喜炎平注射液在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种喜炎平注射液在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术：

神经退行性疾病是神经细胞进行性变性坏死所引起的中枢神经功能减退导致的疾病，伴随着全球人口的老龄化而呈加重趋势，包括阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)、帕金森病(parkinson’sdisease,pd)、肌萎缩侧索硬化症(atrophylateralsclerosis,als)、亨廷顿氏病(huntington’sdisease,hd)以及脑中风(stroke)和心脑血管性痴呆(vasculardementia,vd)。其主要影响患者的认知功能和运动功能，致残、致死率极高，给患者家庭和社会带来极大的心理和经济负担。

其中，阿尔茨海默症(alzheimer'sdisease,ad)是以进行性记忆和认知功能退化为特征的一种神经退行性疾病。随着世界人口趋向老龄化，该病的发病率越来越多。据报道，每年有2000万的新增病例以及缺乏有效的治疗药物，使得ad成为世界第一位的神经退行性疾病，从已知的临床用药寻找能够治疗ad的药物具有重要临床意义。目前临床上使用的药物只能用于缓解ad症状，并不能从根本上改善疾病状态和终止疾病进程。严重影响患者的工作能力和生活质量，也为家庭和社会带来沉重的负担。

然而到目前为止，ad的发病病因和机制尚未完全阐明，研究认为ad的发生是由于遗传、代谢和环境等因素综合作用所致，目前得到普遍接受的发病机制是β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，aβ)学说，该学说的核心是aβ在脑内聚集，会形成老年斑，从而进一步引起一系列病理症状的产生，aβ是形成老年痴呆症的主要原因。aβ是由β-淀粉样前蛋白(β-amyloidprecursorprotein，app)经过β-分泌酶(β-appcleavingenzyme,bace)和γ-分泌酶剪切形成的由39-43个氨基酸组成的多肽，在ad的病理过程中起着主要作用。aβ是一个聚集性很高的多肽，在正常状态下，aβ可稳定地被分解、去除，仅以可溶性状态微量存在于脑组织中。1994年，从ad病人大脑皮层提取的水溶性片段被命名为水溶性的aβ。在早期的生理状态中，aβ聚集物也是一种可溶性的aβ。水溶性的aβ存在于正常人的脑脊液和血浆中，但是在正常的脑中却难以检测到，表明存在着一种快速降解aβ的机制，这种降解机制一旦被破坏，就会进一步的聚集，导致ad的发生。正常人体内也存在浓度非常低的aβ，但它们在脑内沉积需要很长的时间，并且脑内有抑制aβ聚集的因子，如卟啉、谷氨酰胺合成酶、载脂蛋白等。在ad脑中，由于某种原因aβ代谢平衡被破坏，即变成高度不溶性的aβ沉着在细胞间，与变性的神经突起、反应性神经胶质细胞一起形成老年斑。而ad患者由于aβ浓度升高或抑制aβ聚集的物质缺乏等原因，aβ聚集沉积，导致神经元坏死缺失、激活补体、使胶质细胞活性增加、细胞的骨架蛋白tau蛋白过度磷酸化等，最终引起痴呆。

除发病病因和机制尚未完全阐明之外，目前的神经退行性疾病的临床用药还存在诸多不良反应，例如左旋多巴作为临床治疗pd的药物，但长期服用左旋多巴会带来严重的不良反应——无意识的运动能力上的波动性：即左旋多巴引起的运动障碍(l-dopa-induceddyskinesia，lid)和非运动功能副作用。具体体现为易怒冲动、赌博成瘾、强迫症、多巴胺调节异常综合征等。因此，寻找一种安全可靠无副作用的药物治疗pd等神经退行性疾病具有深远意义。

综上所述，目前大部分神经退行性疾病尚无有效地阻断神经细胞变性过程的治愈疾病的手段，临床上主要是以药物对症治疗为主，只能改善症状且有明显副作用。

中药穿心莲提取物具有抗炎，抗病毒，抗菌，增强免疫力及抗血栓等作用。近来，穿心莲内酯也被报道有神经保护作用。例如，chan等报道在脑中风模型中，穿心莲内酯口服给药0.1mg/kg，最大能减少50％脑梗死面积[br.j.pharmcol.2010,161:668-679]。这类发现表明，穿心莲内酯有用于治疗脑中风的潜质。另外，穿心莲内酯的抗炎和提高免疫力等功能对神经保护也起到有益的作用。在中脑神经元和胶质细胞共培养模型中，穿心莲内酯能通过抑制小胶质细胞激活减少炎症反应介导的多巴胺神经元损伤[jpharmacolexpther.2004,308(3):975-83]。另外，申请号201310146923.3，201310391065.9，200410037476.9，200410008512.9等在先的中国发明专利分别公开了“具体的某一种或某一类穿心莲内酯或穿心莲内酯衍生物在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用”的应用。

