槲皮素和姜黄素联合用药在制备治疗前列腺炎产品中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种槲皮素和姜黄素联合用药在制备治疗前列腺炎产品中的应用。

背景技术：

前列腺炎是成年男性的常见疾病，特别是慢性非细菌性前列腺炎，其发病机制尚不明确，临床缺乏有效的治疗手段，给患者和医生造成了巨大的困扰和挑战。因此，寻找新型、有效的治疗前列腺炎药物，具有重要的科研和临床价值。

槲皮素和姜黄素具有相似的抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用，见于多种炎性疾病的基础研究，如肺纤维化、肝炎、缺血再灌注损伤等，但是在治疗前列腺炎领域涉及甚少，且槲皮素和姜黄素联合用药的研究尚未见文献报道。本发明创新性地应用联合治疗方法，探究了槲皮素联合姜黄素在治疗前列腺炎中的作用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供槲皮素和姜黄素的用途。

本发明提供了槲皮素和姜黄素在制备治疗动物或人前列腺炎产品中的应用。

本发明还提供了槲皮素和姜黄素在制备降低动物或人前列腺组织的前列腺指数产品中的应用。

本发明还提供了槲皮素和姜黄素在制备降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的炎症评分产品中的应用。

本发明还提供了槲皮素和姜黄素在制备降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的中cd3染色阳性细胞数量产品中的应用。

本发明还提供了槲皮素和姜黄素在制备降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的中cd45染色阳性细胞数量产品中的应用。

上述应用中，所述槲皮素以槲皮素混悬液的形式存在；所述姜黄素以姜黄素混悬液的形式存在；

或所述动物为大鼠。

槲皮素混悬液为槲皮素按10mg/ml比例溶解于质量百分含量25％羟丙基-β-环糊精母液，得到槲皮素混悬液；

姜黄素混悬液为姜黄素按10mg/ml比例溶解于质量百分含量25％羟丙基-β-环糊精母液，得到姜黄素混悬液；

25％羟丙基-β-环糊精母液：将100g羟丙基-β-环糊精溶解于双蒸水，定容至400ml，制成质量百分含量25％羟丙基-β-环糊精母液，4℃保存备用；

本发明第二个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为槲皮素和姜黄素或槲皮素混悬液和姜黄素混悬液。

所述产品中，所述槲皮素和所述姜黄素的质量比为1:1；

或所述槲皮素混悬液中槲皮素的浓度为10mg/ml；

所述姜黄素混悬液中姜黄素的浓度为10mg/ml；

或所述产品具有如下1)-5)中至少一种功能：

1)治疗动物或人前列腺炎；

2)降低动物或人前列腺组织的前列腺指数；

3)降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的炎症评分；

4)降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的中cd3染色阳性细胞数；

5)降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的中cd45染色阳性细胞数。

所述产品中，所述动物为大鼠。

本发明第3个目的是提供一种治疗动物或人前列腺炎的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将槲皮素和姜黄素给药患有前列腺炎的动物或人，实现治疗动物或人前列腺炎的目的。

上述方法中，所述槲皮素和姜黄素的给药剂量为各50mg/kg/天。

本发明槲皮素和姜黄素联合用药为临床开发新型治疗慢性前列腺炎药物提供基础，为临床治疗慢性前列腺炎提供新的可行的方法。

附图说明

图1为大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型建立过程。

图2为各组前列腺指数。

图3为各组he染色结果。

图4为各组炎症评分结果。

图5为各组cd3染色结果。

图6为各组cd3染色阳性细胞数量分析。

图7为各组cd45染色结果。

图8为各组cd45染色阳性细胞数量分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、槲皮素和姜黄素联用对前列腺炎动物模型用药

一、大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型的构建(《大鼠非细菌性前列腺炎模型的复制》杨小荣等，实验与检验医学)

1)、实验动物：6-8周龄雄性sd大鼠30只，体重260-280g，常规饲养1周后进行实验。

2)、动物分组：随机分为正常组、对照组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组，每组6只。

3)、构建大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型：对照组和3个治疗组大鼠，以6％水合氯醛0.5ml/kg腹腔麻醉，碘伏消毒腹部皮肤，取下腹部正中纵行切口约1cm，打开腹腔，用棉签于膀胱下方找到前列腺并暴露良好，于前列腺腹叶注入完全弗氏佐剂(cfa)0.1ml，生理盐水冲洗防止粘连，以可吸收线逐层缝合切口，碘伏消毒皮肤。

