一种包含细胞靶向抗体及Poly(I：C)的化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab及其制备方法和应用。

背景技术：

在多种纳米颗粒中，磷酸钙纳米颗粒具有高生物相容性、高生物降解性、体积小以及高亲和力，可与一些核酸共价功能化等特性，因其有可观的应用前景。该纳米颗粒已被用于各种领域,如转染、基因沉默、药物传输、光动力治疗等。一些大分子物质常常无法穿透细胞膜,因此,一个有效的载体如纳米颗粒是必需的。

磷酸钙纳米颗粒的大小约100纳米很容易被细胞摄取，随后溶解在溶酶体中。多项研究证实多壳包裹的磷酸钙纳米颗粒可在免疫学中用途广泛,例如用于预防性和治疗性免疫和特定的b细胞活化。

据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(hbv)，其中约2亿4千万人为慢性hbv感染者，每年约有100万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞肝癌。慢性乙型肝炎是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。目前，慢性乙肝尚缺乏有效的治疗手段，干扰素治疗仅能抑制20-40％慢性乙肝患者病毒复制，核苷类似物的药效也因病毒的耐受性突变而大大降低。近来，越来越多的研究表明，天然免疫识别受体toll样受体(tlr)的激动剂作为免疫调节剂或免疫佐剂，有望成为治疗病毒感染、炎症性疾病和肿瘤的新型药物。

天然免疫针对的主要靶分子称为病原相关分子模式(pamp)，相对应的识别受体称为模式识别受体(prr)。pamp主要指病原体细胞表面的分子或核酸成分，它们在进化中趋于保守，是病原体生存所必须得。来源于病原体的核酸，包括单链和双链rna，是pamp的其中一大类。tlr是prr中的一大家族，tlr3位于细胞内，能够识别病毒的双链rna。人工合成的双链rna类似物聚肌胞胞苷酸(poly(i:c))，为tlr3的配体，能够被tlr3识别并激活tlr3，另外poly(i:c)还能被黑色素瘤分化相关基因5(mda-5)所识别。

tlr3在胞内识别poly(i:c)并被其激活后，能够募集下游的衔接蛋白myd88和trif，tlr3可通过myd88依赖途径诱导炎症性细胞因子如il-1、tnf-α、il-6和il-12的表达，参与非特异性抗病毒反应，同时通过myd88非依赖途径诱导共刺激分子cd80和cd86以及ifn-β、ip-10等抗病毒性细胞因子的表达，参与诱导dc的分化成熟以及抗病毒免疫反应。胞质的mda-5可在线粒体外模被线粒体抗病毒信号蛋白(mavs)所招募。mda-5虽然与tlr3利用的是不同的衔接蛋白，但下游的信号通路是相同的，都能激活一系列的转录因子，包括irf3,irf7和nf-κb，诱导抗炎或促炎因子(il-6,il-10),i型干扰素(ifn-α/β)以及共刺激分子的表达。

相关的实验证实了poly(i:c)在体外刺激肝实质细胞(肝细胞)及肝非实质细胞(kupffer细胞和肝窦内皮细胞)能产生ifn-β并抑制hbv的复制。另外，用poly(i:c)高压水注射治疗hbv感染的小鼠，结果表明通过poly(i:c)治疗能够清除hbv病毒，其清除hbv的作用有依于干扰素的产生，且poly(i:c)的抗病毒作用必须通过高压水注射的方式激活肝内的tlr3。在小鼠模型中可以通过高压水注射的方式激活肝内的tlr3，但这一方法不能用于人类，目前暂时无法有效的将poly(i:c)导入到患者的肝内。因此急需一种有效载体，使得poly(i:c)能够通过静脉注射的方式靶向激活肝内的tlr3。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种以纳米颗粒为载体的包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的新型化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab及其制备方法和医药用途。

