本发明涉及一种雨生红球藻固体分散体、其制备方法和用途。
技术背景
雨生红球藻(haematococcusagardh)是一种淡水产的单细胞绿藻，富含类胡萝卜素、蛋白质、不溶性膳食纤维、维生素b2、维生素b12、烟酸、钙、镁、锌等营养成分，是维生素b1、维生素b6的来源。另外，在生长过程中，受极端环境影响(如氨缺乏、强光照、温度剧烈变化等不适宜条件)，藻体会由运动的营养细胞转变为厚壁的静孢子，同时大量积累红色的虾青素，被誉为天然虾青素的“来源”、“浓缩品”。
虾青素(astaxanthin)，又称“虾黄素”，是一种类胡萝卜素。化学名称：3，3"-二羟基-4，4"-二酮基-β-胡萝卜素，分子式c40h52o4。天然虾青素是迄今为止自然界发现抗氧化活性最强的化合物之一，其抗氧化活性是维生素的550倍、类胡萝卜素的10倍，被誉为“超级抗氧化剂”，对人体绝对安全。动物和临床试验研究证明，虾青素有增强免疫功能、缓解运动疲劳、抑制肿瘤发生、预防心血管疾病、防止皮肤衰老、保护眼睛及中枢神经系统等多种生理功能。除此之外，虾青素在缓解关节疼痛、预防老年痴呆等方面具有令人满意的效果。
雨生红球藻是继螺旋藻、盐藻之后的另一种经济微藻，近年来已成为国内外健康产业研发热点之一。在美国，雨生红球藻粉已经获得了fda的批准，允许作为新的膳食成分进入保健品市场；日本也被批准将其应用于食品和饲料行业；欧盟也已有相关产品注册。中国国家卫计委(原卫生部)于2010年10月批准雨生红球藻作为新资源食品(公告号：2010年第17号)，从此掀起国内系统研究、开发、应用雨生红球藻的热潮。截止目前，国内已形成雨生红球藻养殖、采收、提取、深加工、产品研发生产为一体的产业链，以雨生红球藻及其提取物为原料的食品、保健食品已被国家食品药品监督管理总局陆续批准上市，取得了较好的社会效益和经济效益。
纵观国内外雨生红球藻产业研发应用现状，至少存在以下技术瓶颈：
(1)雨生红球藻在含有特定功能性成分--虾青素的同时，还富含人体所必须的多种营养成分。而目前人工养殖雨生红球藻主要作为天然虾青素的获取来源，对其全面、丰富的营养成分研究和应用不足，造成极大资源浪费；
(2)虾青素并非雨生红球藻固有，而是生长过程受外界环境(温度、光照等)剧烈变化，通过应激反应而产生的次生代谢产物。虾青素含量高低与雨生红球藻生长过程应激反应程度密切相关。而目前国内雨生红球藻养殖应激产生虾青素的工艺并不成熟，其含量处于不可控状态；
(3)虾青素由于本身的超强抗氧化性，理化性质非常不稳定，受温度、光照影响极易氧化衰竭。未破壁的雨生红球藻(粉)中虾青素以游离、单酯、双酯、多酯等多种形式存在于厚壁孢子中而保持相对稳定，但很难被提取、开发、应用，使用价值极低；经破壁处理后的雨生红球藻(粉)及其提取物，增大了虾青素与外界接触机会，若处理、包装、保存不当，虾青素可在处理过程中或运输、保存过程中快速氧化衰竭(一般数天或数周衰竭殆尽)，使其开发、应用受到极大限制；
(4)虾青素作为脂溶性β-胡萝卜素，直接食用很难被吸收利用，生物利用度不高，需较大剂量(≥12mg/日)方可显现保健功能。资源有效使用率较低，造成资源使用浪费。
技术实现要素：
本发明旨在解决目前雨生红球藻产业存在的技术瓶颈，提供一种全面使用雨生红球藻营养及功能成分(虾青素)、在普通包装及常温保存条件下显著提高虾青素稳定性、食用后显著提高虾青素生物利用度、大幅度提高抗氧化活性、降低食用剂量的雨生红球藻固体分散体及其制备方法和在药品、保健食品、食品领域的应用。从而进一步开发、拓展、提升雨生红球藻及其虾青素的使用领域和应用价值。
本发明的第一目的是提供一种全面应用雨生红球藻营养及功能成分(虾青素)、显著提高虾青素稳定性和生物利用度、大幅提高抗氧化活性、降低使用剂量的雨生红球藻固体分散体。
本发明的第二目的是提供上述雨生红球藻固体分散体的制备方法。
