一种化疗免疫联合治疗的原位温敏凝胶药物递送系统的制作方法

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种化疗免疫联合治疗的原位温敏凝胶药物递送系统。

背景技术：

化疗、手术切除或放射治疗是最常用的癌症治疗策略。其中化学治疗是目前应用最为广泛的治疗手段，但是临床应用中常面临诸多挑战，如抗肿瘤效果与药物剂量间存在计量依赖性。然而，高剂量药物常常诱发严重的毒副作用。如何构建高效、低毒及生产可控的新型的药物递送系统是目前研究的关键。

在肿瘤的治疗方法中，化学治疗是抑制原发部位癌细胞快速增殖的重要方法之一，通过细胞毒类化疗药物杀灭肿瘤细胞以达到治疗肿瘤的目的，但由于具有选择性差、毒性强、对肿瘤组织穿透性差和易产生耐药性等问题限制了化疗药物对肿瘤的杀伤作用。大量的研究证明化疗免疫的联合使用具有多项优点，它不仅能逆转肿瘤晚期导致的免疫抑制、还可以在一定程度上减少化疗的毒性作用以及降低肿瘤细胞耐药性的发生。因此，免疫治疗与化疗的联合使用可作为肿瘤治疗中一种合理方案在未来临床实践中得到广泛重视和应用。

肿瘤组织中存在大量免疫相关细胞，其中巨噬细胞，可以利用l-精氨酸作为底物，在诱导型no合成酶(inos)的作用下产生具有细胞毒性的一氧化氮(no)，产生促进肿瘤细凋亡等作用，协同抗肿瘤治疗。外围修饰l-精氨酸的肽类树状大分子，不但可以利用其空腔载药实现化学治疗，同时还可以提供巨噬细胞inos的底物产生no发生协同的免疫治疗。

传统化疗采用的静脉注射方法面临诸多挑战，如药物递送系统到达作用靶点前受粘膜屏障和非特异性摄取等阻碍，具有严重的全身性毒副作用等。其中注射型水凝胶作为局部缓释药物递送系统，以其恒释性和缓释性、生物分子活性高、使用方便且毒副作用较低等优点成为化学治疗的研究热点。特别是近年来以plga-peg-plga材料为基础的注射型温敏水凝胶更是展示出极大的临床应用前景。因为其材料制备简单，具有良好的生物降解性；不需要化学试剂的交联，利用体内外温度的变化实现凝胶性；同时还可以作为药物/基因纳米粒子的储库展现更佳的作用效果等。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明的目的是制备一种化疗免疫联合治疗的原位温敏凝胶药物递送系统，基于肽类树状大分子特性可实现化疗免疫联合治疗的注射型plga-peg-plga温敏水凝胶缓释共载体，以期实现肿瘤治疗中提高治疗效果，降低系统毒性的目的。

为实现上述目的，本发明采用的方案如下：

一种化疗免疫联合治疗的原位温敏凝胶药物递送系统，包括肽类树状大分子(g4-arg)、抗肿瘤药物阿霉素dox和温敏凝胶基质材料plga-peg-plga，其特征在于，通过疏水作用肽类树状大分子将dox包载于其空腔内形成载药肽类树状大分子，再经过溶胀过程将载药肽类树状大分子包裹于温敏凝胶基质plga-peg-plga中，从而形成室温下为可注射型溶胶，体温下转变为凝胶的原位药物递送系统。

所述肽类树状大分子结构式为：

肽类树状大分子在巨噬细胞内被水解为单体l-精氨酸，作为inos的底物生成no，产生免疫治疗作用。

肽类树状大分子的合成方法为：

a.以h-lys-ome和boc-l-lys(boc)-oh为原料，在氮气保护下将反应物与六氟磷酸盐(hbtu)和1-羟基苯并三唑(hobt)溶于无水二甲基甲酰胺(dmf)。在冰浴中加入二异丙基乙胺(dipea)和三(2-氨基乙基)胺搅拌0.5-1小时，再在室温搅拌8-12小时。反应结束后，除去溶剂，将残留物溶于乙醚，依次用饱和nahco3水溶液、nahso4水溶液，饱和nahco3水溶液和水洗涤。用na2so4干燥溶液后旋转蒸发法除去溶剂得到白色固体。

b.将上一步得到的化合物溶解在无水二氯甲烷中。然后加入三氟乙酸在氮气保护下脱去boc保护基团。旋转蒸发法除去溶剂后，加入乙醚，出现沉淀物。通过离心收集沉淀物并用无水乙醚洗涤3次。将所得固沉淀物在高真空下干燥后加入二氯甲烷、dipea、hbtu、hobt和反应原料boc-l-lys(boc)-oh，氮气保护下在冰浴中搅拌0.5-1小时，再在室温下搅拌18-24小时。反应结束后，除去溶剂，将残留物溶于乙醚，依次用饱和nahco3水溶液、nahso4水溶液，饱和nahco3水溶液和水洗涤。用na2so4干燥溶液后旋转蒸发法除去溶剂得到白色固体。

