccaattcctaacccaccaaaaaatacacccatacttccatattgtaatatttgatcagcaatagttttgccttcaaccttccgc-3'(seqidno:69)(编码hpv16l2aa35-75-sstii)(7.)5'-gcatgaccgcggttgggaacaaggcctcccacagctac-3'(seqidno:70)(编码sstii-hpv16l2aa75-83)5'-gcatgaccgcggagtttcttccactaaagaaac-3'(seqidno:71)(编码sstii-hpv16l2aa106-112)(8.)5'-gcatgaccgcggattgatgctggtgcaccaac-3'(seqidno:72)(编码sstii-hpv16l2aa115-121)5'-gcatgaccgcggagtagtaacagtattattaatatc-3'(seqidno:73)(编码sstii-hpv16l2aa147-154)(9.)5'-gcatgaccgcggaataatactgttactactgttactac-3'(seqidno:74)(编码sstii-hpv16l2aa149-156)5'-gcatgaccgcggttctgcaggtgttggaggctgcaatac-3'(seqidno:75)(编码sstii-hpv16l2aa167-175)(10.)5'-gcatgaccgcggccaacacctgcagaaactggag-3'(seqidno:76)(编码sstii-hpv16l2aa172-178)5'-gcatgaccgcggtgtatccataggaatttcttcataattatg-3'(seqidno:77)(编码sstii-hpv16l2aa191-200)(11.)5'-gcatgaccgcgggcatcggctacccaactttataaaac-3'(seqidno:78)(编码sstii-hpv16l2aa13-21)5'-gcatgaccg_cgg_agaaactatagaaggatcagaagggc-3'(seqidno:79)(编码sstii-hpv16l2aa99-107)生成这些引物的编码hpv16l2和bpvl1的序列，和所编码的蛋白的序列为：hpv16(114)l2核酸(seqidno:80)atgcgacacaaacgttctgcaaaacgcacaaaacgtgcatcggctacccaactttataaaacatgcaaacaggcaggtacatgtccacctgacattatacctaaggttgaaggcaaaactattgctgatcaaatattacaatatggaagtatgggtgtattttttggtgggttaggaattggaacagggtcgggtacaggcggacgcactgggtatattccattgggaacaaggcctcccacagctacagatacacttgctcctgtaagaccccctttaacagtagatcctgtgggcccttctgatccttctatagtttctttagtggaagaaactagttttattgatgctggtgcaccaacatctgtaccttccattcccccagatgtatcaggatttagtattactacttcaactgataccacacctgctatattagatattaataatactgttactactgttactacacataataatcccactttcactgacccatctgtattgcagcctccaacacctgcagaaactggagggcattttacactttcatcatccactattagtacacataattatgaagaaattcctatggatacatttattgttagcacaaaccctaacacagtaactagtagcacacccataccagggtctcgcccagtggcacgcctaggattatatagtcgcacaacacaacaagttaaagttgtagaccctgcttttgtaaccactcccactaaacttattacatatgataatcctgcatatgaaggtatagatgtggataatacattatatttttctagtaatgataatagtattaatatagctccagatcctgactttttggatatagttgctttacataggccagcattaacctctaggcgtactggcataaggtacagtagaattggtaataaacaaacactacgtactcgtagtggaaaatctataggtgctaaggtacattattattatgattttagtaccattgatcctgcagaagaaatagaattacaaactataacaccttctacatatactaccacttcacatgcagcctcacctacttctattaataatggattatatgatatttatgcagatgactttattacagatacttctacaaccccggtaccatctgtaccctctacatctttatcaggttatattcctgcaaatacaacaattccttttggtggtgcatacaatattcctttagtatcaggtcctgatatacccattaatataactgaccaagctccttcattaattcctatagttccagggtctccacaatatacaattattgctgatgcaggtgacttttatttacatcctagttattacatgttacgaaaacgacgtaaacgtttaccatattttttttcagatgtctctttggct_________________________________________________________hpv16(114)l2蛋白(seqidno：81)：(nc_001522)mrhkrsakrtkrasatqlyktckqagtcppdiipkvegktiadqilqygsmgvffgglgigtgsgtggrtgyiplgtrpptatdtlapvrppltvdpvgpsdpsivslveetsfidagaptsvpsippdvsgfsittstdttpaildinntvttvtthnnptftdpsvlqpptpaetgghftlssstisthnyeeipmdtfivstnpntvtsstpipgsrpvarlglysrttqqvkvvdpafvttptklitydnpayegidvdntlyfssndnsiniapdpdfldivalhrpaltsrrtgirysrignkqtlrtrsgksigakvhyyydfstidpaeeielqtitpstytttshaasptsinnglydiyaddfitdtsttpvpsvpstslsgyipanttipfggayniplvsgpdipinttdqapslipivpgspqytiiadagdfylhpsyymlrkrrkrlpyffsdvslaa