本发明第一方面提供了一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab的制备方法，其特征在于，步骤包括：

s1、制备cap/pei：制备pei-磷酸钙纳米颗粒；

s2、制备cap/pei/poly(i:c)：将步骤s1制备得到的pei-磷酸钙纳米颗粒与水溶的poly(i:c)或含荧光素的poly(i:c)混合，15～35℃下搅拌，得到负载有poly(i:c)的pei-磷酸钙纳米颗粒；

s3、制备cap/pei/poly(i:c)/sio2：将步骤s2所得cap/pei/poly(i:c)、四乙氧基硅烷、氨水、溶剂充分混合，15～35℃下搅拌混合液14～18小时，离心分离得到cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒，再将cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒溶解于超纯水中；

s4、将cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒共价功能化，使cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒表面共价结合硫醇基团或氨基基团；

s5、制备cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab：将共价功能化后的cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒加入至活化后的抗体中，所述抗体包括cd146、f4/80、igg1、igg2中的一种，3～5℃下反应20～28小时，离心分离得到cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab纳米颗粒，将cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab纳米颗粒溶解于超纯水中。

本发明的研究中发现，人工合成的双链rna类似物聚肌胞胞苷酸(poly(i:c))可以与tlr3结合，通过激活tlr3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生，纳米颗粒因带有细胞靶向抗体可以作为有效的载体使poly(i:c)靶向到达肝内细胞。纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。因此，本发明中我们将纳米颗粒作为载体与poly(i:c)结合起来，并在此基础上进一步结合了相应的抗体cd146、f4/80、igg1或igg2中的一种。cd146为肝窦内皮细胞(lsec)的表面分子，f4/80为kuppfer细胞(kc)的表面分子，这两种细胞在肝脏非实质细胞中占绝大多数，它们作为肝内的抗原提呈细胞在抗病毒免疫反应中起到了重要的作用。igg1和igg2分别为cd146和f4/80的同型对照抗体。我们利用了这两种细胞的抗体使该种纳米颗粒靶向性地到达特定细胞中，使得其携带的poly(i:c)在肝内发挥抗病毒的效应。并发现带有同型对照igg2抗体的纳米颗粒有最强的抗病毒效应。因此，上述化合物有望开发成为一种预防或者治疗可对体内tlr3信号通路激活起反应的疾病的药物或保健品，本发明也提供了上述化合物的医药用途。

优选的，步骤s1所述制备pei-磷酸钙纳米颗粒的步骤包括：以体积比5:5:7的比例，向超纯水中注入水溶的乳酸钙、(nh4)2hpo4和pei，搅拌。所述水溶的pei浓度为2g/l，水溶的乳酸钙(18mmol/l,ph＝10)、(nh4)2hpo4(10.8mmol/l,ph＝10)；所述超纯水的用量为水溶的乳酸钙体积的四倍。

优选的，步骤s4所述使cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒表面共价结合硫醇基团的步骤包括：制备cap/pei/poly(i:c)/sio2-sh：将三甲氧基甲硅烷溶于溶剂，再向其中加入溶解于超纯水中的cap/pei/poly(i:c)/sio2颗粒，15～35℃下搅拌8～10小时，离心收集沉淀得到cap/pei/poly(i:c)/sio2-sh颗粒，再将cap/pei/poly(i:c)/sio2-sh颗粒溶解于超纯水中。

优选的，所述离心在离心力66000g下超速离心30min。通过超速离心法分离出目标纳米颗粒，用声波破碎法再将目标纳米颗粒溶解于超纯水中。通过以上的方法，未反应的母体化合物以及副产品都能被有效去除掉。

优选的，步骤s5所述活化后的抗体，是使与环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯在15～35℃下混合活化3-4小时所得。

本发明第二方面提供了一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，所述化合物以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有pei，内核表面吸附载有poly(i:c)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯连接细胞靶向抗体，所述细胞靶向抗体包括靶向肝窦内皮细胞的cd146抗体、靶向枯否细胞的f4/80抗体、靶向表达igg1抗体fc受体细胞的igg1同型对照抗体、靶向表达igg2抗体fc受体细胞的igg2同型对照抗体

优选的，化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab采用上述制备方法制备得到。

本发明第三方面提供了包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，或其可药用盐、前药或水合物在制备体内tlr3激动剂中的应用。

本发明第四方面提供了包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，或其可药用盐、前药或水合物在制备预防或治疗可对体内tlr3激动剂起反应的疾病的药物或保健品中的应用。

本发明第五方面提供了一种靶向激活体内tlr3的方法，步骤包括：将表达tlr3的细胞与细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab接触。

本发明第六方面提供了一种药物组合物，组份包括包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab或其可药用盐、前药或水合物；所述药物组合物用于治疗病毒感染性疾病，炎症感染性疾病及肿瘤等。

