来氟米特或其活性代谢产物A771726在制备治疗2型糖尿病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及来氟米特及a771726的新用途，也涉及2型糖尿病药物的生产
技术领域：
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背景技术：
：2型糖尿病是由于长期营养过剩导致s6k1激酶持续性激活使胰岛素受体不敏感，导致糖代谢受阻引起血糖升高。近年来，由于生活水平升高，2型糖尿病的发病率显著呈直线上升的趋势，虽然目前有多种药物可用于治疗糖尿病，但由于后期对药物的敏感性以及部分病人对某些药物因为副作用导致的耐受性差的诸多问题，后期则必须使用胰岛素注射，价格昂贵且不易控制。s6k1在糖尿病的致病机理方面起关键性的作用，动物实验显示s6k1基因敲除小鼠能抵抗高能量饲料诱导的糖尿病和肥胖。然而通过抑制s6k1激酶降血糖的确切效果及作用机理尚不清楚。目前尚没有可用于临床的s6k1抑制物。来氟米特（leflunomide）在临床上是一种治疗风湿性关节炎的抗炎成品药，其副作用已研究清楚，易于防控。但，至今为止，人们还未发现来氟米特还有其它用途。技术实现要素：本发明目的是提出来氟米特或其活性代谢产物a771726的新用途。来氟米特可用于制备治疗2型糖尿病的口服制剂，也可用于制备治疗2型糖尿病的注射制剂。来氟米特的活性代谢产物a771726也可用于制备治疗2型糖尿病的口服制剂，或用于制备治疗2型糖尿病的注射制剂。来氟米特在临床上是一种治疗风湿性关节炎的抗炎成品药的应用表明其副作用已研究清楚，易于防控。经研案发现，来氟米特对2型糖尿病降血糖作用的机理是通过其活性代谢产物a771726来实现的，即氟米特的活性代谢产物a771726通过抑制s6k1反馈性激活pi-3信号通路，诱导akt磷酸化，从而达到降血糖的效果。可见来氟米特及其活性代谢产物a771726都是s6k1激酶抑制剂，能针对2型糖尿病的发病机理，有效地治疗2型糖尿病。本发明利用来氟米特或其活性代谢产物a771726开发用于治疗2型糖尿病方面的口服或注射制剂，可以减少成本，而且使用方便，具有很好的应用前景。另外，本发明还对来氟米特的另一个分子靶向——乳清酸脱氢酶进行了研究。乳清酸脱氢酶收到抑制后导致细胞内的嘧啶碱基单核苷酸的合成收到抑制。尿苷作为一个尿嘧啶合成的一个前体化合物，可被旁路途径利用合成尿苷。在细胞培养中添加尿苷，可以保持细胞内的胞嘧啶水平正常但不影响其降血糖效果。附图说明图1为各模型组小鼠的葡萄糖注射时间与血糖浓度变化关系对比图。图2为各模型组小鼠的的胰岛素耐受时间和血糖浓度的变化关系对比图。图3为各饲喂模型组小鼠的葡萄糖注射时间与血糖浓度变化关系对比图。图4为各饲喂模型组小鼠的胰岛素注射时间和血糖浓度关系对比图。图5为各处理组肌肉组织中akt磷酸化的免疫印迹图像对比图。图6为各处理组肌肉组织中akt磷酸化的灰度分析对比图。图7为各处理组肝脏组织中akt磷酸化的免疫印迹图像对比图。图8为各处理组肝脏组织中akt磷酸化的灰度分析对比图。图9为各处理组脂肪组织中akt磷酸化的免疫印迹图像对比图。图10为各处理组脂肪组织中akt磷酸化的灰度分析对比图。图11为a771726体外致敏3t3-l1脂肪细胞中胰岛素受体并增加血糖吸收对比图。图12为a771726体外致敏l6肌管纤维细胞中胰岛素受体并增加血糖吸收对比图。具体实施方式一、药品与试剂说明：来氟米特（leflunomide）和a771726由cinkatecorporation(oakpark,il)提供。来氟米特用于体内试验。雷帕霉素购自cellsignalingtechnology(danvers,ma)。cytochalasin和rosiglitazone购自calbiochem(emdmillipore,billerica,ma)。