一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，包括：将阿霉素(DOX)分散于无水乙醇和氨水的混合溶液中，加入正硅酸乙酯，离心分离得沉淀，洗涤，冷冻干燥得SiO2-DOX纳米粒子粉末；将壳聚糖(CS)溶于三氟乙酸(TFA)得到壳聚糖溶液；将聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)充分溶解得到聚乳酸-羟基乙酸溶液；将壳聚糖溶液和聚乳酸-羟基乙酸溶液混合，磁力搅拌，得到混合溶液，将SiO2-DOX粉末加入到所述的混合溶液中，先超声分散，再继续磁力搅拌，使SiO2-DOX分散于所述的混合溶液中；将混合溶液进行静电纺丝，得到PLGA/CS/SiO2-DOX静电纺复合纳米纤维载药体系。本发明制备工艺简单，反应条件温和，制备的载药纤维具有生物相容性好、药物持续缓释、抗癌活性高等优点。
【专利说明】一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于载药纳米纤维的制备领域，特别涉及一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着纳米技术的兴起与发展，无机纳米粒子作为药物载体引起了研究者们的广泛关注。但是，使用单纯无机纳米粒子药物载体存在药物释放过快、粒子毒性大等劣势。因此，将无机纳米粒子与高分子聚合物结合制备复合型纳米级药物释放体系，改善药物载体本身的生物相容性，并达到药物的持续释放效果，逐步成为人们研究的热点。
[0003]静电纺丝(electrospinning)是指利用静电场力使带电聚合物溶液或熔体在高压电场中进行喷射纺丝，形成具有微纳米尺寸的聚合物纤维。静电纺制备的纳米纤维具有纤维尺寸可控、比表面积大、孔隙率高，独特的三维网状结构以及细胞外基质的结构相似等独特优势。基于静电纺丝纤维这些特性，利用混合、同轴或乳液静电纺技术制备药物释放载体，具有较高的包封率和载药量。研究表明，纯静电纺纳米纤维制备的药物载体存在药物突释现象，这就严重限制了纯静电纺纳米纤维在药物载体领域的应用。
[0004]目前，常用的无机纳米粒子作为药物载体的有纳米羟基磷灰石、硅基纳米材料、碳纳米材料等。其中，硅基纳米材料具有大的比表面积、可控的粒子尺寸、形貌可调、粒子毒性低、高的药物装载量等特点，近年来将其作为药物载体得到了迅猛的发展。
[0005]聚乳酸-轻基乙酸(poly (lactide-co-glycolide) ,PLGA)是一种具有良好的生物相容性和生物可降解性的高聚物材料，已被作为一种优良的生物医用材料，广泛地应用于可植入材料和组织工程领域。中国专利(申请号201110349280.3)制备了锂皂石掺杂的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维，具有良好的机械性能、热稳定性、血液相容性和生物相容性。由于纯无机纳米材料的药物载体和纯静电纺纳米纤维均存在着药物突释现象，因此，利用静电纺丝技术将无机纳米载药粒子与有机高分子聚合物进行静电纺，形成无机纳米粒子和高聚物的双重载体，对于制备新的纳米纤维载药系统是可行的。壳聚糖(chitosan，CS)是一种天然高分子，具有生物相容性好、利于伤口愈合等特性，广泛作为生物医学及制药等方面的生物材料。这样，将壳聚糖加入到其他高分子聚合物中，可以改善复合材料的生物特性。由此，将无机药物载体与高聚物PLGA和壳聚糖进行共纺，可开发具有药物持续释放的复合纳米纤维载药系统。
[0006]截止目前，国内外文献或专利检索结果表明，尚没有发现以静电纺丝技术制备PLGA/CS/S12-DOX复合纳米纤维载药体系的研究。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法。该方法简单，反应条件温和，产品易得，所采用的PLGA和壳聚糖都具有很好的生物相容性，制备的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜具有很好的药物持续释放效果。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括:
[0009]第一步:将阿霉素(DOX)分散于无水乙醇和氨水的混合溶液中，磁力搅拌0.5-lh，然后加入正硅酸乙酯，继续搅拌4-24h，离心分离得沉淀，用去离子水洗涤，冷冻干燥得S12-DOX纳米粒子粉末；
[0010]第二步:将壳聚糖(CS)溶于三氟乙酸(TFA)中，磁力搅拌使其充分溶解得到壳聚糖溶液；
[0011]第三步:将聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)加入到三氟乙酸(TFA)、或六氟异丙醇(HFIP)、或四氢呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)的混合液中，磁力搅拌8_12h使其充分溶解，得到聚乳酸-羟基乙酸溶液；
