专利名称：胆甾化壳聚糖纳米载体及其载药纳米粒子和制造方法
技术领域：
本发明涉及一种选择性胆留化壳聚糖纳米载体及其载药纳米粒子和制造方法。
背景技术：
作为新型药物输送和控缓释载体，可生物降解聚合物的纳米粒子，特别是基于多 糖的纳米粒子，因其具有良好的生物相容性、超微尺寸、合理的体内分布和高效的药物利用 率，近年来日益受到广泛关注。可生物降解聚合物纳米粒子不仅可增强药物的稳定性、提高 疗效、降低毒副作用，而且由于EPR效应(Enhanced Permeability and Retention Effect) 能在肿瘤病变部位富集，实现对肿瘤组织的“被动靶向”，是包埋抗癌药物、多肽、蛋白质、核 酸、疫苗和基因的理想载体。壳聚糖(chitosan，CS)是一类由2_氨基_2_脱氧_D_葡萄糖通过0 -1，4糖甙键 连接而成的带正电荷的直链共聚物，是天然多糖中唯一的碱性多糖，来源丰富，其年产量仅 次于纤维素。壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性和无毒性等特点，已被 广泛应用于生物、医药、化工、食品、纺织、农业等领域。然而，由于壳聚糖的结晶性较高，溶 解性较差，仅能溶于稀酸性水溶液和特殊的含卤素的有机溶剂中，大大限制了壳聚糖的应 用。因此，对壳聚糖进行化学改性，提高其溶解性，扩大其应用领域是壳聚糖研究的一个重 要方向。由于壳聚糖分子中含有羟基、氨基等功能基团，因此，在适当条件下可对其进行多 种化学修饰，如酰基化、羧甲基化、烷基化、酯化、醚化、交联和接枝共聚等反应。近年来，由化学改性的两亲性壳聚糖制备纳米粒子受到人们的广泛关注。目前，大 部分研究集中于壳聚糖氨基的修饰改性以及该类衍生物纳米粒子的制备和应用方面(Liu CG，et al J. Agric. Food Chem. ,2005,53 :437_441)，而有关对其羟基进行化学改性的壳聚 糖衍生物制备纳米粒子的研究报道则较少。壳聚糖的游离氨基具有重要的生物学特性和 阳离子聚合物特点(Liu L，et al :Carbohyd. Polym.，2005，60 :351_356)，保留壳聚糖的游 离氨基可进行进一步的化学修饰或交联；胆留醇作为生物内源性物质，对于维持正常的细 胞功能和新陈代谢起了重要作用，是体内多种激素合成不可缺少的重要原料。迄今为止，对 壳聚糖进行选择性胆留化，并制备该壳聚糖衍生物纳米粒子作为药物载体的研究尚未见报 道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性胆留化壳聚糖纳米载体及其载药纳米粒子和 制造方法。由本发明方法制备的纳米载体，可增强药物的靶向性和稳定性、提高药物缓释 性、降低药物的毒副作用，且其制备过程简单、价廉易得，克服了现有载体的一些不足。本发 明制备的选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子，载药量高，缓释性能好，既提高了药物的溶解 性，又降低了药物在体内的毒副作用，是一种较好的药物载体材料。本发明提供一种选择性胆留化壳聚糖纳米载体是以胆留醇、琥珀酸酐和邻苯二甲 酸酐、壳聚糖为原料，制备出胆留醇琥珀酸酯(CHS)和邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)，二者再进行反应制备，粒径为100 200nm，胆甾醇/琥珀酸酐的摩尔比为1 30 3 90 ；壳聚 糖/邻苯二甲酸酐的摩尔比为1 60 3 180。本发明提供一种选择性胆留化壳聚糖纳米载体的制备方法包括的步骤1)胆甾醇琥珀酸酯(CHS)的合成将胆甾醇与琥珀酸酐溶解于吡啶中，反应液于 室温下搅拌反应48 96h，倾入冰盐酸溶液，过滤，于乙酸乙酯/乙醇体系重结晶，其中，胆 甾醇/琥珀酸酐的摩尔比为1 3，盐酸/冰水的体积比为1 10 20，乙酸乙酯/乙醇 体积比为1 0. 5 1。2)邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)与胆留醇琥珀酸酯(CHS)接枝共聚物的合成将 壳聚糖与邻苯二甲酸酐分散于N，N’ - 二甲基甲酰亚胺(DMF)或二甲基亚砜(DMS0)，氮气 保护下100 120°C反应7 8h，即得PHCS ；将CHS与PHCS溶解于DMF或DMS0，在N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)与碳二亚胺类活化剂作用下反应48 96h，其中，壳聚糖/邻苯二甲 酸酐的摩尔比为1 3，PHCS/CHS的摩尔比为10 1 5，CHS/NHS/碳二亚胺的摩尔比为 1 1 1. 5 1 1. 5。所述壳聚糖的分子量为50000 200000，脱乙酰度为70 99%。所述碳二亚胺类活化剂选自1-乙基_(3_甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 (EDC HC1)、N，N，- 二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N，- 二异丙基碳二亚胺(DIC)。所述胆甾醇琥珀酸酯(CHS)可以用胆酸、脱氧胆酸、5 去羟基胆酸、亚油酸、亚 麻酸、硬脂酸、十六酸、磺酰脲衍生物等替换。