用于肺癌治疗的联合药物的制作方法

本发明属于肺癌治疗领域，涉及阿司匹林和pd-1抑制剂的联合应用，这种联合应用显著提升了两者单独治疗肺癌的效果，产生协同作用。

背景技术：

原发性肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一。据统计，2013年我国主要癌症发病顺位和死因顺位排第一的均是肺癌，肺癌年龄标化病死率高达40.41/10万。目前我国的肺癌发病率以每年26.9％的速度增长，肺癌死亡率在过去三十年间上升了465％,成为我国致死率最高的恶性肿瘤。深圳市慢性病防治中心的统计数据显示，肺癌的发病率与死亡率也是高居恶性肿瘤榜首。戒烟和控制环境污染是预防肺癌的有效措施及基石，但人群依从性及经济发展等问题，限制其广泛应用。利用天然或人工合成的化合物来预防、抑制或逆转癌症的发展，一直是防治恶性肿瘤的研究热点。

aspirin(阿司匹林)，化学名乙酰水杨酸，是20世纪初德国化学家felixhoffman合成的一个结构简单的小分子化合物。阿司匹林是世界上使用最多，使用时间最长(至今已有100多年的使用历史)，且不会产生药物依赖性的非甾体抗炎药。流行病学和临床试验表明，aspirin除了用于解热、抗血小板凝聚等，还可防治包括结大肠癌(crc)、食道癌、肺癌在内的多种肿瘤，是lancet、newenglandjournalofmedcine、jama等权威杂志持续关注的热点。一项包括5项评估日常服用阿司匹林预防心血管事件的随机研究的meta分析显示阿司匹林减少了35％的致命性腺癌风险以及31％的转移性腺癌风险，并减少了当前和随访期中74％的转移风险。本发明人前期的研究表明，作为c0x2抑制剂的阿司匹林可能通过抑制肿瘤新生血管形成，改善肿瘤缺氧微环境，抑制肿瘤干细胞形成而发挥抗肿瘤作用。

pd1(programmedcelldeath1)为cd28超家族成员，主要表达于已被激活的t细胞、b细胞、树突状细胞和单核巨噬细胞膜表面，pd1通过与其配体分子pdl1(programmedcelldeathligand1)相互作用抑制了机体的固有或适应性的免疫应答。临床发现，在肿瘤患者的瘤内和乙肝患者的肝脏中，由于被激活的t细胞表面pd1分子的表达上调，以及ctl释放的干扰素同时上调了靶细胞膜表面pdl1的表达，使得t细胞的杀伤效应受到显著抑制。目前，已经开发出了针对pd1分子的单克隆抗体，用于封闭pd1/pdl1的相互作用，恢复被抑制的t细胞应答。一项pd-1抗体(bms-936558或mdx-1106)的i期临床试验(296例患者)表明，pd-1抗体能使四分之一至五分之一的非小细胞肺癌患者，黑色素瘤患者，或肾细胞癌患者产生客观反应，显示其具有良好的临床应用价值。

在现有治疗药物的基础上如何能进一步提高治疗癌症患者尤其是肺癌患者的有效率，仍然有待解决。

技术实现要素：

本发明人经过深入研究发现，阿司匹林能够与pd-1抗体协同作用，显著提升抗肿瘤作用，尤其是抗肺癌。本发明提供了一种药物组合物以及该药物组合物在制备治疗癌症药物中的用途，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体、阿司匹林和pd1抑制剂，其可更有效的治疗肺癌患者。

优选地，所述pd1抑制剂为pd1抗体。

优选地，pd1抑制剂和阿司匹林的用量比例按照质量计为1～5:2～10；更优选为1:5。

提供一种组合物在制备用于治疗癌症患者的药物中的应用，所述组合物包含在药学上可接受的载体中的阿司匹林和pd1抑制剂。

优选地，其中所述癌症为肺癌。

优选地，所述应用中pd1抑制剂和阿司匹林的用量比例按照质量计为1～5:2～10,更优选为1:5。

本发明获得的有益效果：

pd-1单克隆抗体能恢复被抑制的t细胞应答，而阿司匹林是一种可防治癌症的非甾体抗炎药。发明人创造性的将两者结合使用，通过实验验证，发现两者联合使用能够十分有效的抑制肿瘤的增长，二者的具有协同作用，能够明显地提高pd-1单克隆抗体治疗癌症尤其是肺癌的功效。目前尚无报道表明二者联合应用可取得协同治疗效果。