[0012]第四步:将第二步得到的壳聚糖溶液和第三步得到的聚乳酸-羟基乙酸溶液混合，磁力搅拌，得到混合溶液，在搅拌条件下，将S12-DOX粉末加入到所述的混合溶液中，先超声分散，再继续磁力搅拌，使S12-DOX分散于所述的混合溶液中；
[0013]第五步:将第四步得到的混合溶液进行静电纺丝，得到PLGA/CS/Si02-D0X静电纺复合纳米纤维载药体系。
[0014]优选地，所述的第一步中的氨水的浓度为25% -28%，氨水和无水乙醇的体积比为1: 15-25,阿霉素与无水乙醇和氨水的混合溶液的重量体积比为Img: 4_16mL。
[0015]优选地，所述的第二步中的搅拌速度为300-500rpm，搅拌时间为10_24h。
[0016]优选地，所述的第二步中的壳聚糖的终浓度为l_4g: 100mL。
[0017]优选地，所述的第三步中的聚乳酸-羟基乙酸溶液的终浓度为10_20g: 100mL。
[0018]优选地，所述的第三步得到的聚乳酸-羟基乙酸溶液与第二步得到的壳聚糖溶液的体积比为9: 1-7: 3。
[0019]优选地，所述的S12-DOX粉末与聚乳酸-羟基乙酸溶液与壳聚糖溶液的混合溶液的比例为 50-150mg: 10mL。
[0020]优选地，所述的第四步中的超声分散的时间为5_15min，磁力搅拌时间为4_8h。
[0021]优选地，所述的第五步中的静电纺丝的工艺条件为:电压为15_25kV，流速为0.5-lmL/h，接收距离为 10-20cm。
[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0023](I)本发明方法简单，反应条件温和，原材料易得；
[0024](2)本发明制备的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜具有良好的生物相容性以及很好的药物持续释放效果，抗癌活性高，可作为纳米纤维载药系统，应用于生物医学领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是实施例1所得产物的PLGA纳米纤维SEM图(a)及其纤维直径分布图(b)，制备的PLGA/CS纳米纤维SEM图(c)及其纤维直径分布图(d)；
[0026]图2是实施例1所得产物的S12-DOX纳米粒子TEM图(a)，PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维TEM图(b)，PLGA/CS/D0X纳米纤维荧光显微镜图(c)和PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维荧光显微镜图(d)；
[0027]图3是实施例1所得产物的S12-DOX纳米粒子、PLGA/CS/DOX、PLGA/S12-DOX和PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维膜在pH为7.4的药物释放动力学曲线；
[0028]图4是实施例1所得产物的PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维膜的体外抗癌活性评价结果。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0030]实施例1
[0031](I) S12-DOX纳米粒子合成步骤如下:将1mg DOX分散于75mL无水乙醇和3.4mL氨水(25% )的混合溶液中，以600rpm的搅拌速度磁力搅拌0.5h。然后,0.08mL正娃酸乙酯快速加入到以上溶液中，继续以600rpm的搅拌速度搅拌24h。离心分离得沉淀，用去离子水洗涤，冷冻干燥得S12-DOX纳米粒子粉末；
[0032](2)将壳聚糖(CS，分子量为32000-128000，脱乙酰化为75-85% )溶于三氟乙酸(TFA)中，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌24h使其充分溶解得到终浓度为4g/100mL的壳聚糖溶液；
[0033](3)将聚乳酸-羟基乙酸PLGA(LA/GA = 75/25，分子量为IlOkDa)加入到HFIP有机溶剂中，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌8h使其充分溶解，得到终浓度为20g/100mL的PLGA溶液；
[0034](4)将聚乳酸-羟基乙酸溶液和壳聚糖溶液以9: I体积比混合，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌lh，得到PLGA/CS混合溶液，在搅拌条件下，将20mg S12-DOX粉末加入到4mLPLGA/CS混合溶液中，先超声分散15min，再继续磁力搅拌4h，使S12-DOX充分分散于PLGA和CS的混合溶液中；
[0035](5)将步骤(4)得到的混合溶液按常规静电纺丝的方法制备纳米纤维膜，其中，电压为20kV，流速为0.5mL/h，接收距离为15cm，制备的静电纺复合纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥48h以上，以除去残留的有机溶剂，得到PLGA/CS/Si02_D0X静电纺复合纳米纤维载药体系。
