一种降血糖口服液及其制备方法与流程

本发明涉及一种降血糖口服液及其制备方法，属于保健食品技术领域。

背景技术：

近年来，我国糖尿病患病率逐渐上升，目前治疗糖尿病主要靠口服降糖药和胰岛素。但西药常出现低血糖症和胃肠道不适等不良反应；而中药治疗具有疗效稳定、副作用小、多靶点同时作用的特点，适宜糖尿病及其并发症的治疗。

青钱柳〔cyclocaryapaliurus(bata1)iljinsk〕系胡桃科青钱柳属落叶乔木，江西民间长期以来，采用其嫩叶制茶饮用，该茶具有生津止渴、清热解暑、降血糖、降血脂、降血压和延年益寿等作用，青钱柳中的黄酮类、多糖及微量元素具有较好的降血糖作用。目前青钱柳降血糖产品主要有青钱柳袋泡茶、口含片等固体制剂，其为青钱柳叶直接泡茶或青钱柳粗提物制剂，存在有效成分在体内吸收率低、吸收时间长、服用不方便等缺点。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种降血糖口服液及其制备方法，提高青钱柳叶降血糖生物利用度，起到多药协同降血糖的作用，从而提高整个制剂的降糖效果。

为了实现上述目的，本发明采用的一种降血糖口服液，包含下列重量比的原料：青钱柳多糖15～30％，青钱柳黄酮提取物2～4％，黄蜀葵花提取物15～40％，ztc1+1天然澄清剂4～6％，苯甲酸钠0.4～0.6％，甜蜜素0.1～0.2％，甘油0.8～1.5％，其余为水，原料总和为100％。

作为改进，各原料比例按照10ml口服液中含有青钱柳多糖1.54g，青钱柳黄酮提取物0.235g，黄蜀葵花提取物1.9g，ztc1+1天然澄清剂0.6ml，苯甲酸钠0.04g，甜蜜素0.02g，甘油0.15ml，余量为水。

另外，本发明还提供了一种降血糖口服液的制备方法，将青钱柳多糖、青钱柳黄酮提取物、黄蜀葵花提取物、ztc1+1天然澄清剂、苯甲酸钠、甜蜜素、甘油和水混合，经200目筛网过滤，灌装、封盖后，采用100～120℃杀菌10～30min，冷却到室温，贴标、外包装得产品。

作为改进，所述青钱柳黄酮提取物和青钱柳多糖分别通过以下步骤制得：

1)取青钱柳干燥叶粉碎，加水煎煮三遍，合并滤液，过滤、浓缩，冷却后加无水乙醇至含醇量达65％，放置24小时，过滤，滤液与沉淀分别备用；

2)大孔吸附树脂预处理后，将步骤1)得到的滤液经旋转蒸发仪浓缩后上大孔吸附树脂柱，吸附5小时后，分别用水、60％乙醇、85％乙醇、95％乙醇冲大孔树脂，收集洗脱液，薄层色谱点板后合并，用旋转蒸发仪浓缩，回收乙醇后干燥，即得青钱柳黄酮提取物；

3)将步骤1)得到的沉淀用旋转蒸发仪浓缩，回收乙醇，向浓缩液中加入其体积1/5的氯仿和1/5的正丁醇，振摇30min，震荡后的混合液在2000r/min的转速下离心10min，取出上清液，重复以上步骤5次，去除有机溶剂部分和蛋白质部分，得精制青钱柳多糖。

作为改进，所述黄蜀葵花提取物采用以下步骤制得：黄蜀葵花粉碎，加乙醇煎煮三遍，合并滤液，过滤后浓缩即得黄蜀葵花提取物。

作为改进，所述ztc1+1天然澄清剂采用以下步骤制得：a组分和b组分分别配置成1％粘胶液，先加b后加a，静置6-12小时即得。

与现有技术相比，本发明将青钱柳叶降血糖有效部位提取物配伍降血糖药用植物黄蜀葵花提取物制备成降糖口服液，既提高了青钱柳叶降血糖生物利用度，又起到多药协同降血糖的作用，从而提高了整个制剂的降糖效果。