________________________________________________bpv1l1核酸(seqidno：82)：atggcgttgtggcaacaaggccagaagctgtatctccctccaacccctgtaagcaaggtgctttgcagtgaaacctatgtgcaaagaaaaagcattttttatcatgcagaaacggagcgcctgctaactataggacatccatattacccagtgtctatcggggccaaaactgttcctaaggtctctgcaaatcagtatagggtatttaaaatacaactacctgateccaatcaatttgcactacctgacaggactgttcacaacccaagtaaagagcggctggtgtgggcagtcataggtgtgcaggtgtccagagggcagcctcttggaggtactgtaactgggcaccccacttttaatgctttgcttgatgcagaaaatgtgaatagaaaagtcaccacccaaacaacagatgacaggaaacaaacaggcctagatgctaagcaacaacagattctgttgctaggctgtacccctgctgaaggggaatattggacaacagcccgtccatgtgttactgatcgtctagaaaatggcgcctgccctcctcttgaattaaaaaacaagcacatagaagatggggatatgatggaaattgggtttggtgcagccaacttcaaagaaattaatgcaagtaaatcagatctacctcttgacattcaaaatgagatctgcttgtacccagactacctcaaaatggctgaggacgctgctggtaatagcatgttcttttttgcaaggaaagaacaggtgtatgttagacacatctggaccagagggggctcggagaaagaagcccctaccacagatttttatttaaagaataataaaggggatgccacccttaaaatacccagtgtgcattttggtagtcccagtggctcactagtctcaactgataatcaaatttttaatcggccctactggctattccgtgcccagggcatgaacaatggaattgcatggaataatttattgtttttaacagtgggggacaatacacgtggtactaatcttaccataagtgtagcctcagatggaaccccactaacagagtatgatagctcaaaattcaatgtataccatagacatatggaagaatataagctagcctttatattagagctatgctctgtggaaatcacagctcaaactgtgtcacatctgcaaggacttatgccctctgtgcttgaaaattgggaaataggtgtgcagcctcctacctcatcgatattagaggacacctatcgctatatagagtctcctgcaactaaatgtgcaagcaatgtaattcctgcaaaagaagacccttatgcagggtttaagttttggaacatagatettaaagaaaagctttctttggacttagatcaatttcccttgggaagaagatttttagcacagcaaggggcaggatgttcaactgtgagaaaacgaagaattagccaaaaaacttccagtaagcctgcaaaaaaaaaaaaaaaataabpv1l1蛋白(seqidno：83)：malwqqgqklylpptpvskvlcsetyvqrksifyhaeterlltighpyypvsigaktvpkvsanqyrvfkiqlpdpnqfalpdrtvhnpskerlvwavigvqvsrgqplggtvtghptfnalldaenvnrkvttqttddrkqtgldakqqqilllgctpaegeywttarpcvtdrlengacpplelknkhiedgdmmeigfgaanfkeinasksdlpldiqneiclypdylkmaedaagnsmfffarkeqvyvrhiwtrggsekeapttdfylknnkgdatlkipsvhfgspsgslvstdnqifnrpywlfraqgmnngiawnnllfltvgdntrgtnltisvasdgtplteydsskfnvyhrhmeeyklafilelcsveitaqtvshlqglmpsvcenweigvqpptssiledtyryiespatkcasnvipakedpyagfkfwnidlkeklsldldqfplgrrflaqqgagcstvrkrrisqktsskpakkkkk用于构建图1所示的结构j的编码hpv16l1的序列，和所编码的蛋白序列为：hpv16(114k)l1核酸(seqidno：84)atgtctctttggctgcctagtgaggccactgtctacttgcctcctgtcccagtatctaaggttgtaagcacggatgaatatgttgcacgcacaaacatatattatcatgcaggaacatccagactacttgcagttggacatccctattttcctattaaaaaacctaacaataacaaaatattagttcctaaagtatcaggattacaatacagggtatttagaatacatttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacctcattttataatccagatacacagcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgggcattagtggccatcctttattaaataaattggatgacacagaaaatgctagtgcttatgcagcaaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatctatggattacaaacaaacacaattgtgtttaattggttgcaaaccacctataggggaacactggggcaaaggatccccatgtaccaatgttgcagtaaatccaggtgattgtccaccattagagttaataaacacagttattcaggatggtgatatggttgatactggctttggtgctatggactttactacattacaggctaacaaaagtgaagttccactggatatttgtacatctatttgcaaatatccagattatattaaaatggtgtcagaaccatatggcgacagcttatttttttatttacgaagggaacaaatgtttgttagacatttatttaatagggctggtactgttggtgaaaatgtaccagacgatttatacattaaaggctctgggtctactgcaaatttagccagttcaaattattttcctacacctagtggttctatggttacctctgatgcccaaatattcaataaaccttattggttacaacgagcacagggccacaataatggcatttgttggggtaaccaactatttgttactgttgttgatactacacgcagtacaaatatgtcattatgtgctgccatatctacttcagaaactacatataaaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatttacagtttatttttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgttatgacatacatacattctatgaattccactattttggaggactggaattttggtctacaacctcccccaggaggcacactagaagatacttataggtttgtaacatcccaggcaattgcttgtcaaaaacatacacctccagcacctaaagaagatccccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaaaggaaaagttttctgcagacctagatcagtttcctttaggacgcaaatttttactacaagcaggattgaaggccaaaccaaaatttacattaggaaaacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaacgcaaaaaacgtaagctgtaahpv16(114k)l1蛋白(seqidno：85)：mslwlpseatvylppvpvskvvstdeyvartniyyhagtsrllavghpyfpikkpnnnkilvpkvsglqyrvfrihlpdpnkfgfpdtsfynpdtqrlvwacvgvevgrgqplgvgisghpllnklddtenasayaanagvdnrecismdykqtqlcligckppigehwgkgspctnvavnpgdcpplelintviqdgdmvdtgfgamdfttlqanksevpldictsickypdyikmvsepygdslffylrreqmfvrhlfnragtvgenvpddlyikgsgstanlassnyfptpsgsmvtsdaqifnkpywlqraqghnngicwgnqlfvtvvdttrstnmslcaaistsettykntnfkeylrhgeeydlqfifqlckitltadvmtyihsmnstiledwnfglqpppggtledtyrfvtsqaiacqkhtppapkedplkkytfwevnlkekfsadldqfplgrkfllqaglkakpkftlgkrkatpttsststtakrkkrkl通过反向降落(inverse-touchdown)pcr，使用杆状病毒转移载体bpv1l1-pevmod将逆向(背对背)合成的编码hpv16l2aa18-31的寡核苷酸(1.，见上述引物对)插入bpv1l1pevmod中(kirnbauer等(1992)procnatlacadsciusa89，12180-12184)。为避免非特异性产物，七个循环中将退火温度降低1.5℃，接着以最终降落温度进行另外30个循环。随后，插入的l2序列通过平末端连接而结合。通过(2.)将静默突变引入c末端l1orf(poly-atract)以避免扩增引物的突变。将突变的l1-l2序列再克隆至载体pevmod，并且通过再次应用pcr(3.)进一步延长所插入的l2表位。采用通过反向降落pcr使用引物对(4.)新建立的插入aa133/134中的sstii(ccgcgg)限制性酶切位点，将以下一系列贯穿hpv16l2的n末端的肽并入bpv1l1pevmod中。编码hpv16l2肽aa2-22(5.)，aa35-75(6.)的双链寡核苷酸(具有侧面sstii位点)通过合成寡核苷酸退火，或通过生成分别编码hpv16l2aa75-112(7.)，aa115-154(8.)，aa149-175(9.)，aa172-200(10.)，aa13-107(11.)的pcr扩增引物来生成，并克隆至bpvl1(aa133/134)的sstii位点。sstii(ccgcgg)编码脯氨酸(p)-精氨酸(r)，添加至所翻译的融合蛋白的l2两端。编码hpv16l1(来自基因克隆114k(27))-hpv16l2aa17-36(也称为16l1-16l217-36)的质粒通过将密码子优化的合成寡核苷酸(geneart，德国)亚克隆至杆状病毒转移载体psynwtvi-的bgiii到kpni位点来生成(kirnbauer等(1993)jvirol67,6929-36)。通过双向测序来证实重组表达载体(vbc-biotech，维也纳，奥地利)。通过用转移载体和线性杆状病毒dna(baculogold,bdbiosciences)共转染sf-9昆虫细胞来生成重组杆状病毒。如kirnbauer等(1992)(同上)之前所述进行vlp的表达和纯化。简言之，通过用扩增的杆状病毒原种感染3天来表达嵌合蛋白。随后，在pbs/0.8mnacl/2mmcac12/immpmsf中超声溶解收获的细胞。加入0.5％brij58后，将蛋白在4℃下孵化过夜。通过在蔗糖/pbs垫层(35％wt/vol)和cscl/pbs29％(wt/wt)密度梯度下超速离心来纯化高分子质量结构，每次至少24小时。在还原条件下通过大量透析至10mmtrishclph7.9/10mmdtt/7.5％2-巯基乙醇(2-me)中，可实现将vlp裂解为五聚体壳粒(由mccarthy等(1998)jvirol72,32-41调整)。用再透析至不含2-me的等量缓冲液的五聚体进行免疫。为了使用变性的抗原进行免疫，用pbs(0.5mnacl/immcac12/0.02％吐温80)透析vlp，并在4％sds中煮沸。b.蛋白免疫印迹法将sf-9细胞感染3天，收获，在裂解缓冲液(2％2-me)中变性并通过sds-page和蛋白免疫印迹法分析。通过识别线性bpvl1表位dtyryi(babco)(seqidno:93)的单克隆抗体(mab)au1或所培育的抗hpv16l1的camvir-1(bdpharmingen)来证实l1蛋白的表达。为证实l2肽的抗原性，使用针对hpv16l2aa17-36的mabrg-i(gambhira等.(2007b)jvirol81,13927-31)，或所培育的抗his标记的hpv16l2aa1-88或his标记的hpv16l2aa11-200的多克隆兔血清(pastrana等(2005a)virology337,365-72)来检测样品。c.