3-isobutyl-1-methylxanthine(ibmx)、羧甲基纤维素（cmc）、尿苷（uridine）、地塞米松（dexamethasone）和2-deoxy-glucose(2-dog)购自sigmaaldrich(st.louis,mo)。2-dog(5-10ci(185-370gbq)/mmol,1mci(37mbq)购自perkinelmer(waltham,ma)。体外用胰岛素购自invitrogen(lifetechnologies,grandisland,ny)。akt、akt、s6k1、s6、irs-1及其相关的akts473、aktt308磷酸化抗体购自cellsignalingtechnology(danvers,ma)。试验用雄性ob/ob小鼠（b6.v-lepob/olahsd）购自harlanlaboratories,inc。c2c12、l6和3t3-l1细胞均购自americantypeculturecollection(atcc,manassas,va)。二、以下各试验统计学分析说明：数据用平均数±标准差（sd）（葡萄糖吸收）或平均值标准误（sem）（血糖水平）表示。3t3-l1脂肪细胞和l6肌管细胞中不同组间葡萄糖吸收的差异用单样本学生t检验进行统计学分析。不同用药组间血糖和胰岛素水平的差异用重复测量方差分析(方差分析)分析。用药前后单个组之间的血糖水平差异用双样本学生t检验进行统计学分析（p值<0.05）。三、分析试验：1、血糖水平试验：选用8～10周龄雄性ob/ob小鼠分成四组，每组5～8只，建立四个模型组。第一组小鼠为对照组，对小鼠用浓度为1.5g/100ml的羧甲基纤维素（cmc）水溶液进行灌胃，每天灌胃一次，每次0.1ml。第二组小鼠为来氟米特试验组，按小鼠体重灌胃来氟米特35mg/kg，每天灌胃一次。第三组小鼠为尿苷试验组，按每公斤小鼠体重给予腹腔注射2g尿苷，每天两次。第四组小鼠为来氟米特和尿苷的混合试验组，按小鼠体重灌胃来氟米特35mg/kg，每天灌胃一次以外，还按每公斤小鼠体重给予腹腔注射2g尿苷，每天两次。各组分别按以上相应方法连续灌胃3天，然后经禁食6小时后用血糖仪测定小鼠空腹血糖水平，各试验组血糖控制结果见下表：各组ob/ob小鼠中的血糖控制结果组别给药前血糖（mg/dl）给药后血糖（mg/dl）p值第一组234±16252±220.697第二组275±12111±60.001第三组210±12253±150.153第四组222±1597±150.021上表数据显示：接受溶剂的cmc对照（第一组）和尿苷（第三组）的小鼠在用药前后血糖变化无显著差异。而来氟米特组（第二组）和来氟米特加尿苷（第四组）用药后血糖水平显著降低。2、葡萄糖耐受试验：按上例方法建立四个模型组。各组小鼠如上例方法灌胃3天后，在第4天继续按相应的方法灌胃，然后禁食6小时后进行葡萄糖耐受试验：按小鼠重量，腹腔注射葡萄糖1g/kg，然后在注射后的特定时间用拜耳血糖仪测定小鼠血糖。图1显示了以上各模型组小鼠的葡萄糖耐受试验结果，可见，来氟米特试验组以及来氟米特加尿苷混合试验组能显著降低ob/ob糖尿病小鼠的血糖水平，而尿苷试验组作用不大。3、胰岛素耐受试验：按上例方法建立四个模型组。各组小鼠如上例方法灌胃3天后，在第4天继续按相应的方法灌胃，然后禁食6小时后进行胰岛素耐受试验：按小鼠重量，静脉注射胰岛素2.5unit/kg，然后在特定时间测定小鼠血糖值。图2显示了以上各模型组小鼠的胰岛素耐受试验结果，可见：cmc对照组和尿苷试验组在注射胰岛素15min后血糖水平显著升高，而来氟米特试验组的小鼠血糖基本不变，来氟米特和尿苷混合试验组小鼠血糖略有增加。4、高脂肪诱导的糖尿病小鼠模型的葡萄糖耐受试验：将32只b57bl/6小鼠随机分成两组，每组16只。其中一组饲喂正常饲料8周，另一组高脂肪饲料饲喂8周。