附图说明

图1为本发明中青钱柳黄酮提取物、青钱柳多糖的提取工艺流程图；

图2为本发明绘制的葡萄糖标准曲线；

图3为空白对照组的胰腺组织细胞图；

图4为口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)中剂量(100×)后的胰腺组织细胞图；

图5为模型组(100×)的胰腺组织细胞图；

图6为消渴丸组(100×)的胰腺组织细胞图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例一

1.青钱柳黄酮提取物、青钱柳多糖和黄蜀葵花提取物的提取分离。

1.1原料与试剂

青钱柳叶：2013年6月采自江西修水；

黄蜀葵花：2013年6月采自安徽无为；

芦丁标准品；葡萄糖；苯酚；浓硫酸；

无水乙醇：无锡市苏强化工有限公司；

氢氧化钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；

盐酸；氯仿；正丁醇；甲醇；

1.2仪器与设备

粉碎机(rhp-400a型)：浙江永康市荣浩工贸有限公司；

d101大孔吸附树脂：杭州普修生物科技有限公司；

旋转蒸发仪(n1100)：上海爱朗仪器有限公司；

数显控温水浴锅：上海波洛实验设备有限公司；

数显鼓风干燥箱(gzx-9246)：上海博远实业有限公司医疗设备厂；

科生牌医用超声波清洗机(ks-600d)：宁波海曙科生超声设备有限公司；

大容量离心机(xyj-a2)：金坛市城东新瑞仪器厂；

电子天平(acs-30)：永康市友升衡器有限公司制造；电磁炉；

tu-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；

uv-2000型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)；

摇床；加湿器；具塞试管；容量瓶；

1.3青钱柳黄酮提取物、青钱柳多糖的提取，其工艺如图1所示：

1.3.1水提醇沉法

步骤：青钱柳叶粉碎→加水煎煮三遍，合并滤液→过滤→浓缩，冷却→加无水乙醇至含醇量达65％→放置24小时，过滤，滤液与沉淀分别备用。

1.3.2大孔树脂吸附法精制黄酮

大孔吸附树脂预处理后，将上步实验得到的滤液经旋转蒸发仪浓缩后上大孔吸附树脂柱，吸附五个小时后，分别用水、60％乙醇、85％乙醇、95％乙醇冲大孔树脂，收集洗脱液，薄层色谱点板后合并，用旋转蒸发仪浓缩，回收乙醇后，得干燥的总黄酮部位。

1.3.3黄酮含量的测定：紫外分光光度法

(1)步骤：

①芦丁标准溶液：称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.5mg于50ml容量瓶中，用70％乙醇溶解定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每1ml含芦丁0.11mg)。

②同法配置青钱柳总黄酮液：称取干燥后的总黄酮5.5mg于50ml容量瓶中，定容，摇匀(每1ml含总黄酮0.11mg)。

③分别取青钱柳总黄酮液、芦丁对照品溶液各1ml于10ml具塞试管中，乙醇定容，摇匀，10min后用双光束紫外分光光度计在200～450nm波长范围内进行扫描，乙醇作空白液。

(2)结果：得到的青钱柳叶总黄酮中黄酮的含量为75％。

1.3.4sevage法精制多糖

(1)步骤：

①将上步实验得到的沉淀用旋转蒸发仪浓缩，回收乙醇；

②向浓缩液中加入其体积1/5的氯仿和1/5的正丁醇，振摇30min，震荡后的混合液在2000r/min的转速下离心10min；取出上清液，重复以上步骤5次；

③去除有机溶剂部分和蛋白质部分，得精制青钱柳多糖。

(2)现象及结论

①有凝胶状物生成，水层和溶剂层交界处的是变性蛋白质。

②除去有机溶剂部分和蛋白质部分，即可得到脱蛋白的多糖溶液。

1.3.5多糖含量的测定：硫酸-苯酚法

(1)步骤：

①葡萄糖标准曲线的绘制：取葡萄糖100g干燥至恒重，精确称取209.2mg，置200ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为1.046mg/ml的标准溶液，吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别置100ml容量瓶中，加水定容，各吸取2ml，分别置于比色管中，加5％苯酚液1ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5ml，摇匀，于沸水浴中加热20min，迅速冷却至室温，另以蒸馏水2ml，同上操作加苯酚和硫酸进行显色反应，作空白对照，测定吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。