本发明的有益效果是：本发明将纳米颗粒作为载体与poly(i:c)结合起来，有效将poly(i:c)导入到患者的体内，并在此基础上进一步结合了相应的抗体cd146、f4/80、igg1或igg2中的一种，使该种纳米颗粒靶向性地到达特定细胞中，使得其携带的poly(i:c)在肝内发挥抗病毒的效应，聚肌胞胞苷酸(poly(i:c))与tlr3结合，通过激活tlr3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生。

附图说明

图1为cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2/cd146的抗病毒作用试验结果图；

图2为cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2/igg2的抗病毒作用试验结果图；

图3为cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2/ab清除小鼠血清中hbvdna的试验结果图；

图4为cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠肝脏中分布的试验结果图；

图5为cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠脾脏中分布的试验结果图；

图6为cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠肺脏中分布的试验结果图；

图7为cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠肾脏中分布的试验结果图；

图8为cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠淋巴结中分布的试验结果图；

图9为cap/pei/poly(i:c)/sio2-cd146在小鼠不同组织中分布的统计试验结果图；

图10为cap/pei/poly(i:c)/sio2-igg1在小鼠不同组织中分布的统计试验结果图；

图11为cap/pei/poly(i:c)/sio2-f480在小鼠不同组织中分布的统计试验结果图；

图12为cap/pei/poly(i:c)/sio2-igg2在小鼠不同组织中分布的统计试验结果图；

图13为cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2/ab的制备工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明提供的一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab及其制备方法和应用予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

如本发明实施例所用，下列术语通常旨在具有如下含义，除非达到这种程度使得使用它们的上下文表明不同。下列术语在所有各处都具有指示的含义：

术语“治疗有效量”或“有效量”是指当给予人或非人患者本发明的化合物时，对于提供治疗益处如症状的改善、疾病进展的减缓或疾病的预防有效的量，例如，治疗有效量可以是足以减轻对tlr3激动剂起反应的疾病的症状的量。在一些实施方式中，治疗有效量是足以降低病毒性肝炎的症状的量。在一些实施方式中，治疗有效量是足以降低有机体中可检测的hbsag、hbeag、hbvdna的量。在一些实施方式中，化合物的治疗有效量是足以防止肝炎病毒在患者血液、血清或组织中的可检测水平的显著增加或足以显著降低所述水平的量。在本发明的用于治疗病毒性肝炎的方法中，治疗有效量还可以是当给予患者时足以可检测地减慢疾病的进展、或者防止给药患者存在肝硬化、肝癌的量。在本发明的用于治疗病毒性肝炎的方法中，治疗有效量还可以是足以在患者血液或血清中，在标记蛋白或细胞类型的量中产生可检测的降低的量。例如，在一些实施方式中，治疗有效量是足以显著降低hbsag和hbeag表达的本发明的化合物的量。

术语“激活”指示在生物活性或过程的基线活性中的显著增高。“tlr3的激活”是指相对于不存在本发明的化合物时的tlr3活性，当与本发明的化合物的存在直接或间接响应时tlr3活性的增高。活性的增高可归因于本发明的化合物与tlr3的直接相互作用。例如，本发明的化合物的存在可通过直接结合至tlr3，增强tlr3的活性。

术语“病毒性肝炎”是指由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分病人可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些病人可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。

术语“慢性乙型病毒性肝炎”是指乙肝病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现者。临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状。肝大，质地为中等硬度，有轻压痛。病情重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可异常或持续异常。

术语“对tlr3激动剂起反应的疾病”是指那些可以通过激活tlr3的活性获得治疗益处的疾病，所述治疗益处如症状的改善、疾病进展的延缓、疾病发作的阻止或延迟、或者特定细胞类型(lsec、kc)的异常活性的激活等。

术语“治疗”是指给予机体本发明的化合物，以治疗、减轻、减缓、改变、治愈、影响、改善其疾病、疾病的症状或疾病的前兆。

术语“患者”是指己经作为或将作为治疗、观察或实验的对象的动物，如哺乳动物。本发明的方法可用于人类治疗和兽医应用两者中。在一些实施方式中，患者是哺乳动物；在一些实施方式中，患者是人；而在一些实施方式中，患者是小鼠。

实施例一

本实施例提供了一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，其中，ab为靶向抗体cd146或igg1，所述化合物包括以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有pei，内核表面吸附载有poly(i:c)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯连接抗体cd146或igg1。