c.采用与步骤b中相同的方法将步骤b得到的化合物的boc保护基团除去。将去保护的化合物在氮气保护下溶于无水dmf，加入dipea、hbtu、hobt和反应原料boc-l-arg(pbf)-oh，室温搅拌36-48小时，得到白色固体。用tfa/ch2cl2的溶液除去产物的保护基团。旋转蒸发法除去溶剂后，加入乙醚，出现沉淀物。通过离心收集沉淀物并用无水乙醚洗涤3次。将沉淀物冻干，得到最终化合物(g4-arg)为白色固体。

所述温敏凝胶基质plga-peg-plga结构式为：

丙交酯(la)与乙交酯(ga)比例为1-2∶1

温敏凝胶基质plga-peg-plga的合成方法为：聚乙二醇(peg)在异辛酸亚锡催化作用下与乙交酯、丙交酯开环聚合反应生成透明粘稠胶体，peg与(丙交酯+乙交酯)的重量比为1∶2-2.5，丙交酯与乙交酯的摩尔比为6-7∶1。冻干得plgapeg-plga嵌段共聚物。所制备的plga-peg-plga嵌段共聚物为略带粘稠的、淡黄色的、透明胶状物。

本发明使用的具体制备方法如下：

a、载药肽类树状大分子的制备：分别将肽类树状大分子溶于水中，dox·hcl溶于甲醇中，加入三乙胺碱化，然后将dox溶液加入聚合物溶液中，搅拌过夜后将混合溶液离心，取上清液冻干获得载药肽类树状大分子。

b、含药凝胶的制备：将适量载药肽类树状大分子溶于蒸馏水中，得到载药肽类树状大分子溶液。将适量plga-peg-plga加入1ml载药肽类树状大分子溶液，4℃静置过夜，溶胀完全后得到的含药凝胶。

本发明制备的原位药物递送系统可在肿瘤附近经皮下注射形成原位凝胶，缓慢降解，递送载药肽类树状大分子至肿瘤组织，产生免疫治疗和化学治疗双重作用，抑制肿瘤的发展。载药肽类树状大分子对肿瘤组织具有良好的穿透性，可以递送抗肿瘤药物至肿瘤内部，提高抗肿瘤药物的疗效，同时肽类树状大分子可被分解为单体l-精氨酸，作为巨噬细胞inos的底物生成具有细胞毒性no，诱导肿瘤细胞凋亡，产生协同免疫治疗，提高对肿瘤的杀伤作用。温敏凝胶基质plga-peg-plga在室温下为可注射型溶胶，皮下注射后在体温下转变为凝胶，缓慢降解，释放出载药肽类树状大分子。这种原位给药方式克服了传统静脉注射带来的全身毒性和清除率高的问题，降低了给药次数的同时，降低全身毒副作用并提高疗效。

相比于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明制备原位药物递送系统在肿瘤附近形成凝胶，凝胶缓慢降解释放出载药肽类树状大分子，通过淋巴转运和间隙转运作用于肿瘤组织及细胞，克服了静脉注射给药存在的全身毒性等问题。

2、本发明的肽类树状大分子(g4-arg)具有良好的穿透性，可作用于肿瘤内部，将药物递送至肿瘤内部细胞，提高疗效。

3、本发明的肽类树状大分子在作为药物载体的同时，其降解产物l-精氨酸可作为肿瘤组织中巨噬细胞内的inos底物生成具有细胞毒性的no，产生诱导肿瘤细胞的凋亡等作用。免疫治疗与化学治疗联合作用，提高对肿瘤的杀伤作用。

4、本发明所用的材料都具有良好的生物相容性和生物可降解性，对正常组织及细胞毒性小，安全性高。

5、本发明制备方法简单，反应条件温和可控，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1plga-peg-plga¹h-nmr谱图

图2凝胶相变图

图3肽类树状大分子(g4-arg)质谱图与核磁图

图4载药肽类树状大分子紫外吸收扫描图

图5载药肽类树状大分子药物释放

图6含药凝胶药物释放

图7肽类树状大分子细胞毒性评价

图8体外no生成

图9体外抗肿瘤活性

图103d肿瘤球渗透评价

图11体内抗肿瘤活性

图12器官组织切片he染色

具体实施方式

下面具体实施例是对本发明的进一步说明，但下述仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例1：plga-peg-plga温敏材料的制备