但是，现今穿心莲内酯的应用还处于开发阶段，尤其是有关“穿心莲内酯注射液”更未得到广泛的应用。主要原因在于穿心莲内酯可溶于甲醇、乙醇、丙醇、吡啶，微溶于氯仿、乙醚，但因穿心莲内酯不溶于水，给制备液体制剂带来了困难。尽管目前，已有一些方法被用来转化穿心莲内酯成各种衍生物，例如一般提取穿心莲内酯后制备成各种水溶性衍生物的注射液，如与亚硫酸钠加硫酸或与亚硫酸氢钠发生加成反应，制得的水溶性磺酸盐，亚硫酸氢钠穿心莲内酯(莲必治注射液)，但上述盐在水中溶解度、稳定性不是特别好。除此之外，其生产过程中的杂质等质量控制无法满足更精确的要求。

因此，本领域目前公认的，正是由于穿心莲内酯不溶于水的特性以及目前生产工艺条件的限制，“穿心莲内酯注射液或溶液”仅仅是应用一般的炎症或抗病毒等用途，目前尚不具备在神经退行性疾病药物中的应用条件。

通过检索，目前也并没有任何有关“穿心莲内酯注射液用于制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用”或“穿心莲内酯衍生物注射液用于制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用”的相关报道。而且上述专利所提及的“穿心莲内酯或穿心莲内酯衍生物”目前也均无法在产业上实现“注射液”，更不可能给出任何技术启示使本领域技术人员想到可以在上述专利的基础上“形成注射液用于预防和治疗神经退行性疾病中的应用”。

进一步通过检索，目前更没有任何有关“穿心莲内酯磺化物注射液用于制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用”或“穿心莲内酯磺化物衍生物和/或其混合物注射液用于制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用”的相关报道。

综上所述，目前急需要一种产业和临床上均可以应用于“制备预防和治疗神经退行性疾病的注射液”以满足日益迫切的需求。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种产业上能够实现的，也可应用于实际临床的喜炎平注射液在制备治疗和/或预防神经退行性疾病药物中的应用。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑中风或心脑血管性痴呆。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为帕金森病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为mptp引起的帕金森病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为阿尔兹海默病。

优选的，其中，所述神经退行性疾病为app/ps1阿尔兹海默病。

优选的，其中，所述喜炎平注射液可单独或与其他药物组合制备预防和/或治疗神经退行性疾病药物。

总结本发明的ad实验及实验结果即：

水迷宫实验结果表明，喜炎平注射液对app/ps1小鼠空间学习记忆能力有改善作用，5mg/kg可以提高小鼠在目标象限的活动时间；在y迷宫实验中，喜炎平注射液能够提高小鼠在新颖臂的停留时间；开场实验结果表明，喜炎平注射液能够提高小鼠在中间区域的活动时间。氧化应激实验表明喜炎平注射液5mg/kg给药组显著降低mda的含量，升高sod的活力。体内和体外实验表明，喜炎平注射液对ad学习记忆能力下降的改善作用与aβ淀粉样斑块的生成和沉积无关，基本确定喜炎平注射液对ad小鼠学习记忆能力具有较好改善的作用。

总结本发明的pd实验及实验结果即：

开场实验结果表明，喜炎平注射液5mg/kg对mptp小鼠运动距离增加效果明显，接近于左旋多巴组。悬挂实验表明喜炎平注射液5mg/kg可以提高mptp小鼠抓握能力。爬杆实验表明喜炎平注射液5mg/kg缩短小鼠调转头部和爬完整个杆子的时间，而左旋多巴能够导致小鼠多动症状。强迫游泳表明，喜炎平注射液5mg/kg可以显著提高pd小鼠的游泳能力和抑郁状态，效果与左旋多巴组相当。小鼠转轮实验表明，喜炎平注射液5mg/kg能够显著提高小鼠在转轮上的运动时间。氧化应激实验表明喜炎平注射液5mg/kg给药组显著降低mda的含量，升高sod和过氧化氢酶的活力。喜炎平注射液2.5mg/kg和5mg/kg均可显著提升th的表达，神经细胞的凋亡和抑制中脑炎症反应。

综上实验结论可知：综合开场实验、悬挂实验、爬杆实验、强迫游泳等行为学研究，抗氧化指标及th表达水平和凋亡水平的分析，基本确定喜炎平注射液对小鼠帕金森病具有较好改善的作用。