透射电子显微镜(tem)将纯化的颗粒装载于辉光放电的碳包被的铜网上，用2.5％戊二醛固定，用1％醋酸铀酰负染，通过jeol1010电子显微镜在80kv和x30,000放大倍率下观察。d.免疫使用含有0.5mnacl/1mmcac12/0.02％吐温80的pbs大量透析蛋白。使用每种50μg在完全弗氏佐剂(cfa)中的天然或sds变性颗粒对两只新西兰白兔(nzw)进行免疫，接着在四周，六周和八周后使用在不完全弗氏(ifa)(charlesriver；kisslegg,德国)中的颗粒进行加强。另外，免疫原在根据生产商的方案配制的氢氧化铝凝胶(a8222,sigma-aldrich)和单磷酰脂a(s6322,sigma-aldrich)10:1的混合物中(称为明矾-mpl)给予。给予balb/c小鼠10μg抗原，并在第一次注射后四周，八周和十周进行加强。末次加强后的14天，收集血清并储存在-20℃。e.elisa使用his标记的hpv16l2aa1-88或hpv16l2aa11-200多肽包被微量滴定板，通过elisa测定所培育的抗bpv1l1-hpv16l2(也称为bl1-16l2)aa2-22,75-112,115-154,149-175,172-200血清中的特异性抗体效价。使用转化至e.colirosettade3(novagen)中的pet28a载体(pastrana等(2005a)(见上))生成这些抗原，经iptg诱导并在ni-nta柱(qiagen)上亲和纯化。收集洗脱的蛋白，通过蛋白免疫印迹法确证，通过bca蛋白含量测定试剂盒(pierce)定量并储存于-20℃。如前所述进行elisa(gambhira等(2007b)jvirol81,13927-31)。使用0.1μg/孔的在碳酸盐缓冲液中的l2肽将maxisorb板(nunc)包被过夜，并用1％bsa-pbs封闭。一式三份地在孔中将十倍稀释的抗血清在bsa/pbs/0.05％吐温20(tw-20)中孵化。用pbs/0.05％吐温20洗涤三次后，加入在bsa/pbs/0.05％吐温20中的过氧化物酶标记的抗体(1:5000)并在室温下孵化(温育)1小时。最后，对板进行洗涤并加入底物abts(boehringermannheim)显影。使用酶标仪(dynatech)测定405nm处的光密度(od)。f.使用合成生物素标记的hpv16l2aa18-31肽的elisa使用生物素标记的肽hpv16l2aa18-31(lyktckqagtcppd(seqidno:94)；jptpeptidetechnologies；柏林，德国)作为抗原，通过elisa测定所培育的抗bl1-16l2aa18-31，bl1-16l2aa17-36，16l1-16l2aa17-36抗血清(slupetzky等(2007)vaccine25,2001-10)。以1μg肽/孔加至nunc链霉亲和素板过夜(如nunc链霉亲和素常用包被方案中具体说明)。用pbs洗涤板，以0.5％脱脂干奶粉/pbs在4℃下封闭过夜，并以连续稀释的抗血清室温下孵化1小时。用pbs洗涤三次后，加入1:10,000稀释的标记物(conjugate，结合物)，洗涤板，用abts显影并在405nm处测定od。g.伪病毒体中和试验如buck等稍作修改后描述，在293tt细胞中产生伪病毒体并在optiprep梯度系统(sigma)中纯化(见全球网站：ccr.cancer.gov/lco/protocols.asp)。使用了以下用于表达l1和l2衣壳蛋白或分泌型碱性磷酸酶(seap)的质粒：包装质粒：hpv5：p5shell；hpv6：p6shell；hpv16：p16l1h，p16l2h；hpv18：pel1fb，pel2bhb；hpv45：p45shell，crpv：pcrpvl1，pcrpvl2(由j.schiller,nih提供，质粒图谱和文献：参见全球网站：home.ccr.cancer.gov/lco/plasmids.asp)，hpv31：p31l1h，p31l2h(konda等(2007)virology358,266-72)；hpv52：p52l1h，p52l2h(未公布)hpv58：p58l1h，p58l2h(konda等(2007)(同上))(由kanda提供，东京)hpv11：hpv:11l1，hpv11l2，hpv11l1/l2，未发表(由m.muller提供，海德尔堡)靶质粒：pyseap(由j.schiller,nih提供)包装衣壳蛋白的表达载体与报告质粒pyseap共转染，并通过比色法检测衣壳的产生。根据调整的方案进行中和试验(参见全球网站：ccr.cancer.gov/lco/neutralizationassay.htm)。一式两份地在孔中使用1:2连续稀释的血清以1:100开始在冰上孵化伪病毒体1小时。用伪病毒体感染后，在37℃下将293tt细胞孵化72小时，并在405nm处用比色法测定澄清细胞上清液中seap的活性(alphs等(2008)procnatlacadsciusa105,5850-5)。中和效价报告为导致每个试验中seap与相同稀释度的预免疫血清相比活性降低50％的最高稀释度的倒数。当在1:100稀释度时seap的减小接近50％，在1:50对血清进行了再评估。实施例ii.结果以往的研究已报导使用hpv16l2的肽aa1-88诱导针对同源性hpv的低效价体液免疫应答和体外异源类型的交叉中和(pastrana等(2005a)(同上))，以及使用hpv16l2的肽aa11-200接种可在体内产生针对crpv和ropv的激发的交叉保护(gambhira等(2007a)jvirol81,11585-92)。为提高免疫所产生的抗体效价，将l2肽并入l1的表面展示位点，可能引起衣壳表面上l2的360倍阵列。之前曾成功地通过bpv1vlp表面的de环成功表达长度达9aa的肽，而未损害其组装至免疫原性vlp中的能力(handisurya等(2007)febsj274,1747-1758；slupetzky等(2007)(同上))。因此，选择l1的de环进行插入以在组装的嵌合bpv1vlp表面展示l2肽(图1)。使用bpv1衣壳作为载体可避免诱导中和抗hpvl1抗血清，该中和抗hpvl1抗血清可掩盖低效价抗hpv16l2(交叉)中和抗体的检测。将九个部分重叠的hpv16l2肽aa18-31(a)，aa17-36(b，相当于mabrg-i的表位)；aa2-22(c)，aa35-75(d)，aa75-112(e)，aa115-154(f)，aa149-175(g)，aa172-200(h)，aa13-107(i)的编码序列插入bpv1l1的密码子133和134之间。也生成了另外的hpv16l2aa17-36插入至hpv16l1的嵌合l1-l2融合蛋白(16l1-16l217-36)(j)的表达载体。由于hpv16是最重要的高危型，其引起全世界50％的宫颈癌，我们认为使用hpv16l1vlp作为hpv16l2的载体可诱导组合高效价的抗hpv16l1和广泛交叉中和抗l2免疫应答。此处，通过序列比对选择插入至hpv16l1的de环的密码子136和137之间。