以上为大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型构建过程(图1)。

二、给药处理

25％羟丙基-β-环糊精母液：将100g羟丙基-β-环糊精溶解于双蒸水，定容至400ml，制成质量百分含量25％羟丙基-β-环糊精母液，4℃保存备用；

槲皮素混悬液或姜黄素混悬液的配置：准确秤量适量槲皮素或姜黄素，按10mg/ml比例溶解于25％羟丙基-β-环糊精母液，得到槲皮素混悬液或姜黄素混悬液；

给药量：大鼠用药量为50mg/kg/d，即按5ml/kg剂量给药。

正常组：将雄性sd大鼠常规饲养；

对照组：将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予用药组等量溶剂(即25％羟丙基-β-环糊精母液)灌胃处理；

槲皮素治疗组：将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予槲皮素混悬液50mg/kg/d灌胃；

姜黄素治疗组：将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予姜黄素混悬液50mg/kg/d灌胃；

联合用药组：将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予槲皮素混悬液和姜黄素混悬液各50mg/kg/d灌胃。

以上各组自建模第2天连续用药30日。

三、检测

将上述各组所有sd大鼠在处理30d称重后处死，取前列腺组织称湿重，计算前列腺指数；前列腺组织常规4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，分别进行he染色和cd3、cd45免疫组化染色。

1、计算前列腺指数

前列腺指数＝前列腺湿重(mg)/大鼠体重(10g)，反映炎症程度的大体指标。

结果如图2，对照组前列腺指数较正常组明显升高，用药后前列腺指数呈不同程度下降，两药联用优于单药效果。*：正常组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)；#：联合用药组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)。

2、he染色

各组前列腺组织常规4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，分别进行he染色：

1)、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ10min-无水乙醇ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。

2)、苏木素染细胞核：切片入harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。

3)、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。

4)、脱水封片：将切片依次放入95％酒精i5min-95％酒精ii5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

5)、显微镜镜检，图像采集分析。

染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色。

结果如图3所示，上图从左到右依次为正常组和对照组，下图从左到右依次为槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组，可以看出，正常组几乎没有炎症；对照组炎症表现最重；槲皮素组较姜黄组组好；两药联用组炎症最轻，优于单药处理组。

将各组前列腺组织通过组织学评分进行评价，采用双盲的方法对每个腺体的几个切面进行评分，用总的评分除以切面数获得最终评分，具体如下：

用0-4分代表炎症程度(常规he染色)：

0分：无炎症；

1分：轻度，但明确的血管周围单个核细胞套状聚集(浸润)；

2分：中度的血管周围单个核细胞浸润；

3分：显著的血管周围单个核细胞浸润，出血，以及少量间质内单个核细胞浸润；

4分：显著的血管周围单个核细胞浸润，出血，以及大量间质内单个核细胞浸润。

炎症评分结果如图4所示，可以看出，与对照组或单独用药组相比，联合用药组降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的炎症评分，正常组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)(*)；联合用药组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)(#)。

3、免疫组化染色

1)、cd3染色

各组前列腺组织常规4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，分别进行cd3染色：

(1)、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

(2)、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(3)、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1:9)，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

(4)、bsa封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。

(5)、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按1:100比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

(6)、加二抗：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记)覆盖组织，室温孵育50min。

(7)、dab显色：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

(8)、复染细胞核：harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

(9)、脱水封片：将切片依次放入75％酒精6min-85％酒精6min--无水乙醇ⅰ6min-无水乙醇ⅱ6min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

(10)、显微镜镜检，图像采集分析。

cd3是反映炎症浸润组织中t细胞数的标志，大部分间质浸润的炎症细胞cd3着色。统计方法：每组随机选3只大鼠做cd3免疫组化染色，每张片子在400×镜下随机选5-8个视野计算阳性细胞数，计算均值，再计算组内均值。

结果如图5所示，上图从左到右依次为正常组和对照组，下图从左到右依次为槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组，可以看出，两药联用组cd3染色程度最低。

分析各组cd3染色阳性细胞数结果如图6所示，可以看出，槲皮素和姜黄素治疗组cd3阳性细胞数均比模型对照组降低，联合用药组最少。#：联合用药组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)。

2)、cd45染色

cd45是b淋巴细胞标志，间质浸润的单个核细胞只有少部分cd45着色。

各组前列腺组织常规4％多聚甲醛固定、脱水、包埋，分别进行cd45染色(染色方法同cd3染色，替换为cd45一抗，稀释比例1:3000)。

统计方法：每组随机选3只大鼠做cd45免疫组化染色

每张片子在400×镜下随机选5-8个视野计算阳性细胞数，计算均值，再计算组内均值。

结果如图7所示，上图从左到右依次为正常组和对照组，下图从左到右依次为槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组，可以看出，同cd3，两药联用组cd45染色程度最低。

分析各组cd45染色阳性细胞数结果如图8所示，可以看出，槲皮素、姜黄素、槲皮素+姜黄素治疗组cd45染色阳性细胞数均比对照组下降，联合用药组下降程度最高。#：槲皮素治疗组、姜黄素治疗组、联合用药组与对照组相比有统计学差异(p<0.05)。