芒果苷在制备抗病毒药物中的应用的制作方法

本申请是针对申请日为2015-7-24，申请号：201510444307.5，发明名称：芒果苷在制备抗病毒药物中的应用的分案申请。

本发明涉及芒果苷的用途，特别是涉及芒果苷在制备抗鲤春病毒血症病毒或斑点叉尾鮰病毒药物中的应用。

背景技术：

鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarpvirus，svcv)，隶属于弹状病毒科(rhabdoviridae)、水疱性口炎病毒属(vesiculovirus)，引起的鲤春病毒血症是一种急性、出血性并有严重传染性的疾病，被国际兽疫局(oie)列为必须申报的疾病，中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(2008)中的一类动物疫病。

斑点叉尾鮰病毒(ccv)隶属于疱疹病毒目(herpesvirales)、鱼类疱疹病毒科(alloherpesviridae)、鮰鱼疱疹病毒属(ictalurivims)，具有囊膜的双链dna病毒。导致的斑点叉尾鮰病毒病可造成养殖场中鱼苗和鱼种的大量死亡，被国际兽疫局(oie)列为必须申报的疾病，中国农业部也将之列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》(2008)中的二类动物疫病。

由上述病毒引起的疾病对我国水产养殖业危害巨大，暂时没有有效的药物和治疗方法，一旦爆发会对水产养殖业造成巨大的损失。寻找抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒的药物显得尤为重要和紧迫。

芒果苷(mangiferin)又名芒果素，知母宁，是一种多酚类化合物，分子式为c19h18o11，相对分子量422。芒果苷主要从漆树科植物芒果树和扁桃树的叶、果实、树皮，龙胆科植物东北龙胆、川西獐牙菜，水龙骨科植物光石韦等分离得到，近年来也有人从蔬菜中分离出芒果苷。随着对芒果苷研究的不断深入，其止咳平喘祛痰、免疫抗炎镇痛、保肝利胆、抗脂质过氧化、抗癌、抗糖尿病、抗菌等多种药理活性被不断地发掘出来。然而，尚未见其有抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒等水生动物病毒的报道，因此发明人对芒果苷是否具有抗鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒进行了研究，发现其可以显著抑制这两种病毒的复制，在有效浓度下对细胞安全无毒，因此其作为抗水生病毒药物开发意义重大。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供芒果苷在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用，包括芒果苷在体外抑制鲤春病毒血症病毒中的应用。

本发明的另一个目的在于提供芒果苷在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用，包括芒果苷在体外抑制斑点叉尾鮰病毒药物中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供芒果苷在制备同时治疗或预防抗鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明以芒果苷进行了细胞水平的抗病毒实验，分别用一定浓度的芒果苷预处理fhm细胞和cco细胞，再以0.1moi的鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒感染，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度芒果苷，24h后检测病毒的复制水平。结果显示，细胞经芒果苷处理后，这两种病毒的复制水平极显著降低，说明芒果苷具有抑制鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒等水生病毒的作用。细胞毒性实验显示所使用浓度的芒果苷对fhm和cco细胞均没有毒副作用，可以作为鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病的治疗剂和预防剂。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次发现芒果苷可用于水产领域病毒的防治，为治疗鲤春病毒血症病毒病和斑点叉尾鮰病毒病提供了新的治疗途径和手段。