20.06g，mn～1000da的peg在真空下脱水，120℃，4h。温度降至80℃后，加入4.21gga和37.18gla在氩气保护下脱水30min。然后加入la和ga原料的0.15％辛酸亚锡(w/w)作为催化剂。在150℃下反应12小时后，80℃热水洗涤三次以纯化产物。

对plga-peg-plga进行¹h-nmr分析(附图1)，丙交酯(la)与乙交酯(ga)比例为1.7/1，分子量为1250-1000-1250，凝胶渗透色谱(gpc)得到mw/mn＝1.4。

实施例2：肽类树状大分子的制备：

1.在氮气保护下将h-lys-ome(699.4mg，3mmol)，boc-l-lys(boc)-oh(2.18g，6.3mmol)，六氟磷酸盐(hbtu，2.39g，6.3mmol)和1-羟基苯并三唑(hobt，851.1mg，6.3mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(dmf，50ml)。加入二异丙基乙胺(dipea，1.63g，12.6mmol)并在冰浴中搅拌5分钟，然后加入三(2-氨基乙基)胺(220mg，1.5mmol)。氮气保护下在冰浴中搅拌30分钟，再在室温搅拌8小时。反应结束后，除去溶剂，将残留物溶于乙醚(150ml)，依次用饱和nahco3水溶液、nahso4水溶液(1m)，饱和nahco3水溶液和水洗涤。用na2so4干燥溶液后旋转蒸发法除去溶剂得到白色固体。

2.将上一步得到的化合物(2.26g，2mmol)溶解在无水二氯甲烷(10ml)中。然后加入三氟乙酸(10ml)在氮气保护下搅拌30分钟。旋转蒸发法除去溶剂后，加入乙醚，出现沉淀物。通过离心收集沉淀物并用无水乙醚洗涤3次。将所得固沉淀物在高真空下干燥1小时后加入二氯甲烷(100ml)然后加入dipea(2.33g，18mmol)。同时加入boc-l-lys(boc)-oh(2.29g，6.6mmol)，hbtu(2.5g，6.6mmol)和hobt(891.7mg，6.6mmol)，氮气保护下在冰浴中搅拌30分钟，再在室温下搅拌24小时。反应结束后，除去溶剂，将残留物溶于乙醚(150ml)，依次用饱和nahco3水溶液、nahso4水溶液(1m)，饱和nahco3水溶液和水洗涤。用na2so4干燥溶液后旋转蒸发法除去溶剂得到白色固体。用柱色谱法(二氧化硅，ch2cl2∶ch3oh，10∶1)纯化该粗产物得到白色固体，产率为84.2％。

3.采用与步骤2相同的方法将步骤2得到的化合物的boc保护基团除去。将去保护的化合物在氮气保护下溶于无水dmf(25ml)，加入dipea(465.1mg，3.6mmol)，然后同时加入boc-l-arg(pbf)-oh(790.0mg，1.5mmol)，hbtu(568.8mg，1.5mmol)和hobt(202.7mg，1.5mmol)，室温搅拌48小时。，sephadexlh-20色谱柱色谱柱(流动相ch3oh)纯化产物，得到白色固体。用tfa/ch2cl2的溶液除去产物的保护基团。旋转蒸发法除去溶剂后，加入乙醚，出现沉淀物。通过离心收集沉淀物并用无水乙醚洗涤3次。将沉淀物冻干，得到最终化合物为白色固体。

对所得肽类树状大分子进行质谱与¹h-nmr分析(附图3)。

实施例3：载药肽类树状大分子的制备

分别将10mg肽类树状大分子溶于1.5ml水中，15mol当量dox·hcl溶于300μl甲醇中，加入5μl三乙胺碱化，然后将dox溶液加入肽类树状大分子溶液中，搅拌过夜后将混合溶液离心(8000rpm5min)，取上清液冻干获得载药肽类树状大分子。

紫外测定肽类树状大分子载药量为17μg/mg。并对载药肽类树状大分子进行紫外吸收光谱扫描(附图4)，载药肽类树状大分子最大吸收峰有轻微红移。

实施例4：含药凝胶的制备

将适量载药肽类树状大分子溶于蒸馏水中，得到dox浓度为0.5mg/ml的载药肽类树状大分子溶液。0.25gplga-peg-plga加入1ml载药肽类树状大分子溶液，4℃静置过夜，溶胀完全后得到的含药凝胶。

实施例5：药物释放

药物释放实验在磷酸缓冲液中进行(pbsph5.5和ph7.4)。冻干载药肽类树状大分子稀释至1mg/ml，将1ml该溶液置入透析袋(mwco3500)，透析袋放入含有30ml磷酸缓冲液的试管，在摇床速率为100rpm，37℃恒温培养箱中培养，在特定时间点从试管中取3ml测定dox含量，并补充3ml新鲜磷酸缓冲液。dox释放量用紫外分光光度计测定。