本发明的第三目的是提供上述方法制备的雨生红球藻固体分散体在药品、保健食品、食品领域的用途。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种雨生红球藻固体分散体。所述雨生红球藻固体分散体由破壁雨生红球藻经co2超临界抽提后的干燥藻渣、雨生红球藻co2超临界抽提物经包合和微囊化制备的包合微囊粉、固体分散载体三相组成。其中，干燥藻渣、包合微囊粉、固体分散载体三者质量比(w/w)为348～408:180～240:12；优选为368～388:200～220:12；更优选为375:213:12。
另一方面，本发明提供了上述雨生红球藻固体分散体的制备方法，所述方法包括雨生红球藻破壁、破壁雨生红球藻抽提、抽提后剩余藻渣干燥、抽提物包合微囊粉制备、包合微囊粉与干燥藻渣形成固体分散体等具体实施步骤。
步骤1雨生红球藻破壁
取人工养殖、采收的雨生红球藻新鲜藻泥(含固量18～25％、虾青素质量百分含量占干重≥3.0％)，脱水后置高压均质机中充分破壁。处理压力为：第一次30～40mpa，第二次80～90mpa，镜检或虾青素含量检测破壁率≥90％。
步骤2破壁雨生红球藻抽提
将已破壁的雨生红球藻移至co2超临界萃取设备(ha121-50-02型co2超临界萃取装置，江苏华安科研仪器有限公司)中充分萃取(温度60～80℃，压力35～45mpa，co2流速15～25l/h，萃取2～4小时)，收集抽提物。抽提物中虾青素转移率≥90％，虾青素的质量百分含量为7～17％，优选为9～15％，更优选为11～13％。
步骤3抽提后剩余藻渣干燥
取雨生红球藻经co2超临界抽提后的剩余藻渣，添加75～82％的去离子水充分搅拌混匀，通过管道缓慢进入喷雾干燥塔(温控≤180℃)进行喷雾干燥，收集干燥粉末(水分≤10.0％)(备注：所述干燥藻渣为co2超临界抽提后剩余物，无任何辅料添加)，即得。
步骤4抽提物包合微囊粉制备
称取雨生红球藻co2超临界抽提物，置带研磨搅拌的洁净容器中，按抽提物：辅料质量比(w/w)＝25:12～25添加药学可接受的辅料β-环糊精、明胶、聚维酮(pvp)、改性淀粉、维生素e、维生素c、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物、l-乳酸钙中的一种或几种，充分搅拌、乳化、研磨成糊状，低温干燥后，再用有机溶剂洗涤干净，干燥即得。虾青素的质量百分含量为6～8％。
脂溶性提取物与药学可接受辅料添加量质量比(w/w)为25:12～25、优选为25:15～21、更优选为25:17～19、最优选为25:18。
步骤5固体分散体制备
按包合微囊粉:干燥藻渣：固体分散载体质量比(w/w)＝180～240:348～408:12称取包合微囊粉、干燥藻渣和药学可接受的辅料聚维酮(pvp)、木糖醇、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、枸橼酸等中的一种或几种作为固体分散载体。先将称取的包合微囊粉和干燥藻渣置于带研磨搅拌的洁净容器中，添加95％乙醇(添加量为总质量20％)充分搅拌制成混悬液。再将称取好的固体分散载体用纯化水(用量为雨生红球藻固体分散体总质量的20％)溶解混悬后，搅拌下缓慢添加至上述混悬液中，充分搅拌乳化，低温抽去溶剂制成软才，挤压过20目筛，干燥，即得。
此外，本发明还提供了上述雨生红球藻固体分散体在药品、保健食品、功能性普通食品或其他食品方面的应用及用途。本发明所述雨生红球藻固体分散体可以直接使用，也可加入药学上可以接受的辅料制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂等多种口服固体制剂，还可作为原料与其他药品、食品原料形成组合物。用于制备抗氧化、增强免疫功能、缓解运动疲劳、抑制肿瘤发生、预防心脑血管疾病、防止皮肤衰老、保护眼睛和中枢神经系统的药物、保健食品、功能性普通食品或其他食品中的用途。