另外，目前已知的，pd运动障碍主要原因是多巴胺能神经元丧失，多巴胺释放减少和炎症反应，通过westernblot、th免疫组化、tunel凋亡、iba-1免疫荧光等实验发现喜炎平注射液能够对抗mptp诱导的中脑氧化应激、th的减少和中脑细胞的凋亡，保护多巴胺能神经元。

更重要的是，经过实验数据可知，在行为学实验中我们观察到虽然左旋多巴能够改善mptp-pd小鼠运动能力，增加小鼠肌张力，但是小鼠呈现躁动状态，而喜炎平注射液在改善小鼠运动功能障碍的同时不会引起小鼠躁动状态，与左旋多巴相比没有副作用。

综上所述，基本确定喜炎平注射液对小鼠帕金森病具有较好改善的作用，且相比于左旋多巴相比没有副作用。

从而，本发明克服了现有技术的偏见，即认为“穿心莲内酯注射液或溶液仅仅是应用一般的炎症或抗病毒等用途，目前尚不具备在神经退行性疾病药物中的应用条件”的技术偏见。

本发明通过实验数据，进一步为喜炎平注射液的“老药新用”提供了新用途和作用机理，为喜炎平注射液的临床应用开拓了新前景，提供了一种产业上可以大量生产并可以实际应用于临床治疗神经退行性疾病药物的效果显著的注射液。

医学和药学研究人员无法预先在不做相关实验的前提下预先得知喜炎平注射液具有上述的良好用途。

附图说明

图1：喜炎平注射液提高ad小鼠的空间学习记忆能力的实验数据图。

图2，3：喜炎平注射液缓解ad小鼠大脑氧化应激的实验数据图。

图4，5：喜炎平注射液不影响aβ的生成和沉积的实验数据图。

图6，7：喜炎平注射液改善mptp-pd小鼠开场行为的实验数据图。

图8：喜炎平注射液改善mptp-pd小鼠悬挂实验的实验数据图。

图9，10：喜炎平注射液改善mptp-pd小鼠爬杆能力的实验数据图。

图11：喜炎平注射液提高pd小鼠游泳时间的实验数据图。

图12：喜炎平注射液改善mptp-pd小鼠转轮实验的实验数据图。

图13，14，15：喜炎平注射液改善mptp-pd小鼠氧化应激的实验数据图。

图16，17，18：喜炎平注射液促进了mptp-pd小鼠th的表达的实验数据图。

图19，20：喜炎平注射液抑制了mptp-pd小鼠脑细胞凋亡的实验数据图。

图21，22，23，24：喜炎平注射液抑制了mptp-pd小鼠炎症的实验数据图。

具体实施方式

实施例1：喜炎平注射液对app/ps1阿尔兹海默症小鼠的治疗作用

1.材料与方法

1.1实验动物与药品

本实验选用app/ps1雄性小鼠和同窝野生型小鼠，在室温(22℃-24℃)，湿度(50％-60％)，每日光照和和黑暗时间各12h的安静环境下饲养，自由取食饮水。实验前，将动物至于实验环境适应3天。

喜炎平注射液购自江西青峰药业有限公司，配成2.5mg/kg和5mg/kg剂量。

1.2动物分组与给药

小鼠称重后随机分为野生型，野生型给药组，app/ps1模型组、app/ps1喜炎平2.5mg/kg和5mg/kg治疗组，每组5只。

1.3行为学检测

1.3.1水迷宫实验

圆形恒温水池直径120cm，高50cm；圆形平台直径9cm,高度可调，升降范围20-35cm，本实验设定高度为20cm，平台可置于任意一个象限的中央。按东南西北四个方向将水池平均划分为四个象限(ne、se、sw、nw)，于各象限的池壁中点处将已剪好的不同形状的彩纸贴于高于水面的池壁内侧，做为小鼠寻找平台的标记物。水池内壁均为黑色，池壁标记物的位置在整个实验过程中保持固定。水迷宫视频采集系统要求水池壁和水的颜色要与实验动物毛色形成颜色反差，从而可以视频跟踪记录小鼠运动轨迹和各项实验参数。水深21cm,平台位于水面下1cm,肉眼观察水面无法看到平台位置。并用白色染料二氧化钛200g溶入水中搅匀，使水的颜色变成乳白色。为了适应啮齿类动物的趋暗性，实验室挂窗帘严密避光且整个水池周围挂遮光布帘，保证其内部无灯光直射。水池内有温控器，将水温保持在21-22℃。实验期间打开水池外的白炽灯，功率≤13瓦，灯光直射墙面，使墙面反光分散的分布于水池内。

1.3.1.1定位航行实验(placenavigation)