将0.16g含药凝胶溶液置入透析袋(mwco3500)内，37℃孵育10min，使其形成凝胶，加入1ml磷酸缓冲液，透析袋放入含有30ml培养液的试管，在摇床速率为100rpm，37℃恒温培养箱中培养，在特定时间点从试管中取3ml测定dox含量，并补充3ml新鲜磷酸缓冲液。dox释放量用荧光分光光度计测定。

ph5.5条件下药物释放均大于ph7.4条件，导致这种现象原因可能是酸性条件下dox更易于成盐。含药凝胶的药物释放率(附图6)低于肽类树状大分子(附图5)，这是由于凝胶中药物释放要先经过凝胶降解的过程。

实施例6：细胞毒性

nih3t3细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于24孔板(1ml)，培养24h，加入5μl不同浓度的肽类树状大分子溶液，培养24h后，吸去培养基，每孔加入100μl含10％mtt溶液(5mg/ml，ph＝7.4pbs)的培养基，37℃继续孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μldmso，室温振荡10min，用酶联免疫测定仪于570nm测定吸光度。以未处理的细胞作为对照，计算细胞生存率，细胞生存率(％)＝od570(实验组)/od570(对照组)×100。

结果表明，本发明制备的肽类树状大分子高浓度状态下，细胞存活率大于80％，基本无细胞毒性。(附图7)

实施例7：no生成

raw细胞以5×10³个/孔的密度接种于12孔板，培养24h，加入1μllps(1mg/ml)，孵育8h，加入肽类树状大分子材料(g4-arg)(培养基中肽类树状大分子浓度为2.5mg/ml和5mg/ml)，以空白为阴性对照，以同类型不含精氨酸的肽类树状大分子(g4-lys)为阳性对照，孵育24h，收集上清液，使用no检测试剂盒测定上清液中硝酸盐含量。

结果表明，本发明制备的肽类树状大分子可以使巨噬细胞产生高浓度no。(附图8)

实施例8：体外抗肿瘤活性

使用transwell(0.4μm孔径，24mm直径)研究载药肽类树状大分子的体外抗肿瘤活性。分别将2×10⁵的raw细胞和4t1细胞加入到transwell的上室和下室中。加入2mlrpmi1640培养基，培养过夜。然后向上室中加入1μllps(1mg/ml)，孵育8h，加入载药肽类树状大分子材料(g4-arg/dox)(相当于dox浓度为0.05mg/ml和0.1mg/ml)，以同类型不含精氨酸的载药肽类树状大分子(g4-lys/dox)为对照，孵育24h。用活死细胞染色试剂盒对下室细胞进行染色，激光共聚焦显微镜进行观察。

结果表明，与g4-lys/dox相比，g4-arg/dox对4t1细胞具有更好杀伤效果，且高浓度的载药肽类树状大分子的抗肿瘤效果更好。(附图9)

实施例9：3d肿瘤球渗透评价

含有2％(w/v)琼脂糖的无血清rpim1640培养基，在80℃下加热20分钟，然后灭菌。5×10³4t1细胞接种到用琼脂糖覆盖的6孔板中。在37℃，5％co2环境中培养5天，直到球状体的直径达到300μm。选择紧凑、均匀的球体进行随后的渗透研究。

g4-arg/dox和g4-lys/dox与肿瘤球体共培养48小时。然后，用pbs洗涤两次肿瘤球，用4％多聚甲醛固定20分钟。用激光共聚焦扫描显微镜研究载药肽类大分子的渗透性。

结果表明，与g4-lys/dox相比g4-arg/dox对3d肿瘤球的渗透性更强，可以到达肿瘤球内部，杀伤肿瘤细胞，提高疗效。(附图10)

实施例10：体内抗肿瘤作用

小鼠接种4t1细胞8天后，将荷瘤小鼠随机分组，体积大约为100mm³(第0天)。静脉注射以及皮下注射水凝胶制剂(dox5mg/kg)，n＝6。静注组每两天一次共四次，每两天记录一次肿瘤的大小和小鼠的体重，v＝l×w²/2，l、w分别为肿瘤最大和最小直径。实验结束后，处死小鼠，摘取肿瘤组织和器官进行切片观察。

结果表明，本发明制备的原位药物递送系统与静脉注射药物以及其他对照组相比可有效抑制肿瘤的生长(附图11)，无明显器官毒性(附图12)，且给药次数低于静脉注射给药。材料组与空白对照组结果相比具有一定的治疗效果，表明本发明制备的肽类树状大分子具有免疫治疗作用。

实施例1-10结果表明，本发明构建的一种化疗免疫联合治疗的原位温敏凝胶药物递送系统在降低全身毒性、减少给药次数的同时具有良好的抑瘤效果，在肿瘤治疗方面有着广阔的应用前景。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。