雨生红球藻由于自身富含人体所需多种营养成分，且在生长过程中受外界环境刺激会产生超级抗氧化剂-----虾青素，注定该生物具有特定营养和保健功能。作为开发应用雨生红球藻的专业技术，必须综合考虑其营养及保健功能价值，实现营养及功能成分的全面研究和应用最大化。本发明采用新鲜雨生红球藻，通过高压均质机破壁、co2超临界萃取等行业较为成熟的技术，先将雨生红球藻成功分离为营养成分(藻渣)与功能成分(提取物)两相，然后摒弃过去雨生红球藻产业通过抽提获取虾青素后将藻渣白白丢弃的做法，对提取物进行乳化、包合、微囊化技术处理，将脂溶性抽提物固体微囊化成与水混悬的包合微囊粉，显著提高虾青素稳定性和生物利用度后，再将其返回到提取后剩余藻渣中，形成与原雨生红球藻体系相似、但虾青素稳定性和生物利用度显著提高的固体分散体。为雨生红球藻更加系统、全面开发应用提供一种均一、稳定、可控的固体分散体，便于进一步推广应用。
与现有工艺技术比较，本发明具有以下突出优点和技术效果：
1)通过破壁、co2超临界萃取等技术将雨生红球藻分成提取相(功能成分)、藻渣相(营养成分)，然后对两相分别进行工艺技术处理后再合二为一，实现了营养和功能成分的全面、最大化研究应用。
2)成功破解了未破壁的雨生红球藻虾青素存在于厚壁孢子、无法提取应用、使用价值低，而破壁的雨生红球藻及其提取物、虾青素不稳定、保存运输和使用受限的技术瓶颈。在不改变雨生红球藻营养及功能成分构成体系的前提下，实现了破壁、虾青素稳定可控、常规包装保存等，开发应用前景更为广阔。
3)通过对脂溶性提取物(虾青素)乳化、包合、微囊化等前沿技术处理，取得如下显著进步和实质性技术效果：a、提高虾青素稳定性；b、增加脂溶性抽提物水溶性；c、使粘稠油状提取物固体微囊化；d、掩盖提取物藻腥味；e、有效控制包合微囊物中虾青素的释放；f、提高以虾青素为代表的脂溶性β-胡萝卜素生物利用度。
4)经辅料添加和包合微囊化技术处理的包合微囊粉，在固体分散载体作用下，以固体分散形式与藻渣形成均一、稳定、高度分散的固体分散体。进一步提高营养及功能成分(虾青素)溶解性能、提高溶出速率、从而进一步提高营养及功能成分(虾青素)的生物利用度。
5)经co2超临界萃取的雨生红球藻提取物，为深红色粘稠油状液体，富含7～17％的虾青素。该提取物作为药品、保健食品及食品生产加工原料，不存在溶剂残留问题，是目前雨生红球藻主流的开发应用方向，具有一定优势，但并未解决脂溶性虾青素稳定性差，直接食用吸收低，生物利用度不高的问题。本发明创造性地将雨生红球藻脂溶性油状提取物通过乳化、包合、微囊化，彻底阻隔了虾青素与外界接触的机会，同时将脂溶性油状物改性为能与水均一稳定混悬的包合微囊粉，彻底逆转了虾青素不稳定、直接食用生物利用度低的问题，进一步拓展了提取物开发应用空间。而将包合、微囊化的提取物以固体分散形式重新返回提取后藻渣，进一步提升营养及功能成分(虾青素)稳定性、释放速率及生物利用度的同时，实现营养及功能成分的全面应用，则是本发明创造性、新颖性所在。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来对本发明作进一步的说明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中，虾青素的含量采用以下方法来测定：
采用二甲基亚砜对样品中游离虾青素及虾青素脂进行提取，根据虾青素在二甲基亚砜中的特征吸光度来计算样品中总虾青素含量。
1)试剂
所用试剂均为分析纯试剂；虾青素标准品(sigmaa9335)：含量94～95％。
2)仪器
分光光度计(gbcuv/vis916可见紫外分光光度计，生产厂商澳大利亚gbc公司)；恒温水浴锅；离心机。
3)供试品溶液制备
取样品置研钵中充分研细。精密称取20mg置10ml离心管中，加二甲基亚砜5ml，振摇使样品分散均匀，置70℃恒温水浴中振摇提取10分钟，取出置离心机中5000转/分钟离心5分钟，收集上清液。重复上述提取操作2-3次，直到样品变成灰白色，合并提取液至25ml棕色容量瓶中，加二甲基亚砜定容至刻度，摇匀。精密量取1ml置10ml棕色容量瓶中，加二甲基亚砜定容至刻度，摇匀，即得。