历时6d，实验前1天不放置平台，让小鼠自由游泳1min。正式实验时将平台固定在nw象限，位于水面下1cm。实验室中的物品和人员的位置在实验期间固定不变，作为动物的空间参照物。每日每只小鼠测试4次，第一次和第四次从目标象限对侧的象限(se)入水，第二次和第三次采用随机法确定入水象限(不包括se和nw象限)。监测时间为60s，小鼠在平台上停留超过2s判为寻台成功，小鼠入水至寻台成功的时程记作逃避潜伏期；若小鼠60s内未找到平台则潜伏期记为60s。小鼠爬上平台或实验时间超过60s则实验中止；让小鼠休息1min后，开始下一次实验。实验第一天的第一次测试前，先将小鼠置于平台上停留15s(称为适应)，之后的各次测试前不再给予适应。测试完毕不论寻台是否成功，均将小鼠置于平台适应10s。每次训练完后，用干毛巾将小鼠擦干，以防止低体温造成的应激。记录小鼠的逃避潜伏期和平均游泳速度(平均速度)。

1.3.1.2空间搜索实验(spatialprobe)

连续六日的定位航行实验结束后，第七日开始空间搜索实验。拆除水迷宫装置中的平台后，将小鼠由se象限入水，观察小鼠在60s内穿过原平台所在位置的次数、小鼠在原平台所在象限的时间比率来评价小鼠空间记忆能力。

1.3.2y迷宫实验

y迷宫装置：y迷宫用pvc板制作，内外壁贴黑色胶纸。共3个臂，各个臂夹角120度，每一臂尺寸30cm×8cm×15cm(长×宽×高)，在中央处各有一个可移动的隔板，在迷宫各个臂内贴上不同几何图形，作为视觉标记。每个y迷宫的3个臂被随机设为：新异臂(novelarm)、起始臂(startarm)和其他臂(otherarm)。新异臂：在实验的第1个阶段即训练期时用隔板挡住，在第2个阶段即测试期时打开；起始臂：小鼠进入迷宫时所在的臂。整个实验过程中起始臂和其他臂都是一直打开，动物可以自由出入。迷宫内铺垫木屑，每次训练或测试结束后，混匀各个臂里的锯末，以防动物残留气味干扰。迷宫上方1.5m处安置摄像镜头，全过程录像。

1.3.3开场实验

把小鼠放入openfield中(openfield为一个底面边长为59cm，高度为30cm的正方体)，开始记录20min内小鼠在中央区域(20cm×20cm)和外周区域活动的时间和距离。

1.3.4测大脑氧化应激

采用南京建成生物试剂公司的sod试剂盒、mda试剂盒检测各组中脑氧化应激指标。

1.3.5tht检测小鼠大脑沉积的β淀粉样斑块

切片脱蜡水化后，加入1％的硫磺素(tht)漂洗15min,双蒸水漂洗5min,加入1％的醋酸缓冲液5min去除多余颜色，50％甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.4统计方法

实验数据以(mean±sem)表示，应用graphpadprism5.0软件进行统计分析。计量资料采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1喜炎平注射液改善ad小鼠空间学习记忆能力

小鼠水迷宫实验结果表明，如图1所示，喜炎平注射液组能够降低小鼠找到平台的时间，以及在撤去平台后增加在平台的目标象限的活动时间，各组小鼠的游泳速度没有差异。小鼠y迷宫实验结果说明喜炎平注射液可以提高小鼠在新颖臂中的停留时间。小鼠开场实验表明喜炎平注射液能够提高ad小鼠在中间区域的活动时间。综上说明喜炎平注射液能够改善ad小鼠的空间学习记忆能力。

2.2喜炎平注射液抑制ad小鼠大脑氧化应激

如图2，图3所示，高剂量的喜炎平注射液能够抑制ad小鼠的mda含量，促进ad小鼠sod酶的活力，抑制大脑氧化应激，保护神经细胞。

2.3喜炎平注射液对ad小鼠aβ的沉积没有影响

通过小鼠脑切片tht染色，如图4，图5结果显示，喜炎平注射液对ad的学习记忆能力的改善作用与ad的淀粉样斑块沉积无关。体外实验通过喜炎平注射液有效成分穿心莲内酯与amyloidbeta1-42蛋白孵育72h，tht染色后通过荧光酶标仪检测，发现喜炎平注射液与aβ的聚集无关。

3.实验数据结论

ad的临床症状是逐渐发生的记忆障碍或遗忘发展为以语言功能障碍、视空间功能受损、失认及失用和计算力障碍为主的认知障碍和精神障碍。我们通过app/ps1是一种过表达app和ps1的阿尔兹海默症小鼠模型，小鼠在出生后3个月出现ad病理改变，6个月aβ开始沉积。因此，在小鼠3月龄开始灌胃给予喜炎平注射液2.5mg/kg和5mg/kg，持续给药6个月。给药结束后通过水迷宫、y迷宫、开场实验检测小鼠学习记忆能力，检测小鼠脑组织mda和sod氧化应激指标，tht染色检测小鼠aβ淀粉样斑块沉积。