3)脱邻苯二甲酰化反应将PHCS-CHS接枝共聚物分散于DMF或DMS0，加入水合 胼，氮气保护下90 100°C反应1 7h，即得选择性胆留化壳聚糖衍生物(0-CHCS)。所述DMF或DMS0与水合胼体积比为1 5 10。本发明提供的一种选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子是以选择性胆留化壳聚糖 为载体负载抗肿瘤药物构成，抗肿瘤药物与载体的质量比为1 2 20，抗肿瘤药物为全反 式维甲酸、表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤或喜树碱。本发明提供的一种选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子的制备方法包括的步骤将 0-CHCS加入0. 1 0. 2mol/L的乙酸溶液中溶解，溶液于生理盐水或蒸馏水中透析6 48h， 经0. 22 0. 8 y m滤膜过滤，即得0-CHCS空白纳米粒子；抗肿瘤药物(全反式维甲酸，ATRA) 的DMS0或DMF溶液于冰水浴超声中加入空白纳米粒子溶液，透析6 12h，即得选择性胆 甾化壳聚糖载药纳米粒子，其中，抗肿瘤药物(ATRA)与0-CHCS纳米粒的质量比为1 2 20，载药量最高可达28%。所述0-CHCS/乙酸溶液的质量体积比为5 40mg/lmL。所述透析袋截留分子量为8000 14000Da。所述全反式维甲酸(ATRA)可以用表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、甲氨蝶 呤、喜树碱等抗肿瘤药物替换。本发明制备的选择性胆留化壳聚糖可生物降解、生物活性高、具有两亲性，既保留 了壳聚糖的游离氨基，又保持了壳聚糖特殊的生物学特性及阳离子多糖特性，并可继续进 行修饰化的接枝反应；本发明利用生物内源性物质胆留醇对壳聚糖进行选择性衍生化，其 产物具有良好的生物相容性、无毒性及体内代谢特性；本发明制备的壳聚糖衍生物在水中 可自聚集形成纳米粒子，其制备工艺简单，条件温和，且制备成本低，性质稳定，适合大规模
4 将胆甾醇2g与琥珀酸酐1. 6g溶于12mL吡啶，40 50°C搅拌反应72h，反应液于 冰盐酸溶液中析出，过滤，沉淀用蒸馏水洗至中性，于乙酸乙酯/乙醇体系重结晶，干燥得 胆甾醇琥珀酸酯(CHS)；称取壳聚糖0. 5g与邻苯二甲酸酐1. 33g分散于10mL DMF (含水 5%, mL/mL)，氮气保护下120°C反应8h，将反应液倾入冰水，过滤，用甲醇洗涤沉淀，45°C真 空干燥得邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)；称取CHS 0. 5g、PHCS 1. 12g及一定量的EDC *HC1与 NHS溶于50mL DMF中，室温搅拌反应72h，过滤，产物经乙醚、甲醇洗涤纯化，即得PHCS-CHS 接枝共聚物；将PHCS-CHS接枝共聚物0. 4g分散于4mL DMF中，再加入一定量的水合胼，氮 气保护下90°C反应7h，抽滤，分别用蒸馏水、乙醇洗涤产物，45°C真空干燥得选择性胆甾化 壳聚糖衍生物(0-CHCS)。
生产；本发明制备的选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子，载药量高，缓释性能好，既提高了 药物的溶解性，又降低了药物在体内的毒副作用，是一种较好的药物载体材料。
图1为选择性胆甾化壳聚糖空白纳米粒子的透射电镜照片。
具体实施例方式实施例1 选择性胆留化壳聚糖的制备其合成路线为
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5
通过具有良好溶解性的邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)为中间体，将胆甾醇琥珀酸 酯(CHS)选择性接枝到壳聚糖上，再脱去邻苯二甲酰亚胺保护基，游离出氨基，既对壳聚糖 进行选择性疏水改性，又保留了壳聚糖的游离氨基。实施例2 选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子的制备称取20mg的0-CHCS溶解于0. lmol/L的乙酸溶液，溶液转入透析袋，于生理盐水 中透析24h (前3h每lh换一次水，以后每3h换一次)，定容，用0. 45 y m滤膜过滤得0-CHCS 空白纳米粒子；将0.8mL全反式维甲酸(ATRA) 二甲基亚砜溶液(5mg/mL)在冰水浴超声下 加入空白纳米粒子溶液中，冰水浴探头超声处理3次(每次2min，输出功率50W，脉冲宽度 为2s，间歇时间为2s)，溶液于生理盐水或蒸馏水中透析9h(前3h每lh换一次水，以后每 3h换一次)，定容，即得0-CHCS载药纳米粒子。制备的选择性胆留化壳聚糖是一种两亲性化合物，由亲水多糖骨架和疏水性胆甾 醇基支链组成，在水介质中可自聚集形成具有核_壳型结构的纳米粒子(见图1)。制备的纳 米粒子呈规则的球形，粒径为100 200nm，(电位为+25. 6mV，具有较低的临界胶束浓度， 在生理液态环境中具有良好的稳定性；制备的载药纳米粒子载药量最高可达28%，包封率 可达88%，在72h内最大释放量大约为60%，对ATRA具有缓释作用，可作为疏水性药物或 DNA的载体。