附图说明

图1为各处理组的肿瘤细胞周期比例。

图2为各处理组的肿瘤细胞凋亡比例。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

pd-1单克隆抗体和阿司匹林联合治疗对小鼠肺癌的抑制作用

本实施例所用的pd-1单克隆抗体购自百时美施贵宝公司。

1、小鼠移植瘤模型建立：

采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。取正常6周龄裸鼠40只，每只老鼠体重约为20g，于裸鼠右侧腹股沟皮下注射a549单细胞悬液5×10⁶个。10d于接种处长出2～3mm瘤时，小鼠移植瘤模型制作成功。

2、分组及处理

造模后小鼠随机分为5组，每组裸鼠8只。阿司匹林和pd-1抗体用pbs溶解，5组分别包括pbs对照组(腹腔注射灭菌pbs1ml/d)，pd-1单抗处理组(腹腔注射1ml2mg/kg/d)，pd-1单抗和阿司匹林联合处理组(pd-1单抗腹腔注射1ml1mg/kg/d和阿司匹林5mg/kg/d)，阿司匹林处理组(1ml阿司匹林10mg/kg/d)，ddp组(化疗药顺铂，腹腔注射ddp15mg/kg/d)，于接种瘤细胞后次日开始给药，连续给药12d。

3、对小鼠肿瘤抑制作用的研究

停药次日并称重处死小鼠，解剖剥离肿瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率。抑瘤率＝[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。

4、实验结果

结果显示，处理组与pbs对照组相比，前者明显抑制了小鼠a549肺肿瘤的生长，pd-1单抗处理组、pd-1单抗和阿司匹林联合处理组、以及阿司匹林处理组的抑瘤率分别为34.53％、61.33％、30.71％。其中，pd-1单抗和阿司匹林联合处理组和其他两组相比，有显著差异(p〈0.05)。说明，pd-1单抗和阿司匹林联合使用抑制肺肿瘤效果要高于其他各组(见表1)。

表1各组对小鼠肺肿瘤的抑制效果

实施例2

pd-1单克隆抗体和阿司匹林联合治疗对肿瘤中血管生成的影响以及细胞周期和凋亡的变化

本实施例所用的pd-1单克隆抗体购自百时美施贵宝公司。

1、小鼠移植瘤模型建立：采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。取正常6周龄裸鼠40只，每只老鼠体重约为20g，于裸鼠右侧腹股沟皮下注射a549单细胞悬液5×10⁶个。10d于接种处长出2～3mm瘤时，小鼠移植瘤模型制作成功。

2、分组及处理

造模后小鼠随机分为5组，每组裸鼠8只。阿司匹林和pd-1抗体用pbs溶解，4组分别包括pbs对照组(腹腔注射灭菌pbs1ml/d)，pd-1单抗处理组(腹腔注射1ml2mg/kg/d)，pd-1单抗和阿司匹林联合处理组(pd-1单抗腹腔注射1ml1mg/kg/d和阿司匹林5mg/kg/d)，阿司匹林处理组(1ml阿司匹林10mg/kg/d)，ddp(化疗药顺铂，腹腔注射ddp15mg/kg/d)，于接种瘤细胞后次日开始给药，连续给药12d。