因此，我们通过小鼠水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力，y迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力和开场行为检测小鼠的焦虑和抑郁情绪。

喜炎平注射液可以改善ad小鼠的空间学习记忆能力，改善小鼠抑郁焦虑情绪，缓解ad病理发生发展中的氧化应激。综上所述，基本确定喜炎平注射液对小鼠阿尔兹海默症具有改善的作用，且这种改善作用与aβ的产生无关。

实施例2：喜炎平注射液对mptp致小鼠帕金森病的治疗作用

1.材料与方法

1.1实验动物与药品

本实验选用10-12周龄25-28g健康雄性c57bl/6小鼠，小鼠在室温(22℃-24℃)，湿度(50％-60％)，每日光照和和黑暗时间各12h的安静环境下饲养，自由取食饮水。实验前，将动物至于实验环境适应3天。

mptp购于sigma，左旋多巴购于罗氏制药。mptp在给药前30min内以生理盐水配制，冰上保存，喜炎平注射液购自江西青峰药业有限公司，配成5％和10％的给药浓度，20g小鼠体重腹腔注射0.1ml。

1.2动物分组与给药

小鼠称重后随机分为正常组，mptp(25mg/kg)模型组，喜炎平注射液2.5mg/kg和5mg/kg治疗组、左旋多巴治疗组，每组8-10只。mptp(25mg/kg)按小鼠体重0.1ml/20g腹腔注射5天，喜炎平注射液在mptp给药1h后按小鼠体重0.1ml/20g在另一侧腹腔注射给药11天，给药结束后进行行为学实验检测。美多芭(75mg/kg)按小鼠体重0.1ml/20g灌胃。

1.3行为学检测

1.3.1开场实验(openingtest)

把小鼠放入openfield中(openfield为一个底面边长为59cm，高度为30cm的正方体)，开始记录20min内小鼠在中央区域(20cm×20cm)和外周区域活动的时间和距离。

1.3.2悬挂实验(ractiontest)

正常小鼠具有攀爬习性，这需要适当的握力和肢体运动协调性，因此可以用悬挂实验来测试mptp给药后小鼠的运动功能障碍。实验中将小鼠放置于距地面30cm高度，成水平状态的粗细度为0.5cm的小木杆上，记录下落地前的时间，若超过3min则记录为3min，然后作统计学分析。

1.3.3爬杆实验(poletest)

爬杆实验是为了检测并了解小鼠肢体运动协调情况。在一根长度为60cm且粗细为1cm的木杆顶端上放置一块海绵板，在木杆外面缠上纱布避免小鼠在攀爬过程中出现打滑问题。将小鼠头部向上放于杆顶端，记录两个时间：动物从开始运动到完全转为头向下的时间(t-turn)和从掉头开始到完全下到杆底的时间(t-la)，并作统计学分析。

1.3.4强迫游泳(swimtest)

目的是测试小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠放入一个直径为35cm的水桶中，水温为22℃-25℃，水深20cm，记录小鼠在5分钟游泳时间内小鼠不动的时间和游泳的时间，并作统计学分析。

1.3.5转轮实验

在实验前1天转轮低转速使小鼠适应。实验时，将小鼠放在直径2cm的木质转轮上，转轮速度为75转/分钟，检测小鼠3min内从转轮上掉下来时的时间。小鼠连续测量3次，每次间隔时间2min。

1.3.6检测中脑氧化应激

采用南京建成生物试剂公司的sod试剂盒、mda试剂盒、过氧化氢酶试剂盒检测各组中脑氧化应激指标。

1.3.7免疫印迹检测th的表达

各组小鼠分别取一小块中脑组织，匀浆提取蛋白进行westernblot。

1.3.8tunel检测神经元凋亡

采用诺唯赞试剂公司的tunel试剂盒检测小鼠中脑组织细胞凋亡。

1.3.9iba-1和realtime-pcr检测小胶质细胞活化情况

组织免疫荧光检测小鼠中脑区小胶质细胞活化程度；realtimepcr检测小鼠中脑炎症因子mrna表达。

1.4统计方法

实验数据以(mean±sem)表示，应用graphpadprism5.0软件进行统计分析。计量资料采用单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1喜炎平注射液改善pd小鼠开场行为