生成重组杆状病毒并用于感染sf-9昆虫细胞。三天后，将细胞裂解并通过sds-page进行分析。使用mabau1(抗bpvl1)和camvir-1(抗hpv16l1)对重组蛋白的蛋白免疫印迹显示在45-60kd范围内迁移(图2-a)，a-j)。正如所预期的，大多数l1-l2融合蛋白的迁移比野生型l1蛋白稍慢。通过mabrg-i(抗hpv16l2aa17-36)或必要时通过所培育的抗hpv16l2aa1-88或hpv16l2aa11-200多克隆兔血清确证所插入hpv16l2肽的抗原性(图2-b))。一些更快的迁移条带可能是由蛋白降解所引起的。与亚单元五聚体相比，天然l1vlp引发更高效价的中和抗体，并且五聚体的免疫原性显著高于单体变性l1蛋白。因此通过tem测定嵌合l1-l2蛋白的组装状态。在形态形成模糊的情况下，进一步通过用构象依赖的mab5b6进行的elisa来区分在壳粒中的组装，其中该mab5b6的结合依赖于组装至五聚体中的bpv1l1(slupetzky等(2001)jgenvirol82,2799-804)。如图3所示，tem显示bl1-16l218-31(a)，17-36(b)，2-22(c)，75-112(e)，115-154(f)，149-175(g)和172-200(h)，和16l1-16l217-36(j)组装至全尺寸vlp中(直径约50-60nm)。嵌合蛋白bl1-16l235-75(d)和bl1-16l213-107(i)以有序性稍差的构象存在，表明存在l1五聚体或蛋白聚集。为了进一步区分这些可能性，进行了使用mab5b6(38)和mabau1的elisa。缺少vlp的蛋白制剂(d和i)均不与5b6反应，表明嵌合蛋白d和i不能组装至五聚体中。此外，结果显示与天然制剂相比，mabau1与变性的bl1-16l213-107(i)结合增强，但bl1-16l235-75(d)却没有，表明前者(i)而不是后者蛋白(d)的部分构象依赖性形成(未显示数据)。因此我们避免使用bl1-16l235-75进行免疫。十个嵌合蛋白中总计有八个能够组装至vlp中，分别在bpv1l1的de表面环中显示多达44个16l2的aa(bl1-16l2115-154(f)，加上侧面限制性内切酶位点sstii编码的4个aa)，在hpv16l1(j)中显示20个aa(图1，3)。l2特异性血清抗体通过免疫nzw兔来测定嵌合l1-l2vlp的免疫原性和针对展示l2肽的体液免疫应答。为了测定颗粒结构对免疫原性的影响，将每个抗原作为天然颗粒或sds变性抗原给予。使用强力的弗氏佐剂(cfa/ifa)进行免疫。使用人类适用的明矾-mpl作为佐剂，进一步给予诱导广泛交叉中和抗体应答的抗原。此外，为了包括另一个哺乳动物系统，使用抗原-明矾-mpl配方对近交系balb/c小鼠进行接种。使用bl1-16l218-31(a)，17-36(b)，2-22(c)，75-112(e)，115-154(f)，149-175(g)，172-200(h)，其每个作为天然或sds变性制剂，在cfa/ifa中对两只nzw兔进行免疫。由于组装不完全，bl1-16l213-107(i)蛋白仅作为天然制剂进行接种。分别使用合成肽hpv16l2aa18-31，或细菌表达的hpv16l2aa1-88或aa11-200蛋白作为抗原，通过elisa检测l2特异性免疫应答(表2)。除了bl1-16l22-22(c)，所有vlp制剂可诱导显著的抗体应答(效价范围为2,500-312,500)，而相应的变性蛋白每一种所引发的抗体水平通常低五倍(效价为500-12,500)。预免疫血清在所有情况下均无反应性。这些结果显示与类似的变性蛋白相比，存在于天然vlp上的表位具有增高的免疫原性。通过bl1-16l22-22(c)免疫而针对l2的可检测体液应答的完全缺失表明在兔体内hpv16l2的n末端的20个aa不代表b细胞表位。此外，bl1-16l213-107(i)不能组装至vlp可能是仅诱导适中的抗l2免疫应答的原因(效价为500)(表2)。表2通过hpv16l2肽elisa评价兔抗血清。使用弗氏佐剂(cfa/ifa)作为佐剂，用作为天然vlp或sds破坏的制剂的标明嵌合bl1-16l2蛋白对两只nzw兔进行接种。使用hpv16l21-88(对于所培育的抗bl1-16l22-22血清)，hpv16l2aa18-31(bl1-16l218-31，bl1-16l217-36)，hpv16l2aa11-200(bl1-16l275-112，bl1-16l2115-154，bl1-16l2149-175，bl1-16l2172-200，bl1-16l213-107)作为elisa抗原进行elisa。连续终点稀释血清并一式三份进行测试。sds破坏的蛋白bl1-16l213-107未用作免疫原(x)。体外中和伪病毒体中和试验利用基于乳头状瘤病毒的基因转移载体(伪病毒体)模拟体外乳头状瘤病毒感染及其抑制(buck等(2005)methodsmolmed119,445-62)。用壳体包裹了报告质粒pyseap的l1/l2衣壳感染细胞培养物，引起分泌性碱性磷酸酶(seap)的表达，可在上清液中测定，而用中和抗体预孵化伪病毒体可预防感染并降低seap的量。已显示中和抗体与在体内保护动物免受病毒激发有关(alphs等(2008)(同上)；gambhira等.(2007b)(同上))。使用l2同源型hpv16和l2离散高危型hpv18进行中和试验(表3a)。不进一步对无法中和任一类型感染的血清进行评价。在1:100-1:100,000的10倍连续稀释度下测定所有血清，对显示较低抗体水平的血清在1:50的血清稀释度下进行重新评价，而认为<50的效价无意义。表3a使用弗氏佐剂(cfa/ifa)作为佐剂，所培育的抗指定的天然或变性(denat.)bl1-16l2蛋白的兔血清的伪病毒体中和试验。分别显示了两只动物的效价。对于不中和hpv16和hpv18的血清，未对剩余的伪病毒体类型进行测试(x)。使用稀释度为1:100至1:100,000的血清进行试验。当对较低效价的中和抗体存在疑问时，在1:50的稀释度下重新评价。表3b通过所培育的抗天然bl1-16l2嵌合vlp的血清对bpv1伪病毒体进行中和。使用稀释度为1:100至1:100,000的血清进行试验。培育抗共表达野生型bpvl1和l2vlp的兔血清bpvl1/l2vlp。如阴性elisa结果所预期的，bl1-16l22-22(c)抗血清未包含任何可检测的中和抗体。用bl1-16l218-31(a)天然vlp免疫的两只兔中的一只产生抗hpv16(效价1:100)和非相关性β-hpv5(1:100)的中和抗血清。相反，sds变性的抗原诱导那些以及另外4种hpv类型的中和抗体(两只动物的效价均在括号中给出)：hpv16(100/100)，hpv18(100/100)，hpv45(100/0)，hpv52(0/100)，hpv58(0/100)，hpv5(1,000/100)，以及crpv(0/50)。因此推断嵌合vlp中存在肽hpv16l218-31对诱导中和抗体是不利的。