②青钱柳多糖溶液的配置：称取干燥后的多糖5.0mg于50ml容量瓶中，定容，摇匀(每1ml含粗多糖0.1mg)。

③多糖含量的测定：

取青钱柳多糖液0.5ml→加入1.5ml蒸馏水→取5％的苯酚1ml→浓硫酸5ml→摇匀，100℃沸水浴中20min→室温自然冷却→在波长488nm处测od。

④葡萄糖标准曲线：以葡萄糖标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线(如图2)，求回归方程，标准曲线的回归方程为y＝5.4407c+0.0253(其中y为吸光度值，c为葡萄糖浓度)，r^2＝0.9990。

(2)结果：青钱柳叶中总多糖中多糖的含量约为27％。

1.3.6结果与讨论

通过水提醇沉法，大孔树脂吸附法精制和sevage法得到青钱柳总黄酮和粗多糖。紫外分光光度法和硫酸-苯酚法分别测得青钱柳叶总黄酮中黄酮的含量为75％，总多糖中多糖的含量27％。

1.4黄蜀葵花提取物的提取分离

步骤：黄蜀葵花粉碎→加乙醇煎煮三遍，合并滤液→过滤→浓缩备用。

实施例二

1.青钱柳降血糖口服液的制备

1.1原料与试剂

青钱柳提取液：黄酮液，多糖液，黄蜀葵花提取液；

澄清剂：101果汁澄清剂(滑石粉)，ztc1+1天然澄清剂，明胶-单宁酸；

防腐剂：苯甲酸钠；矫味剂：甜蜜素；增溶剂：甘油；

冰乙酸：天津市福晨化学试剂厂；丙三醇：天津市福晨化学试剂厂；

芦丁标准品；葡萄糖；苯酚；浓硫酸；无水乙醇；无水甲醇；

1.2仪器与设备

大容量离心机(xyj-a2)：金坛市城东新瑞仪器厂；

数显鼓风干燥箱(gzx-9246)：上海博远实业有限公司医疗设备厂；

数显控温水浴锅(上海波洛实验设备有限公司)；

微量移液器(10-1000μl)(浙江华威科学仪器有限公司)；

电子分析天平(fa2004)：上海越平科学仪器有限公司；

tu-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；

uv-2000型紫外可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)；

摇床；加湿器；具塞试管；

1.3本发明所述技术方案的各种参数以下列实验数据和分析为依据：

1.3.1附加剂筛选预实验

(1)澄清剂的配置及步骤：

①101果汁澄清剂：浓度5％，用量为药液的9％，加入0.5％的滑石粉。

②ztc1+1天然澄清剂：a组分和b组分分别配置成1％粘胶液，用量5％，先加b后加a，静置6-12小时。

③明胶-单宁酸：用量为2％，最佳温度50℃，静置40min以上。

(2)实验结果：

经实验比较发现，添加了ztc1+1天然澄清剂的药液澄清度最好，故我们选用ztc1+1天然澄清剂作为澄清剂。常用的防腐剂有苯甲酸钠和山梨酸钠，我们通过抑菌实验发现苯甲酸钠的防腐效果更好。适合糖尿病患者的矫味剂有甜蜜素和甜菊苷，我们通过口服品尝等方法，发现甜蜜素更适合。常用的增溶剂如司盘、吐温等均有异味，不适合口服制剂增溶，口服液中加入适量医用甘油增溶，可提高澄明度，且甘油味甜、无异味、无刺激性。

1.3.2口服液的制备工艺考察

口服液的质量及稳定性与其配方中的澄清剂、防腐剂、矫味剂、增溶剂密切相关。因此通过正交试验分别考察澄清剂、防腐剂、矫味剂、增溶剂对口服液的主要有效成分含量的影响，确定最佳制备工艺。

正交实验设计：在预试验的基础上，确定各因素水平值，以有效成分的含量为考察指标，进行正交试验设计，实验因素水平见表1。

表1口服液的制备工艺因素水平表

1.3.3口服液含量测定

1.3.3.1黄酮含量的测定：紫外分光光度法

①芦丁标准溶液：称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品5.5mg于50ml容量瓶中，用70％乙醇溶解定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每1ml含芦丁0.11mg)。

②分别取青钱柳黄蜀葵口服液、芦丁对照品溶液各1ml于10ml具塞试管中，甲醇定容，摇匀，10min后用双光束紫外分光光度计在200～450nm波长范围内进行扫描，甲醇作空白液。