小鼠开场行为学实验。结果如图6，图7所示：mptp-pd小鼠在开场实验中与正常小鼠相比，运动距离明显减少(p<0.05)，在给予喜炎平注射液治疗后，2.5mg/kg治疗组效果与pd模型组小组相比无显著性差异，而5mg/kg治疗组对pd小鼠运动距离有显著性改善(p<0.05)，左旋多巴作为临床治疗pd的阳性对照药，能够显著改善pd小鼠的运动距离(p<0.05)。在开场行为中间区域活动时间的检测中，mptp-pd小鼠在中间区域活动的时间明显减少(p<0.05)，给药不同剂量的喜炎平注射液后，小鼠在中间区域的停留时间没有显著改变，左旋多巴却能提高pd小鼠在中间区域的活动时间(p<0.05)。这表明喜炎平能够改善pd小鼠的运动能力。

图6，图7中，a.各组小鼠在开场行为实验中运动的距离(n＝8,*p<0.01vs.control,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。b.各组小鼠在开场行为实验中在中间区域的运动时间(n＝8,*p<0.01vs.control,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

2.2喜炎平注射液改善pd小鼠悬挂能力

用悬挂实验检测小鼠抓握能力。如图8所示，mptp-pd小鼠由于肌张力的增加，抓握能力减弱，在木杆上悬挂时间短，与正常小鼠相比，悬挂时间短有显著性差异(p<0.01)。在给与喜炎平注射液治疗后，2.5mg/kg治疗组没有显著的改善作用；而5mg/kg治疗组能够显著改善pd小鼠的悬挂能力(p<0.01)，给予左旋多巴后能够增加pd小鼠的悬挂时间(p<0.01)。这表明，5mg/kg的喜炎平注射液治疗组能够显著改善pd小鼠的肌肉震颤，提高小鼠抓握能力。

图8中，(n＝8,**p<0.01vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup)。

2.3喜炎平注射液改善pd小鼠爬杆能力

小鼠爬杆能力能够检测小鼠的运动协调能力。如图9所示：mptp-pd小鼠运动协调能力差，在杆子上掉头的时间长，与正常小鼠相比有显著性差异(p<0.01)；给予不同剂量的喜炎平注射液作用后，2.5mg/kg治疗组对pd小鼠掉头时间没有改善，5mg/kg治疗组可以显著改善pd小鼠掉头时间，提高小鼠肢体协调能力(p<0.01)，左旋多巴也能够显著性的提高小鼠掉头的协调能力(p<0.01)。在图10中，mptp-pd小鼠爬完整个木杆的时间长，而5mg/kg和左旋多巴治疗组能够显著地减少pd小鼠爬杆时间(p<0.01)。

图9，图10中，a.各组小鼠在爬杆实验中掉转头的时间(n＝8,*p<0.01vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup)。b.各组小鼠完成整个爬杆实验的时间(n＝8,*p<0.05vs.control,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

2.4喜炎平注射液改善pd小鼠强迫游泳能力

小鼠强迫游泳可以检测小鼠的运动协调能力和抑郁症状。如图11所示：mptp-pd小鼠表现出游泳时间短(p<0.05)，多数时间呈漂浮状态，在给予喜炎平注射液5mg/kg后，能够显著提高pd小鼠的游泳能力和抑郁状态(p<0.05)，左旋多巴治疗组可以显著改善pd小鼠的运动协调能力和情绪抑郁状态(p<0.05)。

图11中，(n＝8,*p<0.05vs.control,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

2.5喜炎平注射液改善pd小鼠转轮运动时间

小鼠转轮实验反映了小鼠运动协调能力。如图12所示：mptp-pd小鼠运动协调能力差，在转轮上停留的时间短(p<0.01)，给予5mg/kg剂量治疗后能够显著提高pd小鼠在转轮上的停留时间(p<0.05)，左旋多巴能够显著改善pd小鼠的运动协调能力(p<0.01)

图12中：n＝8,**p<0.01vs.control,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup。

2.6喜炎平注射液缓解pd小鼠中脑黑质区氧化应激

氧化应激的失衡与pd密切相关，细胞内的抗氧化酶如超氧化物岐化酶(sod)和过氧化氢酶(catalase)的活性降低会导致ros的聚集，而ros作用膜性细胞器，导致膜结构氧化形成丙二醛，加剧细胞损伤。因此消除ros保护pd环境下的氧化损伤具有重要意义。图13，图14，图15中mptp-pd小鼠中脑黑质区氧化应激增加，mda含量显著增加(p<0.01)；给予喜炎平注射液5mg/kg治疗剂量后mda含量显著性地减少(p<0.01)；左旋多巴使得中脑黑质区mda显著下降(p<0.05)。mptp-pd小鼠中脑黑质区的sod酶活性下降，在给与喜炎平注射液5mg/kg治疗后能够显著增加sod酶活性(p<0.01)，起到抗氧化的作用。mptp-pd小鼠的过氧化氢酶活性下降(p<0.05)，氧化应激增加；在给与5mg/kg的喜炎平注射液后过氧化氢酶的活性显著性增加(p<0.01)，促进氧化物的清除。