4)标准品溶液制备
精密称取虾青素标准品5.0mg，置50ml棕色容量瓶中，加二甲基亚砜溶解并定容至刻度，摇匀。精密量取1ml置25ml容量瓶中，加二甲基亚砜定容至刻度，摇匀，即得。
5)测定方法
以二甲基亚砜为空白校正，用紫外分光光度计在530nm波长处分别测定供试品、标准品溶液吸光度值。
6)计算
根据供试品、标准品溶液吸光度值，计算样品中虾青素质量百分含量。
虾青素含量＝(m2×m×a1×250)/m1×a2×1250×100％
式中：m1：供试品取样量(mg)；m2：标准品取样量(mg)；m:标准品纯度(％)；a1：供试品溶液吸光度值；a2：标准品溶液吸光度值。
7)精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
实施例1：固体分散体1的制备
雨生红球藻分离：取人工养殖、采收的新鲜藻泥(含固量23％、虾青素质量百分含量占干重3.0％)，置高压均质机中充分破壁(处理压力为：第一次35mpa，第二次84mpa，镜检破壁率90％)。将已破壁的雨生红球藻移至co2超临界萃取设备(ha121-50-02型萃取装置，江苏华安科研仪器有限公司)中充分萃取(温度75℃，压力40mpa，co2流速25l/h)4h，收集抽提物。成功将雨生红球藻分离为抽提后剩余藻渣、脂溶性油状抽提物两相。经检测抽提物中虾青素转移率为90％，虾青素的质量百分含量为12.0％。
营养成分相(干燥藻渣)制备：取雨生红球藻经co2超临界抽提后的剩余藻渣，添加80％的去离子水充分搅拌混匀，通过管道缓慢进入喷雾干燥塔(温控170℃)进行喷雾干燥，收集干燥粉末，即得。经检测其水分为8.0％。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制备：称取雨生红球藻co2超临界抽提物，置带研磨搅拌的洁净容器中，按抽提物：辅料质量比(w/w)＝25:12添加脂溶性迷迭香提取物、明胶、β-环糊精、l-乳酸钙，充分搅拌、乳化、研磨成糊状，低温干燥后，再用乙酸乙酯洗涤干净，干燥即得。经检测虾青素质量百分含量为7.2％。
雨生红球藻固体分散体制备：按包合微囊粉:干燥藻渣：固体分散载体质量比(w/w/w)＝180:408:12称取包合微囊粉、干燥藻渣和聚维酮(pvp)。先将称取的包合微囊粉和干燥藻渣置于带研磨搅拌的洁净容器中，添加95％乙醇(添加量为总质量20％)充分搅拌制成混悬液。再将称取好的聚维酮(pvp)用纯化水(用量为雨生红球藻固体分散体总质量的20％)溶解混悬后，搅拌下缓慢添加至上述混悬液中，充分搅拌乳化，低温抽去溶剂制成软才，挤压过20目筛，干燥，即得。经检测虾青素含量2.1％。
附图说明：图1为雨生红球藻固体分散体制备工艺流程图
实施例2：固体分散体2的制备
雨生红球藻分离及营养成分相制备：同实施例1。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制备：称取实施例1制备的雨生红球藻co2超临界抽提物，置带研磨搅拌的洁净容器中，按抽提物：辅料质量比(w/w)＝25:18添加脂溶性迷迭香提取物、改性淀粉、明胶、β-环糊精，充分搅拌、乳化、研磨成糊状，低温干燥后，再用乙醇洗涤干净，干燥，即得。经检测虾青素含量为7.0％。
雨生红球藻固体分散体制备：按包合微囊粉:干燥藻渣：固体分散载体质量比(w/w/w)＝213:375:12称取包合微囊粉、干燥藻渣、聚维酮(pvp)+木糖醇。先将称取的包合微囊粉和干燥藻渣置于带研磨搅拌的洁净容器中，添加95％乙醇(添加量为总质量20％)充分搅拌制成混悬液。再将称取好的聚维酮(pvp)+木糖醇用纯化水(用量为雨生红球藻固体分散体总质量的20％)溶解混悬后，搅拌下缓慢添加至上述混悬液中，充分搅拌乳化，低温抽去溶剂制成软才，挤压过20目筛，干燥，即得。经检测，虾青素含量2.5％。