此外，使用分解为五价壳粒的bl1-16l2aa18-31(a)免疫的动物不能诱导中和抗体(未显示)。使用bl1-16l217-36(b)vlp(包括rg-1表位)对兔进行免疫可诱导针对五种高危型hpv，hpv16(1,000/10,000)，hpv18(100-1,000/1,000)，hpv45(100/100-1,000)，hpv52(0/100)，hpv58(100/1,000)，低危型hpv11(0/50-100)和β-hpv5型(100/10,000)的中和抗体。抗破坏的vlp的免疫血清导致针对hpv16(100/100)，hpv18(100/0)，hpv58(100/0)和hpv5(100/0)的效价不太显著，并且未检测到hpv45，hpv52和hpv11的中和抗体。使用嵌合颗粒bl1-16l275-112(e)和bl1-16l2115-154(f)接种可分别以效价(100/0)(e)和(1,000/100)(f)中和hpv16伪病毒体，但未交叉中和任意其它所测试的伪病毒体。相应的变性抗原分别引发适中的效价(50/0)(e)和(100/50)(f)。虽然天然和变性bl1-16l2149-175(g)，bl1-16l2172-200(h)通过elisa诱导显著的16l2特异性免疫应答，但抗血清不中和hpv16和hpv18。两只动物中接种了bl1-16l213-107(i)蛋白的一只，形成了针对hpv16(100/0)和hpv58(50/0)的中和抗体(表3a)。因此，可在n末端hpv16l2aa17-148内对中和表位进行定位。然而，针对密切相关的生殖器高危型(hpv52，hpv58)，以及系统发育离散高危型(hpv18，hpv45)，生殖器低危型(hpv11)，β-hpv(hpv5)和动物pv(crpv)的交叉中和诱导限于先前报导的hpv16l2残基aa17-36(rg-1表位)。所培育的针对结构18-31的血清中和不足，强调了侧面aa17和32-36的重要性。此外，与线性融合蛋白相比，存在于vlp表面能够提高展示表位的免疫原性。为测定嵌合vlp是否保持诱导针对载体蛋白l1的构象依赖性表位的中和抗体的能力，进行了bpv1伪病毒体中和试验(表3b)。由嵌合vlp(bl1-16l218-31(a)，17-36(b)，75-112(e)，115-154(f)，149-175(g))诱导的抗血清以效价范围100,000至1,000,000中和bpv1伪病毒体，而两个嵌合体(bl1-16l22-22(c)和172-200(h))产生较低效价的中和抗体(1,000至10,000)。六个肽中的四个插入物不干扰针对l1的高效价中和抗体的诱导，与所并入肽的尺寸无关。由于弗氏佐剂未批准用于人类，使用明矾-mpl作为佐剂，用bl1-16l217-36(b)对另外两只兔进行免疫。类似的配方(aso4)用于已批准的hpvl1疫苗中。此外，用相同的抗原-佐剂配方对四只balb/c小鼠进行接种以将我们观察的交叉中和推进至不同的哺乳动物系统。肽-elisa检测到在兔和小鼠中均有效价为2,500-12,500的l2特异性抗体应答(图4-b)，4-c))。与明矾-mpl相比，与弗氏佐剂配制的嵌合vlp(图4-a))诱导至少高五倍的抗体效价。用明矾-mpl配方免疫的两只兔均可引发能够中和高危型hpv16(100/100)、hpv18(100/100)和hpv58(100/100)和β型hpv5(50/50)的抗血清(表4a)。此外，一只兔的血清中和高危型hpv45(100)和低危型hpv6(效价为50至100)和hpv11(100)。因此在免疫程序与弗氏佐剂相似的情况下，使用明矾-mpl的vlp免疫所诱导的效价低一或两个数量级。在使用bl1-16l217-36免疫的四只小鼠中，一只小鼠仅产生针对hpv16的中和抗体(效价为100)，两只小鼠引发针对hpv16(1,000/50-100)和18(1,000/100)的抗体，一只动物产生针对hpv18(100)，31(100)，45(100)，52(100)和58(100)的抗体(表4a)。表44a.使用明矾-mpl作为佐剂，用bl1-16l217-36免疫的两只nzw兔和四只balb/c小鼠的抗血清的伪病毒体中和试验4b.使用明矾-mpl作为佐剂，所培育的针对16l1-16l217-36的两只nzw兔的抗血清的伪病毒体中和试验。以1:100-1:100,000的10倍连续稀释血清一式两份地进行所有试验。当对较低效价的中和存在疑问时，在1:50的稀释度下重新评价血清。为进一步开发hpv衣壳作为潜在的疫苗载体，我们将交叉保护性表位hpv16l2aa17-36(rg-1)并入hpv16l1中(来自德国hpv16变体114k(kirnbauer等(1993)(同上)))。与bpv1l1的插入位点在aa133/134之间类似，hpv16插入至aa136/137之间。这些aa位于de表面环内，与高变的l1免疫显性片段相邻。通过tem观察到装配至vlp中(图3-j)。使用以明矾-mpl为佐剂的天然vlp对两只nzw兔进行接种。通过肽elisa检测到免疫诱导两只动物体内的l2特异性抗体，效价为1:12,500(图4-d))。当使用伪病毒体试验进行分析时，两只兔的血清均以效价为100,000中和hpv16，很大程度上反映了针对hpv16l1vlp载体的抗体应答。此外，观察到异型高危型hpv18(1,000/1,000)、hpv31(10,000/1,000)，hpv45(1,000/100)、hpv52(100/50)和hpv58(1,000/1,000)的强烈中和。此外，检测到一只兔的血清对低危型hpv6(100/50)、hpv11(100)的中和，以及β型hpv5(100/50)的中和(表4b)。正如所预期，以弗氏佐剂为佐剂，所培育的抗hpv16l1-vlp兔抗血清#4835(j.schiller)中和hpv16(1,000,000)并仅与hpv31(1,000)密切相关(未显示数据)。这些结果消除了载体l1对大范围交叉中和的影响，并表明l2肽的插入未干扰针对l1的高效价抗体应答。讨论最近引进的hpvl1vlp疫苗对hpv相关的肛门-生殖器肿瘤形成负担(费用)的影响及其成本效益是正在进行的研究主题。目前的疫苗针对hpv型，其导致90％肛门-生殖器疣(hpv6，hpv11)和/或70％的宫颈癌(hpv16，hpv18)。通过l1vlp接种的保护主要是类型限制性的，具有针对某些系统发育相关的粘膜的部分交叉保护。因此不能中止已接种妇女的细胞学筛查计划，并且除了筛查成本外需承受相当大的向人们引进预防性免疫计划的成本。此外，目前在80％的全球宫颈癌负担(费用)发生的发展中国家使用现有的疫苗是过于昂贵的。以往研究表明，使用n末端或全长l2肽或蛋白可诱导针对广泛的离散型乳头状瘤病毒类型和种类的低效价而具有保护性的抗体应答。本文所述的hpv16l1-hpv16l2vlp接种策略通过单一结构引发与单价hpv16l1-vlp接种相似的高效价构象依赖性中和抗体，以及针对l2高度保守区域的显著抗体水平，以交叉中和广谱病原性hpv类型。