再将经过正常饲料饲喂8周后的小鼠随机分成对照组和来氟米特组两组，每组8只。将经过高脂肪饲料饲喂8周后的小鼠也随机分成对照组和来氟米特组两组，每组8只。对各对照组和来氟米特组分别按以下相应方法进行灌胃。对照组，对小鼠用浓度为1.5g/100ml的羧甲基纤维素（cmc）水溶液进行灌胃，每天灌胃一次，每次0.1ml。来氟米特组，按小鼠体重灌胃来氟米特35mg/kg，每天灌胃一次。连续灌胃3天后，在第4天继续按相应的方法进行灌胃，然后禁食6小时后，按小鼠体重，腹腔注射葡萄糖1g/kg后在特定时间用拜耳血糖仪测定小鼠血糖。图3显示了各模型组小鼠的葡萄糖注射时间与血糖浓度变化关系对比图。由图3可见：来氟米特对饲喂正常饲料的非糖尿病小鼠不能显著降低血糖。虽然经过高脂肪饲料饲喂8周后的小鼠血糖水平显著增高，但是来氟米特能显著降低高脂肪饲料饲喂后的糖尿病小鼠的血糖水平。5、来氟米特在胰岛素耐受试验中显著降低高脂肪饲料诱导的糖尿病小鼠模型血糖水平的试验：将32只b57bl/6小鼠随机分成两组，每组16只。其中一组饲喂正常饲料8周，另一组高脂肪饲料饲喂8周。再将经过正常饲料饲喂8周后的小鼠随机分成对照组和来氟米特组两组，每组8只。将经过高脂肪饲料饲喂8周后的小鼠也随机分成对照组和来氟米特组两组，每组8只。对各对照组和来氟米特组分别按以下相应方法进行灌胃。对照组，对小鼠用浓度为1.5g/100ml的羧甲基纤维素（cmc）水溶液进行灌胃，每天灌胃一次，每次0.1ml。来氟米特组，按小鼠体重灌胃来氟米特35mg/kg，每天灌胃一次。连续灌胃3天后，在第4天继续按相应的方法进行灌胃，然后禁食6小时后，按小鼠重量，腹腔注射胰岛素，2.5unit/kg，在特定时间测定小鼠血糖值。图4反映了各模型组胰岛素赖受结果。图4为各饲喂组模型的胰岛素注射时间和血糖浓度关系对比图。由图4可见：在胰岛素赖受试验中，来氟米特治疗对饲喂正常饲料的小鼠不能显著降低血糖，但能显著降低高脂肪饲料饲喂的糖尿病小鼠的血糖水平。6、胰岛素受体的敏感性试验：试验用雄性ob/ob小鼠（b6.v-lepob/olahsd）购自harlanlaboratories,inc。选用8～10周龄雄性ob/ob小鼠分成四组，每组5～8只，建立四个模型组。第一组为ob/ob小鼠对照组，对小鼠用1.5%cmc（重量/体积）进行灌胃，每天灌胃一次，每次0.1ml。第二组为ob/ob小鼠来氟米特治疗组，剂量按每公斤小鼠体重给予35mg来氟米特（35mg/kg）进行灌胃，每天灌胃一次。第三组正常小鼠的对照组：对小鼠用1.5%cmc（重量/体积）进行灌胃，每天灌胃一次，每次0.1ml，第四组正常小鼠来氟米特治疗组，剂量按每公斤小鼠体重给予35mg来氟米特（35mg/kg）进行灌胃。各模型组按以上相应方法连续灌胃3天，在第4天继续按相应的方法进行灌胃，然后禁食6小时后腹腔注射胰岛素，按照每公斤体重2.5unit，5分钟后分别收取肝脏、肌肉和脂肪。将肝脏、肌肉和脂肪分别加入np-40裂解液进行匀浆（用量：100mg组织加入500μlnp-40裂解液），经超声波裂解后冰上孵育30min，4℃，15,000rpm离心15min。聚丙烯酰氨凝胶电泳并转印到pvdf膜上之后将条带置于相应的一抗中孵育适当时间，然后加入辣根过氧化物酶偶联羊抗兔igg作用1小时，然后用超敏化学发光底物(piercechemicalco.,rockford,il)显影。将等量的蛋白（50μg/孔）上样到聚丙烯酰氨凝胶上，用免疫印迹试验（westernblot）方法检测胰岛素刺激的akt在s473和t308位点的磷酸化水平。磷酸化蛋白和总蛋白的表达量经灰度分析后进行统计学处理分析来氟米特是否能增加胰岛素受体的敏感性。