[0036]作为对比，分别以步骤(3)和步骤(4)中得到的PLGA和PLGA/CS混合溶液按步骤
(5)的静电纺丝方法制备PLGA、PLGA/CS纳米纤维膜；
[0037]作为对比，将步骤(4)中的S12-DOX替换为纯D0X，使纯DOX充分分散于PLGA/CS混合溶液中，再按步骤(5)的方法制备PLGA/CS/DOX纳米纤维膜；
[0038]作为对比，在步骤(4)中聚乳酸-羟基乙酸溶液不与壳聚糖溶液混合，直接将S12-DOX分散于PLGA溶液，再按步骤(5)的方法制备PLGA/Si02_D0X纳米纤维膜。
[0039]SEM观察结果显示，所得到的PLGA和PLGA/CS纳米纤维表面规整、形貌规则，纤维直径分别为633± 119nm和703± 116nm(见附图1)。通过比较两种纤维直径可知，加入一定量的壳聚糖，所得的纳米纤维直径有所增加，主要原因可能是壳聚糖的加入增加了纺丝液的粘度所致。TEM图可以看出，制备的S12-DOX纳米粒子呈球形，平均粒径为80nm，S12-DOX能够均匀分布于PLGA/CS纳米纤维内部(见附图2)。荧光显微镜结果显示，与PLGA/CS/DOX相比，PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维出现少量红色荧光亮点，这是由于S12-DOX纳米粒子聚集在纤维局部产生的，说明大部分S12-DOX纳米粒子均匀分布于PLGA/CS纳米纤维内部(见附图2)。附图3为DOX从PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维膜在pH 7.4条件下的释放动力学结果。通过与PLGA/CS/DOX、PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维膜和S12-DOX纳米粒子比较发现:PLGA/CS/D0X和S12-DOX的药物释放较快，在24h达到30% ；PLGA/S12-DOX的药物释放缓慢，在300h内仅仅只有31.6%。而PLGA/CS/S12-DOX既没有出现药物的突释，也没有药物释放过缓。主要原因是S12-DOX成功封装到在PLGA/CS纤维内部，S12和PLGA作为DOX的双重载体共同起作用，进一步延缓了 DOX的释放速度。另外，壳聚糖的加入增加了复合纤维的亲水性，促进了药物分子的扩散释放.PLGA/Si02-D0X纳米纤维膜的HeLa细胞成活率(MTT实验)结果如附图4所示，并与相同DOX浓度时PLGA/S12-DOX、PLGA/CS/DOX、S12-DOX和纯DOX进行了对比。当各材料的DOX浓度达到10 μ g/mL时，所有材料均表现出抗癌活性。制备的PLGA/Si02_D0X纳米纤维表现较弱的抗癌活性，这是由于DOX从PLGA/S12-DOX纳米纤维中的释放速度较慢的缘故。而制备的PLGA/CS/S12-DOX与PLGA/CS/DOX和S12-DOX表现出相当的抗癌活性，说明DOX能够适量从PLGA/CS/S12-DOX纳米纤维中释放出来，达到有效的抗癌效果。
[0040]实施例2
[0041](I)S12-DOX纳米粒子的合成步骤如下:将1mg DOX分散于75mL无水乙醇和3.4mL氨水(25% )的混合溶液中，以600rpm的搅拌速度磁力搅拌0.5h。然后，0.08mL正硅酸乙酯快速加入到以上溶液中，继续以600rpm的搅拌速度搅拌24h。离心分离得沉淀，用去离子水洗涤，冷冻干燥得S12-DOX纳米粒子粉末；
[0042](2)将壳聚糖(CS，分子量为32000-128000，脱乙酰化为75-85% )溶于三氟乙酸(TFA)中，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌24h使其充分溶解得到终浓度为2g/100mL的壳聚糖溶液；
[0043](3)将聚乳酸-羟基乙酸PLGA(LA/GA = 75/25，分子量为IlOkDa)加入到TFA有机溶剂中，以(500rpm)的搅拌速度磁力搅拌8h使其充分溶解，得到终浓度为20g/100mL的PLGA溶液；
[0044](4)将聚乳酸-羟基乙酸溶液和壳聚糖溶液以8: 2体积比混合，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌lh，得到混合溶液，在搅拌条件下，将40mg S12-DOX粉末加入到4mL混合溶液中，先超声分散15min，再继续磁力搅拌4h，使S12-DOX充分分散于PLGA和CS的混合溶液中；
[0045](5)将步骤(4)得到的混合溶液按常规静电纺丝的方法制备纳米纤维膜，其中，电压为20kV，流速为0.5mL/h，接收距离为15cm，制备的静电纺复合纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥48h以上，以除去残留的有机溶剂，得到PLGA/CS/Si02_D0X静电纺复合纳米纤维载药体系。