图13，图14，图15中：a.各组小鼠中脑黑质区的mda的含量(n＝3,**p<0.01vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup.)b.各组小鼠中脑黑质区sod活性变化(n＝3,*p<0.05vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)c.各组小鼠中脑黑质区过氧化氢酶活性变化(n＝3,*p<0.05vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

2.7喜炎平注射液抑制了mptp-pd小鼠th减少

多巴胺是一种中枢神经递质，在多巴胺能神经元中由酪氨酸在酪氨酸羟化酶(th)的作用下变成多巴胺的前体多巴，th的转一性好，因此作为多巴胺能神经元的标志。在pd患者中，多巴胺能神经元受损减少会引起th的表达减少。westernblot结果显示：mptp-pd小鼠的黑质区的th表达减少，给予喜炎平注射液2.5mg/kg剂量能够促进th的表达，喜炎平注射液5m/kg可以显著性的增加th的表达，与左旋多巴达到相似的表达值。th的免疫组化显示：mptp-pd小鼠的黑质区th阳性的多巴胺能神经元细胞减少，给予不同剂量的喜炎平注射液后可以抑制th阳性的多巴胺能神经元细胞的减少，左旋多巴能够改善黑质区多巴胺能神经元细胞减少。尼氏染色液常用于显示脑或脊髓的基本神经结构，染色后呈蓝紫色。尼氏小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强；相反在神经细胞受到损伤时，尼氏小体的数量会减少甚至消失。如图16，图17，图18所示，mptp-pd小鼠神经受损，蛋白合成能力降低，蓝色染色浅，喜炎平注射液保护pd小鼠神经细胞促进神经蛋白的合成。

图16，图17，图18中：a.westernblot检测各组小鼠th的表达。b.th的免疫组化检测各组小鼠黑质区的多巴胺能神经元。c.尼氏染色检测小鼠黑质区的神经元受损和蛋白表达能力。

2.8喜炎平注射液抑制了中脑黑质区细胞凋亡

pd患者伴随中脑黑质区多巴胺能神经元的凋亡。如图19，图20所示，通过tunel检测细胞凋亡，我们发现，mptp-pd小鼠中脑区的凋亡细胞增加，在给予喜炎平注射液5mg/kg后能够降低中脑区细胞凋亡，达到与左旋多巴相似的效果。通过对tunel阳性细胞的统计，我们发现mptp-pd小鼠tunel阳性的细胞与正常的小鼠相比显著增加(p<0.01)，给与喜炎平注射液后能够抑制细胞的凋亡(p<0.01)达到与左旋多巴相似的保护效果。

图19，图20中：a.tunel染色检测各组小鼠黑质区神经元的凋亡情况。b.统计各组小鼠黑质区凋亡阳性的细胞数(n＝3,**p<0.01vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup)。

2.9喜炎平注射液抑制了mptp-pd小鼠中脑黑质区炎症

由于炎症参与促进了pd的发生发展，所以采用elisa检测外周血炎症因子，免疫荧光检测中脑区小胶质细胞活化和pcr检测中脑区炎症因子。如图21，图22所示：在mptp-pd小鼠的外周血中il-1β的水平增加，给与不同剂量喜炎平注射液和左旋多巴治疗能够降低il-1β的水平(p<0.01)；mptp-pd小鼠外周血的tnf-α增加，在给予5mg/kg的喜炎平注射液后能够抑制tnf-α的增加(p<0.05)，左旋多巴不能降低tnf-α，这与喜炎平的抗炎作用一致。如图23所示，mptp-pd小鼠中脑区小胶质细胞活化，表达iba-1，喜炎平注射液能够抑制iba-1阳性细胞表达，左旋多巴无法抑制iba-1的表达。炎症反应伴随大量炎症的产生，图24中，荧光定量pcr检测中脑组织中的炎症因子：pge2，inos，il-1β，il-6，tnf-α，ccl3的mrna，结果显示，mptp-pd小鼠的炎症因子mrna显著增加(p<0.01)，喜炎平能够抑制pge2，inos，il-1β，il-6，tnf-α，ccl3的mrna含量(p<0.01)，左旋多巴能够降低inos和ccl3的mrna，对其他炎症因子没有影响。