权利要求
一种选择性胆甾化壳聚糖纳米载体，其特征在于它是以胆甾醇、琥珀酸酐和邻苯二甲酸酐、壳聚糖为原料，制备出胆甾醇琥珀酸酯和邻苯二甲酰化壳聚糖，二者再进行反应制备，粒径为100～200nm，胆甾醇/琥珀酸酐的摩尔比为1～30∶3～90；壳聚糖/邻苯二甲酸酐的摩尔比为1～60∶3～180。
2.一种选择性胆留化壳聚糖纳米载体的制备方法，其特征在于它包括的步骤1)将胆留醇与琥珀酸酐溶解于吡啶中，反应液于室温下搅拌反应48 96h，倾入冰盐 酸溶液，过滤，于乙酸乙酯/乙醇体系重结晶，其中，胆甾醇/琥珀酸酐的摩尔比为1 3，盐 酸/冰水的体积比为1 10 20，乙酸乙酯/乙醇体积比为1 0. 5 1。2)将壳聚糖与邻苯二甲酸酐分散于N，N’-二甲基甲酰亚胺或二甲基亚砜，氮气保护下 100 120°C反应7 8h，即得邻苯二甲酰化壳聚糖；3)将邻苯二甲酰化壳聚糖与胆留醇琥珀酸酯溶解在N，N’- 二甲基甲酰亚胺或二甲 基亚砜中，在N-羟基琥珀酰亚胺与碳二亚胺类活化剂作用下反应48 96h，其中，壳聚 糖/邻苯二甲酸酐的摩尔比为1 3，邻苯二甲酰化壳聚糖与胆留醇琥珀酸酯的摩尔比为 10 1 5，胆甾醇琥珀酸酯/N-羟基琥珀酰亚胺/碳二亚胺的摩尔比为1 1 1.5 1 1. 5 ；4)将邻苯二甲酰化壳聚糖与胆留醇琥珀酸酯接枝共聚物分散于N，N’- 二甲基甲酰亚 胺或二甲基亚砜中，加入水合胼，氮气保护下90 100°C反应1 7h，即得选择性胆留化壳 聚糖衍生物；所述的N，N’_ 二甲基甲酰亚胺或二甲基亚砜与水合胼体积比为1 5 10。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖的分子量为50000 200000，脱乙酰度为70 99%。
4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的碳二亚胺类活化剂选自1_乙 基-(3-甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC · HCl)、N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC) 或N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)。1
5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述胆留醇琥珀酸酯可以用胆酸、脱 氧胆酸、5 β -去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、十六酸或磺酰脲衍生物替换。
6.一种选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子，其特征在于它是以选择性胆留化壳聚糖为 载体负载抗肿瘤药物构成，抗肿瘤药物与载体的质量比为1 2 20;抗肿瘤药物为全反 式维甲酸、表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤或喜树碱。
7.权利要求6所述的载药纳米粒子的制备方法，其特征在于它包括的步骤1)将胆留化壳聚糖衍生物加入0.1 0. 2mol/L的乙酸溶液中溶解，溶液于生理盐水或 蒸馏水中透析6 48h，经0. 22 0. 8 μ m滤膜过滤，即得胆留化壳聚糖衍生物空白纳米粒 子；2)抗肿瘤药物的DMSO或DMF溶液于冰水浴超声中加入上述的空白纳米粒子溶液，透析 6 12h，即得选择性胆留化壳聚糖载药纳米粒子。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的胆留化壳聚糖衍生物/乙酸溶 液的质量体积比为5 40mg/lmL。
9.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的透析袋截留分子量为8000 14000Dao
全文摘要
本发明涉及一种选择性胆甾醇化壳聚糖纳米粒子及其制备方法。它是以胆甾醇、琥珀酸酐和邻苯二甲酸酐、壳聚糖为原料，制备出胆甾醇琥珀酸酯(CHS)和邻苯二甲酰化壳聚糖(PHCS)，二者再进行反应制备，粒径为100～200nm，胆甾醇/琥珀酸酐的摩尔比为1～30∶3～90；壳聚糖/邻苯二甲酸酐的摩尔比为1～60∶3～180。本发明得到两亲性的聚合物，由亲水多糖骨架和疏水胆甾醇支链组成，在水介质中可自聚集形成具有核-壳型结构的纳米粒子，带正电荷，有利于疏水药物、蛋白及DNA的包载，制备方法简单，重现性好，易于工业化生产，且载药率高，具有良好的缓释效果。
文档编号C08B37/08GK101850122SQ20101017896
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者刘*, 刘玲蓉, 张其清, 李学敏, 杨文智, 陈名懋 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所