1.3.3.2多糖含量的测定：硫酸-苯酚法

①葡萄糖标准曲线的绘制：取葡萄糖100g干燥至恒重，精确称取209.2mg，置200ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为1.046mg/ml的标准溶液，吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别置100ml容量瓶中，加水定容，各吸取2ml，分别置于比色管中，加5％苯酚液1ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5ml，摇匀，于沸水浴中加热20min，迅速冷却至室温，另以蒸馏水2ml，同上操作加苯酚和硫酸进行显色反应，作空白对照，测定吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。

②多糖含量的测定：

取口服液1ml→定容，稀释100倍→取稀释液0.5ml→加入1.5ml蒸馏水→取5％的苯酚1ml→浓硫酸5ml→摇匀，100℃沸水浴中20min→室温自然冷却→在波长488nm处测od。

1.3.4正交实验与结果

以口服液中黄酮和多糖的含量为考察指标，选择l9(3⁴)正交表进行实验(见表2、表3)。

表2口服液制备l9(3⁴)正交试验结果

表3口服液制备方差分析结果

注：f0.01(2，2)＝99；f0.05(2，2)＝19。

由上述实验结果记录表2、表3可知，在对正交实验结果的极差分析中，rj越大，对实验结果影响越大。通过对该试验的极差分析可知：rd>rb>ra>rc即增溶剂>防腐剂>澄清剂>矫味剂。比较各因子不同水平的平均指标，对应k值大者所对应的水平为好，因素d的k值最大的是k3，因素b的k值最大的是k2，因素a的k值最大的是k1，因素c的k值最大的是k1即可以确定口服液制备的最佳工艺为：a1b2c1d3，即可以选择澄清剂为0.6ml，防腐剂为0.04g，矫味剂为0.02g，增溶剂0.15ml，青钱柳黄酮0.235g，青钱柳多糖1.54g，黄蜀葵花提取物1.9g，为最佳制备工艺条件。

1.3.5稳定性试验

以上九组实验中每组设置三个平行对照组，分别置于常温、高温、高湿的环境下，考察其稳定性。

①高温试验方法

按上述方法制备的九组口服液置于80℃的干燥箱中观察，30天后测其含药量。

②高湿试验方法

配置饱和的硝酸钾溶液于高湿器中观察，30天后测其含药量。

③长期稳定性试验方法

按上述方法制备的九组口服液置于常温下观察，30天后测其含药量。

④含量测定：照1.3.3项下的方法进行。

表4实验后各组别中的含药量(常温)

表5实验后各组别中的含药量(高温)

表6实验后各组别中的含药量(高湿)

分析上述各表格可知：

①三种澄清剂中，aztc1+1天然澄清剂的澄清效果最好。

②通过紫外分光光度法测黄酮含量和硫酸-苯酚法测多糖含量发现，第二、三、六、八组的药物含量略优于其他组。

③通过三组平行对照实验发现，常温下的口服液较高温高湿下的更稳定。

④在第二、三、六、八组中，第八组底部沉淀最少，其稳定性效果最好。故从稳定性效果看，可选用第八组作为青钱柳黄蜀葵降血糖口服液的最佳配方。第八组的ztc1+1天然澄清剂的剂量是0.8ml/10ml，甘油的剂量是0.25ml/10ml，苯甲酸钠的剂量是0.04g/10ml，甜蜜素的剂量是0.025g/10ml。

实施例三

本发明口服液降血糖作用研究。

1.1试验样品

青钱柳叶(产地江西修水县)

黄蜀葵花

1.2实验仪器

auw-220d型电子天平(日本岛津公司)

ks-600d医用超声波清洗机(宁波海曙科生超声设备有限公司)

n-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)

包埋机；显微镜(德国bresser)

rm-2235型生物组织切片机(德国leica)

1.3试剂

四氧嘧啶(sigma公司)；消渴丸(广州中一药业有限公司)；

血糖试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司)；甲醛；生理盐水；

1.4实验动物

健康sd小鼠(清洁级)，雌雄各半，体重(20g-30g)。

1.5小鼠降血糖实验

1.5.1糖尿病小鼠模型的建立及分组

取小鼠120只，雌雄各半，随机选取10只作为空白对照组(nc)，剩余小鼠喂食高糖高脂的饲料一周，再尾部静脉注射新鲜配置的四氧嘧啶溶液65mg/kg，第三天后用血糖试剂盒对禁食12h的小鼠测其空腹血糖，选取血糖高于11mmol/l的小鼠作为实验对象，随机选取合格小鼠分成11组，设糖尿病模型组(dmc)，消渴丸对照组(xkp)，青钱柳多糖高剂量组(cpph)，青钱柳多糖中剂量组(cppm)，青钱柳多糖低剂量组(cppl)，青钱柳黄酮高剂量组(cpfh)，青钱柳黄酮中剂量组(cpfm)，青钱柳黄酮低剂量组(cpfl)，口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)高剂量组(pfhh)，口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)中剂量组(pfhm)，口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)低剂量组(pfhl)。