以上np-40裂解液由50mm、ph为8.0的tris-hcl、150mm的nacl、1%np-40、5mm的edta、10µg/ml的抑酶肽(aprotinin）、10µg/ml的亮肽素(leupeptin）和1mm的苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride）组成。图5、6、7、8、9、10分别显示了来氟米特在ob/ob糖尿病小鼠体内增加脂肪、肝脏和肌肉组织中胰岛素受体的敏感性试验结果。由图5至图10可见：胰岛素刺激只能微弱刺激ob/ob糖尿病小鼠肌肉脂肪和肝脏组织内的akt磷酸化水平，表明糖尿病小鼠对胰岛素受体高度不敏感。来氟米特治疗组ob/ob糖尿病小鼠的肌肉脂肪和肝脏组织中的akt激酶的磷酸化水平明显高于溶剂对照组。这些结果表明来氟米特能增强胰岛素受体的敏感性，导致血糖明显下降。7、来氟米特的活性代谢产物a771726增加肌细胞和脂肪细胞的葡萄糖吸收试验：细胞培养和诱导分化：取c2c12（小鼠成肌细胞系）和l6（大鼠成肌细胞系）分别用含10%胎牛血清的dmem培养。单层c2c12细胞用含10%马血清的dmem培养2周，期间每2天更换一次新鲜培养基，即诱导分化为肌管细胞。3t3-l1脂肪细胞的诱导分化依据zebisch等的步骤进行，具体操作：3t3-l1细胞先用含有胰岛素(1μg/ml)、ibmx(0.5mm),dexmathosone(0.25μm)和rosiglitozone(2μm)的dmem培养48小时，然后再用含有高葡萄糖、10%fbs(胎牛血清)和胰岛素(1μg/ml)培养48小时。用无胰岛素的培养基培养7～14天，95%以上的细胞会分化为脂肪细胞。分别得到分化的l6肌管细胞和分化的3t3-l1脂肪细胞。将分化的l6肌管细胞和分化的3t3-l1脂肪细胞分别进行无血清、低血糖饥饿培养4小时，然后进行平行试验：或分别加入2x氨基酸用a771726（a771726的加入量为200μm），或分别加入雷帕霉素（雷帕霉素的加入量为20nm），或空白试验。分别作用2小时后，再分别进行用或不用胰岛素刺激45min，细胞换用krp-hepes液(10mmhepes,ph7.4,131.2mmnacl,4.7mmkcl,1.2mmmgso4,2.65mmcacl2,2.5mmnah2po4,1%bovineserumalbumin)并加入未标记的2-dog(0.1mm)和[3h]-dog，37℃培养5min。然后加入10μmcytochalasinb终止反应并用预冷pbs洗3遍。收集细胞，加入0.2nnaoh裂解细胞。然后用流式细胞仪检测放射活性。在加入2-dog之前加入10μmcytochalasinb检测非特异性的2-dog吸收值。2-dog吸收值在减去非特异性的2-dog吸收值后用蛋白浓度进行校准，蛋白浓度用bio-radproteinassaykit(bio-rad,hercules,ca)进行测定。图11、12分别显示了活性代谢产物a771726体外致敏3t3-l1或l6肌管中胰岛素受体并增加血糖吸收情况。图11、12中，a77为活性代谢产物a771726的简称，rapa为雷帕霉素的简写，图中“-”代表无相应材料，“+”代表加入了相应材料，如，图11、12中自左侧开始，第一条柱显示了：无药物、胰岛素和2x氨基酸材料的条件，而第二条柱则显示了：只加入胰岛素的条件；其它以此类推。结果表明：在l6肌管细胞中，2x氨基酸组能显著降低葡萄糖吸收的基础水平，与对照组相比减少29%，并且可将胰岛素刺激的葡萄糖吸收水平减少22%；在2x氨基酸条件下a771726能增加31%的葡萄糖吸收，见图9所示。同样地，在3t3-l1脂肪细胞中，2x氨基酸能显著减少胰岛素刺激的葡萄糖吸收。在有2x氨基酸的条件下，a771726和雷帕霉素均能显著增加胰岛素刺激的葡萄糖吸收，见图11所示。以上7个试验说明：来氟米特或其活性代谢产物a771726可用于制备治疗2型糖尿病的口服制剂，也可用于制备治疗2型糖尿病的注射制剂。当前第1页12