3、ⅷ因子染色检测小鼠移植瘤血管形成，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率

按免疫组化试剂盒检测小鼠移植瘤血管的形成：常规脱蜡至水；质量分数为3％的h2o2孵育以消除内源性过氧化氢酶活性；先后用枸橼酸盐缓冲液、质量分数为0.1％的胰蛋白酶修复抗原；标本经封闭液作用后,依次滴加适当比例稀释的一抗(ⅷ-rag多克隆抗体)、生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素；dab显色，苏木素复染核；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察血管内皮细胞染色情况。ⅷ因子阳性产物呈棕黄色细颗粒状，定位于血管内皮细胞细胞膜及细胞质。光镜下先以100倍视野选择3个微血管染色最丰富区(新生血管热点区)，然后在200倍视野下计数每一区中的微血管，取其平均值。任何被ⅷ因子染成棕色的内皮细胞或内皮细胞簇必须与邻近微血管、肿瘤细胞和周围结缔组织分界清楚，才可作为1个微血管计数，管腔大于8个红细胞及有较厚肌层的血管不计数，背景中阳性染色的浆细胞、白细胞依据形态排除。

细胞周期及凋亡率检测：将新鲜的肿瘤制成单细胞悬浮液5-10×10⁴/l，离心弃上清，1000g离心5min，弃上清，加入195μl结合液轻轻重悬细胞。加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀，4℃避光孵育15min。可以使用铝箔进行避光。加入5μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，4℃避光孵育5min。同时以不加annexinv-fitc及pi的一管作为阴性对照。注：孵育过程中重悬细胞2-3次以改善染色效果。随即进行流式细胞仪检测，annexinv-fitc对应bd流式细胞仪fl1检测通道；pi-pe对应bd流式细胞仪fl2检测通道。

4、实验结果

结果显示，处理组与pbs对照组相比，处理组明显抑制了小鼠移植瘤的血管形成，pd-1单抗处理组、pd-1单抗和阿司匹林联合处理组、阿司匹林处理组的平均每个视野的微血管数分别为63、41、70。利用spss10软件分析，pd-1单抗和阿司匹林联合用药微血管数少于其他各组，并且达到差异显著性p〈0.05。

对细胞周期和凋亡率分析的结果显示，处理组与pbs对照组相比，可使细胞周期阻滞在s期，抑制肿瘤dna合成，进而抑制肿瘤细胞增殖。pd-1单抗和阿司匹林联合用药组的阻滞作用高于其他各组，其中对照组、pd-1单抗处理组、阿司匹林处理组、pd-1单抗和阿司匹林联合处理组和ddp处理组s期细胞比率分别为14.20％、17.32％、16.14％、23.45％、15.10％。肿瘤细胞凋亡率从大到小依次为pd-1单抗和阿司匹林联合处理组〉pd-1单抗处理组〉阿司匹林处理组〉ddp处理组〉对照组。实验结果见图1-2和表2。

表2各组的肿瘤细胞凋亡率

实施例3

pd-1单克隆抗体和阿司匹林联合治疗小鼠移植肺腺瘤的最佳比例

1、小鼠移植瘤模型建立：采用皮下抑制模型，便于观察肿瘤生长情况。取正常6周龄裸鼠40只，每只老鼠体重约为20g，于裸鼠右侧腹股沟皮下注射a549单细胞悬液5×10⁶个。10d于接种处长出2～3mm瘤时，小鼠移植瘤模型制作成功。

2、分组及处理

造模后小鼠随机分成10组，每组5只，分别命名为1～10组，每组pd-1抗体的使用质量(mg)与阿司匹林的质量(mg)比分别为：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、5:1、4:1、3:1、2:1。于接种瘤细胞后次日开始给药，各组pd-1抗体和阿司匹林的总剂量均为12mg/kg/d，连续给药12d。

3、对小鼠移植肺腺瘤抑制作用的研究

停药次日并称重处死小鼠，解剖剥离肿瘤块，称瘤重，按平均瘤重计算抑瘤率。抑瘤率＝[(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。

4、实验结果

结果显示，实验1～10组的抑瘤率分别为35.31％、36.27％、36.71％、38.33％、45.35％、40.11％、34.32％、36.06％、37.16％、37.50％。其中，pd-1抗体的使用质量(mg)与阿司匹林(mg)比为1:5时，抑瘤效果最佳。说明，pd-1单抗和阿司匹林联合使用最优比例为1:5，1:10的比例次之。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。