上述包含肝内细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，即cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-cd146和cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg1的制备方法包括如下步骤：

该纳米颗粒的制备用了以下化学物品：支链聚乙烯(pei)，乳酸钙，磷酸氢二铵，四乙氧基硅烷(teos)，三甲氧基甲硅烷(mps)，三乙氧基硅烷(aptes)，环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-smcc)；，氨水，交联葡聚糖。

第一步：稳定的pei-磷酸钙纳米颗粒的合成(cap/pei)

以5ml:5ml:7ml的比例，向装有20ml超声水的玻璃瓶中注入水溶的乳酸钙(18mmol/l,ph＝10),(nh4)2hpo4(10.8mmol/l,ph＝10),和pei(2g/l)。搅拌20分钟。

第二步：载有poly(i:c)的cap/pei的合成(cap/pei/poly(i:c))

1ml的cap/pei与100μl水溶的poly(i:c)混合，室温下搅拌30分钟。

第三步：用二氧化硅包装cap/pei/poly(i:c)的外壳(cap/pei/poly(i:c)/sio2)

1ml的cap/pei/poly(i:c)与4ml的乙醇，5μl的teos以及2.6μl的氨水溶液(30-33％)充分混合。在室温下搅拌该反应液16小时。用66,000g，30min的超速离心法分离出该纳米颗粒，用声波破碎法再将该纳米颗粒溶解于1ml的超纯水中。通过以上的方法，未反应的母体化合物以及副产品都能被去除掉(包括未溶解的poly(i:c))。

第四步：使纳米颗粒共价功能化(cap/pei/poly(i:c)/sio2-sh)

使纳米颗粒携带硫醇基团使其共价功能化。5μl的三甲氧基甲硅烷(mps)融入4ml的乙醇中。将1ml的纳米颗粒加入其中并在室温下搅拌8-10小时。通过66,000g，30min的超速离心法收集功能化的纳米颗粒，丢弃上清，沉淀溶于1ml的超纯水中，溶液即为cap/pei/poly(i:c)/sio2-sh纳米颗粒。

第五步：纳米颗粒共价结合不同的抗体(cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab)

150μl的抗体(anti-cd146或anti-igg1)与40μl的环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-smcc)在室温下混合3-4小时，使抗体活化。将1mlcap/pei/poly(i:c)/sio2-sh纳米颗粒加入活化的抗体在4℃下再反应24小时。结合反应后通过66,000g，30min的超速离心法收集纳米颗粒，并将沉淀溶解于1ml的超纯水中，得到cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-cd146和cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg1纳米颗粒。

实施例二

本实施例提供了一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，其中，ab为靶向抗体f4/80或igg2，所述化合物包括以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有pei，内核表面吸附载有poly(i:c)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯连接抗体f4/80或igg2。

上述包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，即cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-f4/80和cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg2的制备方法与实施例一基本相同，区别在于：

第五步：纳米颗粒共价结合不同的抗体(cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab)

150μl的抗体(anti-mousef4/80或anti-mouseigg2)与40μl的环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-smcc)在室温下混合3-4小时，使抗体活化。将1mlcap/pei/poly(i:c)/sio2-sh纳米颗粒加入活化的抗体在4℃下再反应24小时。结合反应后通过66,000g，30min的超速离心法收集纳米颗粒，并将沉淀溶解于1ml的超纯水中，得到cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-f480和cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg2纳米颗粒。

实施例三

本实施例提供了一种包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，其中，ab为靶向抗体cd146、f4/80、igg1或igg2，所述化合物包括以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有pei，内核表面吸附载有poly(i:c)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳通过环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯连接抗体cd146、f4/80、igg1或igg2。

上述包含细胞靶向抗体及poly(i:c)的化合物cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-ab，即cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-cd146，cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-f4/80，cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg1和cap/pei/poly(i:c)/sio2-s-igg2的制备方法与实施例一基本相同，区别在于：

第二步：载有poly(i:c)的cap/pei的合成(cap/pei/poly(i:c))

1ml的cap/pei与100μl水溶的含荧光素的poly(i:c)-cy5混合，室温下搅拌30分钟。

本实施例中采用的poly(i:c)-cy5还可用poly(i:c)-tritc替代。

实施例四

本实施例对cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-ab的抗病毒作用进行了试验，采用的cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-cd146和cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-igg1为实施例一制备得到，cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-f480和cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-igg2为实施例二制备得到，试验具体包括：