1.5.2降血糖实验

空白对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水，消渴丸组灌胃消渴丸40mg/kg，粗多糖高中低分别给予50mg/kg.d，25mg/kg.d，12.5mg/kg.d。总黄酮高中低分别给予9mg/kg.d，4.5mg/kg.d，2.25mg/kg.d。黄蜀葵花提取物高中低分别给予80mg/kg.d，40mg/kg.d，20mg/kg.d。口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)高中低剂量灌胃。连续灌胃6周，分别于第2周、第4周、第6周测空腹血糖值。

1.5.3统计方法

各项指标以表示，均数间的显著性差异用t检验法

1.5.4小鼠胰腺细胞形态观察

将取血后的小鼠脱颈处死，解剖取胰腺组织浸泡在4％的甲醛溶液中48小时，再用多梯度的乙醇脱水，浸蜡，包埋，切片，染色，封片，显微镜下观察胰腺组织细胞形态，拍照，记录。

1.6口服液降血糖作用分析

1.6.1口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)对小鼠血糖的影响

表7青钱柳有效部位对小鼠血糖影响

注：*表示p<0.05与模型组有显著性差异；**表示p<0.01有较大显著差异；括号内表示小鼠量。

从表7可以看出空白组小鼠灌胃后血糖无显著变化，模型组与空白对照组血糖有显著差异(p<0.01)，说明模型建立成功，青钱柳多糖高中低组与模型组血糖有显著差异(p<0.05)，青钱柳黄酮高中低组与模型组血糖有显著差异(p<0.01)，口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)高中低组与模型组血糖有显著性差异(p<0.01)，消渴丸组与模型组血糖有显著差异(p<0.01)；但可看出消渴丸组，多糖高剂量组，黄酮高剂量组，口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)高剂量组小鼠死亡率较高。

1.6.2胰腺组织细胞的观察

在显微镜下：图3正常对照组胰岛为椭圆形的细胞团，细胞核大小均匀，分散于胰腺腺泡之间，胰岛中细胞数量较多，细胞分布均匀，排列规整，结构清晰，胞浆丰富，核圆居中；图5为模型组胰岛中细胞数量明显减少，细胞排列紊乱，结构破坏，胰岛轮廓消失，边界模糊不清；图6消渴丸组的胰岛结构较清晰，边缘较整齐，但胰岛细胞分布稀疏，数量较少，密度较低；图4口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)中剂量组胰岛细胞数量较多，胰岛结构完整，胰岛细胞排列较整齐，核圆、胞浆丰富。

目前，治疗糖尿病主要依靠口服降糖药和注射胰岛素。其中，西药虽然显效快，作用直接，但常出现低血糖症和胃肠道不适等不良反应。而中药治疗具有疗效稳定，副作用小，多靶点同时作用的特点，适宜糖尿病及其并发症的治疗。目前对于有效活性部位的研究普遍采用动物模型建立和细胞水平模型来进行筛选。

本发明是通过四氧嘧啶选择性地破坏胰岛β细胞致使β细胞分泌胰岛素的功能发生障碍，诱发小鼠高血糖，为胰岛素低下型高血糖动物模型，小鼠灌胃青钱柳高中低剂量多糖和黄酮六周后，血糖均出现明显下降，表明了青钱柳多糖和黄酮均具有降血糖的功效，是青钱柳的降血糖有效活性部分，但当灌胃高剂量的多糖和黄酮时小鼠死亡率较大，可能由于高剂量的多糖和黄酮具有弱毒性作用，而由实施例可知口服液(青钱柳多糖+青钱柳黄酮+黄蜀葵花提取物)中剂量灌胃降血糖作用最明显，且小鼠死亡率较低；从胰岛细胞形态分析，多糖和黄酮中剂量的胰岛细胞正常，说明青钱柳多糖和黄酮及黄蜀葵花提取物的联合应用能明显减轻和修复四氧嘧啶对小鼠胰岛细胞的损伤，有改善胰岛细胞形态结构的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。