小型(t＝1)l1hpv16vlp的结晶显示了病毒衣壳的原子结构，特别是高变的表面环，其包含由中和抗体所识别并决定病毒血清型的免疫显性和构象依赖性表位(chen等(2000)molecularcell5,557-567)。为增加l2的免疫原性，将覆盖hpv16l2的n末端的肽插入至bpv1l1和hpv16l1的de环的相应位点。仍可进行vlp组装的所插入l2肽的耐受长度分别为44和20个残基。插入物的氨基酸序列作为vlp组装的额外限制。值得注意的是，序列分析有力地预测到在45-67存在跨膜区域是5-75和13-107l2结构组装失败的原因，并且其不存在于所有能够组装的结构中。这些观察数据扩展了以往的研究，并证实在两个不同pv型中，免疫原性de环是抗原呈递的合适位点。基于乳头状瘤病毒vlp的接种诱导针对l1和所并入抗原的强烈的体液(carter等(1994)virology199,284-91；christensen等(1994)jgenvirol75,2271-6；kirnbauer等(1992)(同上)；rose等(1994)jgenvirol75,2445-9)和细胞介导的免疫应答(handisurya等(2007)febj274,1747-1758；lenz等(2001)jimmunol166,5346-55；pinto等(2003)jinfectdis188,327-38；rudolf等(2001)jimmunol166,5917-24；slupetzky等(2001)jgenvirol82,2799-804；yang等(2004)jimmunol173,2624-31；zamora等(2006)immunol177,2662-70)。针对vlp的抗体应答强烈依赖于存在于表面的表位的密度(bachman等(1997)annrevimmunol15,235-70；chackerian等(2002)jorrnalofimmunology(baltimore,md:1950)169,6120-6)。我们发现用天然嵌合vlp免疫的兔通过elisa显示针对l2的强烈的免疫应答，平均效价比使用sds破坏的蛋白接种高5倍(表2)。假设当不存在佐剂时差异可能会更加明显，展示在l1vlp表面的肽似乎可代表有用的策略，以克服在天然株中l2的免疫亚显性。使用重叠肽对hpv16l2的n末端内的b细胞表位进行了全面检查。由于之前已发表嵌合bl1-16l269-81和108-120(slupetzky等(2007)(同上))，设计不重叠的相邻肽。通过使用包括hpv16l2aa13-154的嵌合蛋白实现同源hpv16伪病毒体的中和(表3a)。这些观察数据支持先前的研究，即由bpv4l2(campo等(1997)virology234,261-6；chandrachud等(1995)virology211,204-8)；bpv1l2(pastrana等(20005b)virology337,365-72)；crpv-ropvl2(embers等(2002)(同上))，hpv16l2(embers等(2004)vaccine22,670-80；kawana等(1998)virology245,353-9；pastrana等(2005b)(同上))的n末端的150个aa介导针对离散型pv的l2的保护性中和抗体应答。更大的一组粘膜型hpv的有效交叉中和限于所培养的针对并入的hpv16l2残基aa17-36，即先前描述的rg-1表位的血清(gambhira等(2007b)(同上))。之前已测定在不同pv属和型之间的该高度保守区域内的残基与次要细胞表面受体相互作用，其在病毒感染性的关键参与则分配至感染的较晚阶段。使用明矾-mpl作为佐剂缩小了本文所述的动物研究的免疫条件之间的差距，并且建立了l1亚单位疫苗。配方接近的专用佐剂aso4，其佐剂性质可通过促炎性细胞因子途径以及诱导记忆b细胞使固有免疫激活。在接种了弗氏佐剂或明矾-mpl中的bl1-16l217-36的兔个体之间，中和抗体模式差别很大，效价显示1-2的对数差异，或者对某些类型甚至呈阴性，这可能由于抗体在检测水平以下而不是在个体内的表位加工和呈递不同。总之，在两种不同的哺乳动物中诱导交叉中和，并使用适合人类使用的明矾-mpl作为佐剂。更重要的是，本文诱导的中和抗体的水平可能在体内具有保护性(embers等(2002)(同上)；gambhira等(2007a)(同上)；gaukroger等(1996)(同上))。乳头状瘤病毒对低效价抗血清中和的敏感度可能部分由于非常缓慢的摄取至细胞的动力学，其允许延缓进入中和抗体(culp等(2004)virology319,152-61)。此外，小鼠的阴道激发模型表明病毒最初与机械破坏的上皮的基底膜结合，最终吸附在上皮细胞，同时恢复与基底膜的接触(roberts等(2007)natmed13,857-61)。除了通过插入l2来修饰l1vlp表面，使用嵌合bl1-16l2vlp进行免疫也可诱导高效价抗bpv1l1抗体，而与所插入肽的长度无关。同样，与hpv16wtl1vlp接种相似，16l1-16l217-36vlp诱导高效价的hpv16中和抗体，表明其保留了l1的主要免疫原性表位。值得注意的是，以明矾-mpl作为佐剂，使用天然嵌合16l1-16l217-36vlp对兔进行免疫可诱导高危型hpv16/18/31/45/52/58，低危型6和11和β-hpv5型的强烈中和，在相同接种条件下，中和效价比所培育的抗类似的bl1-16l217-36vlp的血清高约10至100倍(表4)。这些结果表明在作为载体的hpv16l1的aa成分中，rg-1表位的存在是有利的。因此预期在离散型hpv的l2的高度保守区域17-36中的交叉中和表位能够以类似的方式展示。可考虑嵌合l1-l2vlp作为广谱hpv疫苗。其潜在用途基于作为疫苗载体的l1vlp，其具有良好的耐受性并且目前可提供8年的长期保护。由于所获得的产率与hpv16wtl1vlp相似(未显示数据)，期望本文所述的hpv16l1-hpv16-l217-36vlp疫苗除了提供针对同源性hpv16的高水平和类型限制性保护外，可提供针对异型hpv的广泛交叉保护而不增加成本。实施例iii.对基于l2交叉中和谱的进一步鉴定在0，4，6，8周，使用rg1-vlp(hpv16l1-16l2(17-36))加明矾-mpl佐剂(charlesriver，德国)对两只nzw兔免疫4次。第4次免疫2周后提取抗血清，并使用新建立的hpv型3，32，33，38，68，76的伪病毒体中和试验进行测试(helenafaust，joakimdillner，未发表)。将相同兔的预免疫血清用作对照。使用野生型hpv16l1vlp加弗氏佐剂免疫的nzw兔的抗血清用作另外的对照(用完全弗氏佐剂(cfa)进行初次免疫，用不完全弗氏佐剂(ifa)进行加强)。将血清稀释为1:100，1:1000和1:10,000并测试两次。将在稀释度1:100下非中和的血清在稀释度1:50下再测试一次。