一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体制备及三联一体化应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体，其制备方法及其“三联一体化”的抗肿瘤应用。

背景技术：

热敏脂质体(thermosensitiveliposomes)又称温度敏感脂质体，是一种能在温热条件下释放药物的脂质体。在高于脂质体相变温度的加热温度下，脂质体膜由“胶晶态”转变到液晶结构，通透性增加，其携带的药物迅速释放于加热部位而产生热靶向作用。它有效利用了脂质体和热疗的双重优势，进一步增加了脂质体的靶向性，减少了网状内皮系统对脂质体的摄取，提高了治疗效果，降低了毒性。

热疗(hyperthermia，ht)是通过人为方法提高人体组织温度来治疗肿瘤的一种方法，热疗治疗肿瘤的机制主要有以下三种：①对肿瘤组织具有选择性作用，同样受热肿瘤组织的热反应敏感，温度较正常组织升高，易被选择性杀伤②对肿瘤细胞有直接杀伤作用，温度超过40℃使肿瘤细胞蛋白变性，从而致使肿瘤细胞死亡③刺激肿瘤细胞产生热休克蛋白，而表达热休克蛋白的肿瘤细胞对自然杀伤细胞特别敏感，能出现溶解破坏。热疗虽然不能取代手术、放疗或化疗作为一种独立的肿瘤治疗方案，但它对化疗、放疗和手术等肿瘤治疗手段具有明显的增效和补充作用。

放射治疗(radiationtherapy)是通过射线的电离作用引起生物体细胞产生损伤的过程，是治疗恶性肿瘤的三大重要手段之一。大约有60％-70％的恶性肿瘤病人需要接受放射治疗。根据肿瘤的生物学行为，一些肿瘤的治疗以放射治疗为主可达根治目的。对不宜手术、失去手术机会、手术后有肿瘤残留或可疑肿瘤残留者，接受放射治疗是肿瘤局部控制的重要选择。目前，增加肿瘤靶区放射剂量，提高肿瘤局部控制率，降低肿瘤周围正常组织照射剂量，保存重要脏器正常功能，提高病人的生存质量，成为放射治疗的主要发展趋势。

中空金纳米粒属于金纳米颗粒的一种，由于其空腔结构所形成的大吸收截面，故较实心金纳米粒具有更高的光热转换效应，并且具备低毒、小尺寸(直径30-60nm)、球形形状、可调谐的(550-950nm)吸收带等特性，因此在光热治疗上，中空金纳米粒可以有效替代实心金纳米粒。此外，金纳米材料的光热治疗比化疗和放疗副反应少得多，基本不损伤正常组织，是一种新的肿瘤热疗技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。另一方面，金纳米颗粒在经x射线或γ射线照射后，产生强的光电吸收效应和二次电子，加速dna链断裂，因此可以作为放疗领域中一类新型的放射增敏剂。

本发明旨在将肿瘤治疗剂与中空金纳米粒相结合，制备出具备光敏感性和温度敏感性的制剂，有效地联合药物治疗、热疗和放疗这种“三联一体化”治疗手段，提高对肿瘤靶向性治疗效果并降低单一手段治疗的毒副作用。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体，该制剂能够作为良好的抗肿瘤药物载体，通过nir使药物在肿瘤部位高效释放，并联合热疗和放疗作用，提高治疗效果。

本发明的目的之二在于提供一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体制剂的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体制剂在肿瘤治疗中的应用。

本发明提供如下技术方案

一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体，其特征在于，所述制剂是由热敏脂质体通过挤膜法包载中空金纳米粒，再包载肿瘤治疗剂制备而成，所述脂质体的相变温度为39.0℃～45.0℃，所述脂质体包含二棕榈酰基卵磷脂(dppc)。

进一步地，所述的热敏脂质体制剂，其特征在于：中空金纳米粒与二棕榈酰基卵磷脂(dppc)的重量比为1～4∶60，脂质体的粒径为150-250nm，电位为-15～-30mv。

进一步地，所述的热敏脂质体制剂，其特征在于，所述中空金纳米粒粒径为30-60nm，最大吸收波长在650-850nm。

进一步地，所述的热敏脂质体制剂，其特征在于，所述肿瘤治疗剂选自小分子化学治疗药物、生物蛋白药物或基因治疗相关药物。

进一步地，所述的热敏脂质体制剂，其特征在于，所述小分子化学治疗药物选自紫杉醇、盐酸阿霉素、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶、顺铂、柔红霉素、激素类药物或中药单体；所述生物蛋白药物选自利妥昔单抗、贝伐珠单抗或曲妥珠单抗；所述基因药物选自含报告基因、抗癌基因、细胞因子基因能在真核细胞中重组表达的质粒dna，寡聚核苷酸或是小干扰rna。