实施例3：固体分散体3的制备
雨生红球藻分离及营养成分相制备：同实施例1。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制备：称取实施例1制备的雨生红球藻co2超临界抽提物，置带研磨搅拌的洁净容器中，按抽提物：辅料质量比(w/w)＝25:25添加水溶性迷迭香提取物、明胶、β-环糊精、l-乳酸钙，充分搅拌、乳化、研磨成糊状，低温干燥后，再用乙醇洗涤干净，干燥，即得。经检测虾青素质量百分含量为6.0％。
雨生红球藻固体分散体制备：按包合微囊粉:干燥藻渣：固体分散载体质量比(w/w/w)＝240:348:12称取包合微囊粉、干燥藻渣和聚维酮(pvp)+甘露醇+山梨醇。先将称取的包合微囊粉和干燥藻渣置于带研磨搅拌的洁净容器中，添加95％乙醇(添加量为总质量20％)充分搅拌制成混悬液。再将称取好的聚维酮(pvp)+甘露醇+山梨醇用纯化水(用量为雨生红球藻固体分散体总质量的20％)溶解混悬后，搅拌下缓慢添加至上述混悬液中，充分搅拌乳化，低温抽去溶剂制成软才，挤压过20目筛，干燥，即得。经检测虾青素含量2.7％。
实施例4：组合物制备
取实施例2制备的雨生红球藻固体分散体，添加蓝莓果粉，粉碎过80目筛，制得抗氧化组合物。
实施例5：片剂的制备
取实施例2制得的雨生红球藻固体分散体，添加预胶化淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁少许，经湿法制粒、干燥、压片，制得用于抗氧化、增强免疫功能、缓解运动疲劳、抑制肿瘤发生、预防心脑血管疾病、防止皮肤衰老、保护眼睛和中枢神经系统的药物或保健食品。
实施例6：硬胶囊剂的制备
取实施例2制得的雨生红球藻固体分散体，添加处方量0.5％的硬脂酸镁混合均匀，经充填至胶囊内，制得硬胶囊剂。
实施例7：颗粒剂或丸剂的制备
取实施例2制备的雨生红球藻固体分散体，直接制成颗粒剂；或者添加维生素e、甘油、明胶少许，经制丸、烘干，得丸剂。
为了对本发明作进一步的说明，本发明选取实施例1所得的破壁雨生红球藻、co2超临界抽提物和实施例2制备的包合微囊粉作为对照样品，依次编号为1、2、3。选取实施例2所制备的雨生红球藻固体分散体为试验样品，编号为4。同步开展加速稳定性试验、生物利用度试验，抗氧化活性试验。并对结果进行比较，具体如下：
1.加速稳定性试验
考察指标确定：本发明所述的雨生红球藻固体分散体限制了其功能成分虾青素的含量限度，为充分验证加速试验条件下虾青素含量的稳定性，本试验选取各样品中虾青素的含量作为稳定性考察指标。
试验方案设计：分别取编号为1、2、3、4的试验样品各100g，置于洁净透明玻璃瓶中，按原料药物与制剂稳定性试验指导原则(《中国药典》2015版四部9001)，置温度为40℃士2℃、相对湿度75％士5％的条件下放置6个月，进行加速稳定性试验，分别于0天、3天、7天、14天、1个月、2个月、3个月、6个月取样，测定虾青素含量。测定结果见表1。
表1虾青素含量测定结果
表1看出：样品1在3天后虾青素含量出现明显下降、14天后衰竭了88％、1个月后虾青素衰竭殆尽；样品2虾青素含量在14天出现明显下降、3个月后衰竭了98.5％、6个月后虾青素衰竭殆尽；本发明所述的功能成分相(样品3)虾青素含量在3个月稳定、6个月内衰竭了4.8％；本发明所述的雨生红球藻固体分散体(样品4)虾青素含量在6个月内稳定，仅下降了2.3％。
试验结论：样品1、2的虾青素都非常不稳定，加速稳定性试验条件下较短时间即出现明显衰竭，在6个月内衰竭殆尽；样品3的虾青素相对稳定，具有一定开发应用前景，但仅限于功能成分-----虾青素的开发应用，资源浪费较大；样品4(本发明提供的雨生红球藻固体分散体)中的虾青素含量6个月内稳定，且未改变雨生红球藻营养及功能成分体系，开发应用前景广阔。
2.生物利用度试验