1.1实验材料：

雄性c57bl/6小鼠(6-8w)购自中国斯莱克景达实验动物有限公司。

hbsag和hbeagelisa试剂盒购自中国上海科华生物工程股份有限公司。

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒购自中国湖南圣湘生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1慢性乙肝小鼠模型的建立

选用spf级别雄性c57bl/6小鼠(6-8w)小鼠，用尾静脉高压水注射的方式给与paav-hbv1.2质粒，建立慢性hbv复制小鼠模型。14天后分别给与小鼠尾静脉常速注射生理盐水(阴性对照)、带有不同抗体的纳米颗粒以及尾静脉高压水注射poly(i:c)(阳性对照)。

1.2.2样品收集

收集各组小鼠的血清，通过hbsag和hbeagelisa试剂盒检测小鼠血清hbsag和hbeag的表达。通过乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒用rt-pcr的方法检测cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-ab对小鼠体内hbvdna复制的影响。

1.2.3统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，采用graphpadprism6统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，两两比较采用dunett法，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

1.3实验结果

实验结果如图1～3所示，其中，图1、cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-cd146能靶向激活带有cd146免疫细胞的tlr3，抑制血清hbsag、hbeag的表达。用paav-hbv1.2尾静脉高压水注射至小鼠体内，14天后尾静脉常速注射相应纳米颗粒(poly(i:c)组高压水注射)，elisa检测血清中hbsag、hbeag的表达。图2、靶向到细胞表面fcr受体的cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-igg2能靶向激活带有igg2免疫细胞的tlr3，抑制血清hbsag、hbeag的表达。用paav-hbv1.2尾静脉高压水注射至小鼠体内，14天后尾静脉常速注射相应纳米颗粒(poly(i:c)组高压水注射)，elisa检测血清中hbsag、hbeag的表达。图3、cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-ab抑制血清hbvdna的复制。用paav-hbv1.2尾静脉高压水注射至小鼠体内，14天后尾静脉常速注射相应纳米颗粒(poly(i:c)组高压水注射)，rt-pcr检测血清中hbvdna表达。

结果表明，对感染hbv的小鼠尾静脉常速注射cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-cd146、cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-igg2能抑制小鼠体内hbsag和hbeag的表达以及hbvdna的复制。且cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-s-igg2纳米颗粒抗病毒的作用最强。

实施例五

本实施例对cap/pei/poly(i:c)/sio2-ab在小鼠不同组织器官分布进行了试验，具体包括：

1.1实验材料：

雄性c57bl/6小鼠(6-8w)购自中国斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2实验方法

1.2.1小鼠尾静脉注射纳米颗粒

选用spf级别雄性c57bl/6小鼠(6-8w)小鼠，给与小鼠尾静脉常速注射生理盐水(阴性对照)以及带有不同抗体的纳米颗粒。

1.2.2处死小鼠，收集肝、脾、肺及淋巴结组织。

选用spf级别雄性c57bl/6小鼠(6-8w)小鼠，注射生理盐水或纳米颗粒1小时和3小时后，处死小鼠收集小鼠的肝、脾、肺淋巴结组织。

1.2.3各组织冰冻切片的制备。

将上诉收集的小鼠肝、脾、肺肾及淋巴结组织冻于液氮中，用冻存液包裹并制成冰冻切片。

1.2.4荧光显微镜观察

将上诉切好的冰冻切片，在共聚焦显微镜下观察纳米颗粒的分布。

1.2.5统计学处理

实验数据均用平均值±标准误表示，采用graphpadprism6统计软件进行分析，以one-wayanova方式进行方差分析，两两比较采用dunett法，p<0.05为具有统计学显著性差异标准。

1.3实验结果

实验结果如图4-10所示，红色的亮点为组织中摄取的带有cy-5荧光的纳米颗粒，cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-ab主要分布于肝组织中，其他组织中纳米颗粒分布较少。在1小时内cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-ab迅速到达肝脏，3小时后，肝组织的纳米颗粒减少，而肺组织中的纳米颗粒增多。

结果表明，对小鼠尾静脉常速注射cap/pei-cy5/poly(i:c)/sio2-ab纳米颗粒后，该纳米颗粒最倾向于到达肝组织，其余组织分布较少。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。