图21，22，23，24中：a.elisa检测外周血il-1β含量。b.elisa检测外周血tnf-α含量。c.免疫英冠检测小鼠中脑区的小胶质细胞活化标志iba-1。d.荧光定量pcr检测各组小鼠中脑炎症因子mrna的表达。(n＝8,**p<0.01vs.control,^##p<0.01vs.mptp-treatedgroup,^#p<0.05vs.mptp-treatedgroup)。

4.实验结论

左旋多巴作为临床治疗pd的药物，从最初对左旋多巴的热情积极到后来逐渐认识到长期服用左旋多巴带来的不良反应——无意识的运动能力上的波动性：左旋多巴引起的运动障碍(l-dopa-induceddyskinesia，lid)和非运动功能副作用：易怒冲动、赌博成瘾、强迫症、多巴胺调节异常综合征等。结合行为学实验，给予左旋多巴的pd小鼠呈现易动活跃状态，因此，寻找一种安全可靠无副作用的药物治疗pd具有深远意义。

pd的临床症状是运动功能障碍，因此我们通过一系列行为学实验研究喜炎平注射液对pd的治疗作用。给药结束后通过开场实验、悬挂实验、爬杆实验、强迫游泳实验、转轮实验检测小鼠行为学，检测中脑mda、sod氧化应激指标，检测th的表达水平，观察药物对小鼠帕金森样行为的改善。

开场实验是为了测量实验小鼠进入开场区域后的各种行为(跑动、静等)以及小鼠在中央区域和四周区域的运动时间。通过利用开场区域引起小鼠的焦虑和恐惧，来检测小鼠的活动量及自主活动的情况，可以重复测量而不影响其它行为学测试的分析，方便了解小鼠主动行为、探究行为及抑郁或警觉情绪和对新环境的适应能力，常用于评估小鼠的运动能力、精神状态及给药前后的行为变化，能够客观定量地反映活动量及自主活动功能。喜炎平注射液可以改善pd小鼠运动能力，提高运动距离。

悬挂实验中，正常小鼠具有良好的爪抓持物体的习性和攀爬活性，这需要适当的握力控制和运动协调性，因此可以通过悬挂实验来测试小鼠的肢体运动协调情况，通过小鼠悬挂时间及悬挂活动过程可以很好反应出小鼠震颤、肌肉僵直等情，从而用于评估小鼠的肌肉力量和肢体协调功能，是一种良好的帕金森病模型小鼠运动功能检测方法。喜炎平注射液和左旋多巴都可以改善pd小鼠的运动协调能力。

爬杆实验中，正常小鼠均可以迅速地反转并且迅速爬到杆底部,且肢体动作协调，而mptp给药的小鼠，调头时间、爬杆时间与正常对照组相比均有不同程度的延长。喜炎平注射液高剂量组和左旋多巴组都能提高pd小鼠的降低时间。

转轮实验是木棒在一定转速或者不断加速的过程中，观察小鼠在转动的木棒上的停留时间，从而评估小鼠的肢体运动和协调能力。喜炎平注射液高剂量组和左旋多巴组都能提高pd小鼠在转轮上的停留时间。

强迫游泳实验是一种用来评估潜在的抗抑郁疗效验证。这是一种绝望的行为实验法，其基本原理是使被放置于一个有限的空间内的老鼠使之强迫游泳，开始时小鼠拼命游泳力图逃脱，并很快就变成漂游不动的状态，偶尔四肢会划动下来保持身体平衡以致不会下沉，且仅露出鼻子来保持呼吸，这实际是表明小鼠已放弃了逃生的希望，它们这是属于行为绝望。mptp-pd小鼠中，由于大脑黑质多巴胺能神经元受损，情感上表现出抑郁症状，因此通过计算小鼠在一定时间内的平均游泳时间来评估小鼠的抑郁精神状态，观察其游泳过程的肢体运动判断小鼠运动协调能力。高剂量的喜炎平注射液和左旋多巴都能够改善pd小鼠的抑郁样症状。

pd运动障碍主要原因是多巴胺能神经元丧失，多巴胺释放减少和炎症反应，通过westernblot、th免疫组化、tunel凋亡、iba-1免疫荧光等实验发现喜炎平注射液能够对抗mptp诱导的中脑氧化应激、th的减少和中脑细胞的凋亡，保护多巴胺能神经元。

在行为学实验中我们观察到虽然左旋多巴能够改善mptp-pd小鼠运动能力，增加小鼠肌张力，但是小鼠呈现躁动状态，而喜炎平注射液在改善小鼠运动功能障碍的同时不会引起小鼠躁动状态，与左旋多巴相比没有副作用。综上所述，基本确定喜炎平注射液对小鼠帕金森病具有较好改善的作用。