[0046]实施例3
[0047](I)S12-DOX纳米粒子的合成步骤如下:将1mg DOX分散于75mL无水乙醇和3.4mL氨水(25% )的混合溶液中，以600rpm的搅拌速度磁力搅拌0.5h。然后，0.08mL正硅酸乙酯快速加入到以上溶液中，继续以600rpm的搅拌速度搅拌24h。离心分离得沉淀，用去离子水洗涤，冷冻干燥得S12-DOX纳米粒子粉末；
[0048](2)将壳聚糖(CS，分子量为32000-128000，脱乙酰化为75-85% )溶于三氟乙酸(TFA)中，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌24h使其充分溶解得到终浓度为lg/100mL的壳聚糖溶液；
[0049](3)将聚乳酸-羟基乙酸PLGA (LA/GA = 75/25，分子量为IlOkDa)加入到TFA有机溶剂中，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌8h使其充分溶解，得到终浓度为20g/100mL的PLGA溶液；
[0050](4)将聚乳酸-羟基乙酸溶液和壳聚糖溶液以7: 3体积比混合，以500rpm的搅拌速度磁力搅拌lh，得到混合溶液，在搅拌条件下，将60mg S12-DOX粉末加入到4mL混合溶液中，先超声分散15min，再继续磁力搅拌4h，使S12-DOX充分分散于PLGA和CS的混合溶液中；
[0051](5)将步骤(4)得到的混合溶液按常规静电纺丝的方法制备纳米纤维膜，其中，电压为20kV，流速为0.5mL/h，接收距离为15cm，制备的静电纺复合纳米纤维膜在真空干燥箱中干燥48h以上，以除去残留的有机溶剂，得到PLGA/CS/Si02_D0X静电纺复合纳米纤维载药体系。
【权利要求】
1.一种复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，具体步骤包括: 第一步:将阿霉素分散于无水乙醇和氨水的混合溶液中，磁力搅拌0.5-lh，然后加入正硅酸乙酯，继续搅拌4-24h，离心分离得沉淀，用去离子水洗涤，冷冻干燥得S12-DOX纳米粒子粉末； 第二步:将壳聚糖溶于三氟乙酸中，磁力搅拌使其充分溶解得到壳聚糖溶液； 第三步:将聚乳酸-羟基乙酸加入到三氟乙酸、六氟异丙醇、或四氢呋喃和二甲基甲酰胺的混合液中，磁力搅拌8-12h使其充分溶解，得到聚乳酸-羟基乙酸溶液； 第四步:将第二步得到的壳聚糖溶液和第三步得到的聚乳酸-羟基乙酸溶液混合，磁力搅拌，得到混合溶液，在搅拌条件下，将S12-DOX粉末加入到所述的混合溶液中，先超声分散,再继续磁力搅拌,使S12-DOX分散于所述的混合溶液中； 第五步:将第四步得到的混合溶液进行静电纺丝，得到PLGA/CS/Si02_D0X静电纺复合纳米纤维载药体系。
2.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第一步中的氨水的浓度为25%-28%，氨水和无水乙醇的体积比为1: 15-25，阿霉素与无水乙醇和氨水的混合溶液的重量体积比为Img: 4-16mL.
3.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第二步中的搅拌速度为300-500rpm，搅拌时间为10_24h。
4.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第二步中的壳聚糖的终浓度为l_4g: 100mL。
5.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第三步中的聚乳酸-羟基乙酸溶液的终浓度为10_20g: 100mL。
6.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第三步得到的聚乳酸-羟基乙酸溶液与第二步得到的壳聚糖溶液的体积比为9:1-7: 3。
7.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的S i O2 -D OX粉末与聚乳酸-羟基乙酸溶液与壳聚糖溶液的混合溶液的比例为50_150mg: 10mL。
8.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第四步中的超声分散的时间为5-15min，磁力搅拌时间为4_8h。
9.如权利要求1所述的复合硅基载药纳米粒子的纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述的第五步中的静电纺丝的工艺条件为:电压为15-25kV，流速为0.5-lmL/h，接收距离为 10_20cm。
【文档编号】D04H1/728GK104452106SQ201410668093
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】何创龙, 周小军, 仇可新, 冯炜, 王伟忠, 莫秀梅 申请人:东华大学