进一步地，所述的热敏脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体制剂处方为：

其通过如下方法制备得到：按照处方量称取dppc、dspe-peg2000，均匀混合后加入有机溶剂溶解，置于旋转蒸发仪上除去有机溶剂成膜，加入浓缩的中空金纳米粒溶液水化后，60℃过0.2μm滤膜十几次，制备出包载中空金纳米粒的热敏脂质体；加入处方量阿霉素粉末，在60℃下溶解并搅拌孵育4小时，放冷后透析除去未包载的阿霉素，得到包载阿霉素与中空金纳米粒的热敏脂质体制剂。

进一步地，所述的共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)100毫升超纯水，加入0.5-1ml0.05m柠檬酸钠溶液和100μl0.4m氯化钴溶液，氮气保护；加入0.5-1ml0.1m硼氢化钠溶液，搅拌15-30min，加入200-500μl1％氯金酸，通空气搅拌30min，得到中空金纳米粒；

(2)分别称量dppc30-60mg、dspe-mpeg6-15mg，溶解于氯仿5-10ml中，30-40℃旋转蒸发除去有机溶剂制得磷脂膜；

(3)将步骤(1)中制得的中空金纳米粒按照处方量，高速离心后除去上清液，使用超纯水重分散沉淀的中空金纳米粒，水化步骤(2)中制得的磷脂膜，50-60℃过0.2μm滤膜十几次；加入肿瘤治疗剂并溶解，50-60℃搅拌2-6h，放冷后透析或离心除去未包载的肿瘤治疗剂，得到共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体制剂。

进一步地，本发明提供所述的共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂热敏脂质体在制备抗肿瘤载体方面的应用。所述抗肿瘤载体的给药途径为注射、口服或黏膜给药，应用于肿瘤的药物治疗、热疗联合放疗的“三联一体化”协同治疗。

进一步地，本发明提供一种共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体在“三联一体化”治疗中的应用，给予制剂后，以1-5w/cm²的nir照射肿瘤部位，照射时间为2-15min，重复2-4轮；以2-12gy功率的射线照射肿瘤部位，照射时间为3-15min。

本发明的特点

本发明的优点在于将热敏脂质体与具备较佳光热转化能力和放疗增敏效果的中空金纳米粒相结合，在正常体温37℃下，仅有不超过20％药物释放，而通过nir照射肿瘤部位，中空金纳米粒光热转化，使脂质体温度迅速超过相转变点，快速完全地释放药物杀伤肿瘤细胞，并通过中空金纳米粒的产热达到热疗目的。同时中空金纳米粒对x射线的强光电吸收效应增强肿瘤对放疗的敏感性，实现“三联一体化”的协同治疗策略，提高肿瘤治疗效果。

本发明制备得到的包载中空金纳米粒的热敏脂质体，通过nir照射可在肿瘤部位释放药物达到靶向效果，降低了药物治疗的毒副作用，又通过热疗和放疗的进一步杀伤能力，提高了治疗效果，这种联合治疗方式是未来肿瘤治疗的主要趋势之一。

附图说明

图1为本发明中中空金纳米粒的透射电镜图。

图2为本发明中中空金纳米粒的紫外全波长扫描图。

图3为几种金纳米材料光热转化的升温曲线。

图4为本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体的透射电镜图。

图5为本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体的粒径分布图。

图6为包载中空金纳米粒与实心金纳米粒热敏脂质体的光热升温曲线。

图7为本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体在37℃和42℃温度下的体外释放曲线。

图8为本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体，包载实心金纳米粒热敏脂质体，包载阿霉素热敏脂质体和游离阿霉素在mcf-7细胞中的细胞存活率。

图9本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体，包载实心金纳米粒热敏脂质体，包载阿霉素热敏脂质体和游离阿霉素在激光处理后mcf-7细胞的存活率。

图10本发明中包载中空金纳米粒热敏脂质体，包载实心金纳米粒热敏脂质体经x射线照射后细胞存活率。

具体实施方式

下面为本专利的实施例，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：

中空金纳米粒的合成与表征

100毫升超纯水，加入1ml0.05m柠檬酸钠溶液和100μl0.4m氯化钴溶液，氮气保护；加入1ml0.1m硼氢化钠溶液，搅拌15min，加入200μl1％氯金酸，通空气搅拌30min，15000转离心15min，超纯水重分散沉淀，得到中空金纳米粒；使用透射电镜和紫外全波长扫描仪对产物进行检测，结果如图1和图2。

实施例2：

几种金纳米材料光热转化能力的比较

按照相关文献方法制备得到实心金纳米粒、金纳米星和中空金纳米粒，通过离心浓缩，调整使其金含量相同；分别从上述溶液中取1ml于石英皿，808nm激光以3w/cm²照射10min，红外测温枪每隔1min检测一次温度，并以生理盐水作为对照，结果如图3。