监测指标确定：以功能成分虾青素含量为监测指标，考察灌胃和静注给予各样品后被吸收进入血液的虾青素浓度，从而计算生物利用度。
试验方案设计：试验动物采用体重约3kg的健康家兔(由四川大学实验动物中心提供)，动物随机分为四组，每组6只。试验前预先禁食12h后，分别灌胃给予上述样品，剂量按虾青素折算为0.6mg/kg(相当于70kg成人日服用虾青素12mg)，给予样品后密集测定血浆中虾青素含量，至达峰时间后半小时，检测血药峰浓度(cmax)。试验样品灌胃结束后，停药一周，至动物体内样品完全代谢，然后静脉注射给予等剂量虾青素标准品溶液，并测定血浆中虾青素含量(μg/ml)，以此作为参比数据计算虾青素生物利用度，结果见表2。
表2：各样品中虾青素生物利用度检测结果
由表2看出：样品1、2中的虾青素生物利用度均在30％左右；样品3、4中虾青素生物利用度均提升至90％以上。样品3和样品4比较：样品4(即本发明所述雨生红球藻固体分散体)生物利用度更高。
试验结论：样品4中虾青素的生物利用度是样品1的3.1倍、样品2的3.13倍；样品3与样品4中虾青素的吸收利用度都在90％以上，两者比较样品4(即雨生红球藻固体分散体)生物利用度更高。
3.抗氧化活性试验
试验样品制备：取上述四个样品，分别用2％的亚硫酸钠溶液配置成含虾青素10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml三个浓度梯度的溶液，临用时新鲜配制。
实验动物：昆明种小鼠，雌雄兼用，体重25±4g，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号：沪动合证字152号。
主要试剂及仪器：四乙氧基丙烷(tep)：sigma公司产品；tba溶液：硫代巴比妥酸为上海试剂二厂产品，配制方法：取0.67g硫代巴比妥酸加100ml水在50℃水浴加热助溶5～10分钟；tca溶液：三氯乙酸为中国医药(集团)上海化学试剂公司生产，配制方法：取三氯乙酸30g加水150ml配制而成；752c紫外可见分光光度计：上海第三分析仪器厂；dk-8b电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；lxj-ii离心机：上海第三医疗仪器厂。
试验方案设计：设空白对照组(n＝32)和样品组(试验样品1～4)(含虾青素10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml组)，每组动物数为10～12只。参照常规方法，取正常小鼠肝组织用冷生理盐水制成10％组织匀浆。匀浆在冰浴条件下进行，每管加300μl，再加不同浓度试验样品，混匀，置37℃水浴温孵30分钟。取出后加10％三氯乙酸(tca)2.5ml和0.67％硫代巴比妥酸(tba)1ml，置沸水浴中30分钟，流水冷却至室温，加入正丁醇4.0ml振荡混匀后于3000rmp离心10分钟，取上清液于535nm比色测定。以标准的四乙氧基丙烷计算含量，以nmol/g组织湿重表示。实验数据用x±sd表示，studentttest进行显著性检验。结果见表3。
表3试验样品对小鼠肝匀浆mda含量的影响
*p<0.05，**p<0.01vs空白对照组
试验结论：表3看出，空白对照组mda含量为81±21nmol/g组织湿重；与空白对照比较，本发明所述的1～4号样品mda抑制率有统计学差异，表明1～4号样品(含不同浓度虾青素)均显示抗氧化活性。随虾青素浓度的增加，其抗氧化活性也随之增强；本发明所述的1、2号样品组内比较无统计学差异，表明虾青素浓度一致的前提下，1、2号样品抗氧化活性无明显差异；本发明所述的3、4号样品与1、2号样品组间比较存在统计学差异，表明在虾青素浓度一致的前提下，3、4号样品抗氧化活性明显强于1、2号样品；本发明所述的3、4号样品组内比较存在统计学差异，表明在虾青素浓度一致的前提下，4号样品抗氧化活性明显强于3号样品。