抗rg1-vlp血清交叉中和粘膜高危型hpv33，68，76，粘膜型hpv32(导致赫克病)和α皮肤型hpv3，效价为50至1,000(表5，第2、4列)。相反，相同兔的预免疫血清在所有试验中均为非中和的(第1，3列)。此外，检测到抗hpv16野生型l1vlp的抗血清#4835对hpv32，33和68产生低效价中和(第5列)。值得注意的是，使用较强的弗氏佐剂培育后一血清。表5.伪病毒体中和试验。所显示效价相当于指定的抗rg1-vlp或hpv16wtl1vlp(预)免疫兔血清的最高稀释度的倒数，其中所述血清中和指定的hpv伪病毒体类型。12345hpv3无1000无1000无hpv32无50无10050hpv33无100无100100hpv38无无无无无hpv68无1000无10050hpv76无100无100无1,nzw#1预免疫2,rg1-vlp+明矾-mplnzw#1第4次免疫后3,nzw#2预免疫4,rg1-vlp+明矾-mplnzw#2第4次免疫后5,hpv16wtl1vlp+cfa/ifanzw#4835第4次免疫后hpv2a病毒体中和试验(rt-pcr)我们接下来测定了抗rg1-vlp血清中和与hpv27和57密切相关的α皮肤型hpv2a的能力。hpv1，2，27和57是最流行的hpv类型，可在96％的hpv阳性普通皮肤疣中检测到(dekoning等,jclinmicrobiol)。此外，已描述了hpv2相关疣具有较长的持续时间(rubben等(1997)archdermatolres289,337-340)，并从粘膜病变中分离出hpv2和hpv57。为开展基于感染性病毒体的体外中和试验，从患有多种广泛皮肤疣的患者的大跖疣中分离出天然hpv2a。为了测定hpv类型，从疣组织中分离染色体dna，并使用靶向e1区域的普通引物cp4/cp5或ppf1/cp5进行40个循环的pcr扩增：ppf15'-(nt2082)-aac-aat-gtg-tag-aca-tta-taa-acg-agc-(nt2108)-3'(seqidno:86)cp45'-(nt1942)-atg-gta-car-tgg-gca-twt-ga-(nt1961)-3'(seqidno:87)cp55'-(nt2400)-gag-gyt-gca-acc-aaa-amt-grc-t-(nt2378)-3'(seqidno:88)对扩增引物进行测序，核苷酸blast(ncbi.nlm.nih.gov)显示与hpv2a(在提交本申请之日时，登记号为x55964)100％匹配。使用刀片去除疣组织，加入等体积的pbs后，在液氮中冷冻。将组织解冻并用fastprep-24仪器使用钢珠以4.0m/s进行机械匀浆2次，20秒(mpbiomedicals，llc)。在eppendorf微量离心机中以14,000rpm旋转5min后，收获含有病毒体的上清液并分装储存在-80℃下。以与所描述方法类似的方法开展中和试验(smith等(1995)j.invest.dermatol.105,438-444；shafti-keramat等(2003)jvirol77,13125-13135)。简言之，将角质形成细胞(3x105个细胞)接种于直径为60mm的组织培养皿中。第二天抽出培养基并用2μl在1mldmem(invitrogen)中的hpv2病毒体溶液感染细胞，其中该dmem在指定稀释度的抗rg1-vlp的预免疫或免疫血清下预孵化，或仅用培养基作为对照，加入细胞中之前在室温下孵化1小时并每15min温和振摇，然后加入4ml新鲜的dmem+10％fcs+1％抗生素/抗真菌剂(invitrogen)。作为特异性对照，用所培育的抗hpv2l1-vlp(tiiosenger赠送,germancancerresearchcenter,海德尔堡)或hpv16wt-l1/wt-l2vlp的抗血清孵化病毒体。孵化24小时后，使用trireagent(molecularresearchcenter，辛辛那提，俄亥俄州)收获总rna。对于第一链cdna合成，使用oligop(dt)15引物(roche)。使用下列引物进行两轮30循环的巢式pcr后，检测到剪接hpv2e1λe4mrna：第1轮：hpv2uo：5'-gggtggtaactacctgctg-3'(seqidno:89)，hpv2do：5'-ctcttgtcaggaactctgtacg-3'(seqidno:90)；第2轮：hpv2ui：5'-cagaaccgtccggctggtgg-3'(seqidno:91)，hpv2di：5'-cccacccgcccagtgccac-3'(seqidno:92)。剪接hpv2mrna的预期pcr扩增子的终尺寸为556bp，剪接β-肌动蛋白mrna为429bp。如图5所示，无可检测的病毒rna说明抗rg1抗血清中和了hpv2a病毒体(第5道)，而无血清对照(第2道)，预免疫血清(第4道)和所培育的抗hpv16wt-l1/wt-l2vlp血清(第6道)是非中和的。作为适当的对照，当未向细胞中加入病毒时(第1道)，或使用中和抗hpv2l1vlp血清时(第3道)未检测到病毒rna。为测定随时间推移的中和效价，在第0，4，6，8周用rg1-vlp加明矾-mpl对两只兔进行免疫并在第三次加强后10个月对血清进行分析。与第三次加强两周后提取的血清的效价相比，可检测到(交叉)中和抗血清的效价下降10至100倍或变得无法检测(表6，“10个月”列与“第三次加强”列比较)。重要的是，在第10个月用rg1-vlp加明矾-mpl对兔进行额外的加强可将两周后提取的血清的效价至少升高至以前的水平(见表6，“第4次加强”列)。这些数据表明对rg1-vlp的(交叉)中和表位产生功能性b细胞记忆应答。表6：初次免疫后10个月，用rg1-vlp(hpv16l1-16l2(17-36))对两只nzw兔进行的加强免疫表6：如上所述使用rg1-vlp加明矾-mpl对两只nzw兔进行免疫，并在第四次免疫(第3次加强)后2周提取血清。10个月后，提取血清(跟进10个月)，两只兔均接受额外的rg1-vlp加明矾-mpl佐剂加强并在两周后再次提取血清(第4次加强)。在指定的伪病毒体中和试验中，通过终点10倍连续稀释对血清进行分析。显示了中和效价。问号(？)表明未测定相应的中和效价。结论：用适合人类使用的佐剂中的嵌合hpv16l1-rg1vlp进行免疫可诱导针对粘膜高危型、低危型和离散皮肤α和β型乳头状瘤病毒的持久而广谱的抗体应答。通过以上描述，本领域技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且可在未偏离本发明实质和范围的前提下，对本发明进行变化和修改以适应各种用途和条件，并最大程度地利用本发明。之前优选的具体实施方式仅理解为说明性的，不以任何方式限定本发明的范围。对于以上所引用的以及在图表中的所有申请、专利和出版物(包括临时专利申请61/168,445，提交于2009年4月10日)的全部公开，以引用方式将其全部内容并入本文。当前第1页12