实施例3：

按照处方量称取dppc、dspe-peg2000，均匀混合后加入有机溶剂溶解，置于旋转蒸发仪上除去有机溶剂成膜，加入浓缩的中空金纳米粒溶液水化后，60℃过0.2μm滤膜十几次，制备出包载中空金纳米粒的热敏脂质体；加入处方量阿霉素粉末，在60℃下溶解并搅拌孵育4小时，放冷后透析除去未包载的阿霉素，得到包载阿霉素与中空金纳米粒的热敏脂质体制剂。

实施例4：

按照处方量称取dppc、mppc，均匀混合后加入有机溶剂溶解，置于旋转蒸发仪上除去有机溶剂成膜，加入浓缩的中空金纳米粒溶液水化后，50℃过0.2μm滤膜十几次，制备出包载中空金纳米粒的热敏脂质体；加入处方量顺铂粉末，在50℃下溶解并搅拌孵育3小时，放冷后透析除去未包载的顺铂，得到包载顺铂与中空金纳米粒的热敏脂质体制剂。

实施例5

按照处方量称取dppc、dspe-peg2000，均匀混合后加入有机溶剂溶解，置于旋转蒸发仪上除去有机溶剂成膜，加入利妥昔单抗的pbs溶液(0.5-2mg/ml)水化后，加入浓缩的中空金纳米粒，50℃过0.2μm滤膜十几次，制备出包载利妥昔单抗与中空金纳米粒的热敏脂质体制剂。

实施例6：包载中空金纳米粒热敏脂质体的透射电镜检测与粒径分布测定：通过jem透射电子显微镜检测热敏脂质体的形态，结果如图4；通过马尔文激光粒度仪测定脂质体的粒径分布，脂质体平均粒径为200nm，粒径分布图见图5。

实施例7：包载中空金纳米粒与实心金纳米粒热敏脂质体的光热转化能力比较

按照上述工艺制备包载中空金纳米粒和实心金纳米粒的热敏脂质体，调整浓度使其金含量相同；分别从上述溶液中取1ml于石英皿，808nm激光以3w/cm²照射10min，红外测温枪每隔1min检测一次温度，并以pbs(7.4)作为对照，结果如图6。

实施例8：共载中空金纳米粒和阿霉素的热敏脂质体的体外释放评价

取包载阿霉素的制剂2ml于透析袋(截留分子量＝7000da)内，两端用棉线扎紧，置于50ml碘量瓶中，各加入释放介质(ph7.4)20ml，分别置于37℃和42℃恒温水浴振荡器中，转速为100r/min，分别于0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h每次取样1ml，补等温释放介质1ml，样品于荧光分光光度计检测，计算药物释放量，结果如图7。

实施例9：共载中空金纳米粒和肿瘤治疗剂的热敏脂质体体外抗肿瘤活性评价

(1)单一化疗作用

将mcf-7细胞以5000个/孔接种于96孔板中，孵育24h后，将制剂稀释成不同浓度加入96孔板中，同时以游离阿霉素溶液作为对照组。孵育48h后，取20μl四甲基偶氮唑蓝(mtt，5mg/ml)加入各孔内，继续孵育4h，弃去孔内液体，加入dmso150μl，振摇10min使结晶充分溶解，在570nm波长下用酶标仪测定各样品的吸光值(odsample)，同时测定空白组od值(odcontrol)，并计算细胞存活率，结果见图8。

(2)化疗联合热疗作用

将mcf-7细胞以5000个/孔接种于96孔板中，孵育24h后，将制剂稀释成不同浓度加入96孔板中，同时以游离阿霉素溶液作为对照组。孵育6h后，以808nm激光2w/cm²，照射5min，在2h内处理4次，继续孵育42h，取20μl四甲基偶氮唑蓝(mtt，5mg/ml)加入各孔内，继续孵育4h，弃去孔内液体，加入dmso150μl，振摇10min使结晶充分溶解，在570nm波长下用酶标仪测定各样品的吸光值(odsample)，同时测定空白组od值(odcontrol)，并计算细胞存活率，结果见图9。

(3)放疗增敏作用

将mcf-7细胞以5000个/孔接种于96孔板中，孵育24h后，将未包载治疗剂的制剂稀释成不同浓度(以au含量计)加入96孔板中，同时以pbs溶液作为对照组。孵育6h后，以6gay放射线照射5min，继续孵育42h，取20μl四甲基偶氮唑蓝(mtt，5mg/ml)加入各孔内，继续孵育4h，弃去孔内液体，加入dmso150μl，振摇10min使结晶充分溶解，在570nm波长下用酶标仪测定各样品的吸光值(odsample)，同时测定空白组od值(odcontrol)，并计算细胞存活率，结果见图10。