2.芒果苷可以抑制svcv的复制，还可以抑制ccv的复制，且对细胞无毒，是一种低毒高效的抗病毒药物。

3.利用现代常用药物制剂手段，可将芒果苷作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

附图说明

图1是本发明实施例1中所采用不同浓度芒果苷对fhm细胞的毒性实验结果。

图2是本发明实施例2中所采用不同浓度芒果苷对svcv的抑制实验结果。

图3是本发明实施例1中所采用不同浓度芒果苷对cco细胞的毒性实验结果。

图4是本发明实施例3中所采用不同浓度芒果苷对ccv的抑制实验结果。

具体实施方式

下面通过实例具体说明本发明所述芒果苷的应用。这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

芒果苷对细胞毒性实验

采用mtt法检测药物毒性，具体方法：收集对数生长期的胖头鲤细胞(fatheadminnowcell，fhm)细胞或cco细胞(斑点叉尾鮰鱼卵巢细胞)，调整细胞悬液浓度，将其加入到96孔板中，每孔加入200μl培养液，细胞密度在1000-5000/孔，边缘孔用无菌pbs填充；5％co2，28℃孵育至细胞贴壁后(约6-8h)即可加入浓度梯度的芒果苷，每一梯度设6个复孔，继续孵育48h，倒置显微镜下观察细胞状态；每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h后终止培养，小心吸尽孔内培养液；每孔加入150μl二甲基亚砜，置于脱色摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率。

本实验同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相应浓度的溶剂、培养液、mtt、二甲基亚砜)。

结果如图1所示，实验所采用的各浓度芒果苷处理fhm细胞24h后细胞存活率与对照组相比没有显著性变化，表明所使用浓度的芒果苷对fhm细胞没有毒性作用。

结果如图3所示，实验中所采用的各浓度芒果苷处理cco细胞24h后细胞存活率与对照组相比没有显著性变化，表明所使用浓度的芒果苷对cco细胞没有毒性作用。

实施例2：

芒果苷在制备治疗或预防鲤春病毒血症病毒病药物中的应用，包括以下步骤：

接种fhm于12孔板，待长到70-80％单层后，吸弃培养液，加入含有100um、50um、25um、12.5um芒果苷和pbs的完全培养液预处理6h，吸弃培养液，用0.1moi的svcv100μl吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度芒果苷和pbs的完全培养基，28℃、5％co2培养箱中继续培养24h(每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总rna，反转录后荧光定量检测svcv-g基因表达水平。定量检测svcv-g基因的引物序列为tgctgtgttgcttgcacttatyt/tcaaackaargaccgcatttcg。svcv共编码核蛋白(n)、磷蛋白(p)、膜蛋白(m)、糖蛋白(g)和依赖rna的rna聚合酶(l-蛋白)等5个结构蛋白，其中由g基因编码的糖蛋白决定svcv的宿主范围，同病毒毒力相关，常作为病毒载量的检测靶标。

结果如图2所示，与对照组相比，当芒果苷浓度为25um时svcv-g基因的表达显著降低(p＜0.05)，较对照组下降31.38％。当芒果苷浓度为50um和100um时基因表达量极显著降低(p＜0.01)，较对照组分别下调36.57％和67.42％。表明芒果苷可以抑制svcv的复制，并具有浓度依赖性。

实施例3：

芒果苷在制备治疗或预防斑点叉尾鮰病毒病药物中的应用，包括以下步骤：

接种cco细胞于12孔板，待长到70-80％单层后，吸弃培养液，加入含有100um、50um、25um、12.5um芒果苷和pbs的完全培养液预处理6h，吸弃培养液，用0.1moi的ccv100μl吸附细胞，28℃孵育1h，洗去游离的病毒，继续加入含有对应浓度芒果苷和pbs的完全培养基，28℃、5％co2培养箱中继续培养24h(每一个浓度处理都设置三个独立重复组)。24h后收集细胞提取总rna，反转录后荧光定量检测ccv-orf46基因表达水平。定量检测ccv-orf46基因的引物序列为gtctattttggaggctgc/attcgggttatcggtggc。ccv-orf46编码ccv的主要结构蛋白，同病毒的入侵相关，常作为病毒载量的检测靶标。

结果如图4所示，与对照组相比，当芒果苷浓度为50um时ccv的复制水平显著降低(p＜0.05)，较对照组下调41.43％，当芒果苷浓度为100um时ccv的复制水平极显著降低(p＜0.01)，较对照组下调76.07％。结果表明芒果苷处理cco细胞后可以显著提高细胞抗ccv效果，并具有浓度依赖性。

通过上述实验证明，芒果苷显著降低鲤春病毒血症病毒和斑点叉尾鮰病毒的复制水平，对fhm细胞和cco细胞安全无毒。芒果苷可以用于制备预防和治疗鲤春病毒血症或/和斑点叉尾鮰病毒病的药物。