硫酸化半乳寡糖的应用及药物组合物的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及硫酸化半乳寡糖在预防和治疗帕金森疾病中的应用。

背景技术：

随着人类平均寿命的逐年增加，世界正步入全球老龄化时代。与年龄有关的神经退化性疾病也随之增加，在中枢神经系统方面，主要表现为兴奋与抑制过程减弱，大脑功能降低，记忆力减退和丧失，随后出现识别功能的进行性减退和情绪紊乱的加重等。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种多发于50岁以上中老年人的神经系统退变性疾病。PD以运动障碍为主要表现，典型病理改变是黑质纹状体多巴胺能神经元变性或死亡，导致姿势平衡障碍、肌僵直、静止性震颤、运动迟缓等临床特征。这类疾病致残率高、病程长，对患者及其家庭带来沉重的负担，且随着人口老龄化的增加，PD患者的数量也呈递增趋势，因此，PD的防治问题迫在眉睫。目前，导致多巴胺神经元损伤的具体原因还不确定，但越来越多的研究显示，由氧化应激、免疫炎症因子过度产生、线粒体呼吸链障碍及泛素降解系统紊乱等导致的凋亡参与了PD的发生和/或发展。帕金森病对患者、家庭和社会都带来巨大的压力，使得全世界对其给予众多的关注，帕金森病等神经退行性疾病的治疗药物研究成为老年医学领域中的一个重要课题。

近年来，糖类药物从其药效和安全性方面考虑，其发展趋势逐渐从对多糖的研究转到对低聚糖和寡糖的研究。寡糖在医疗保健领域具有巨大的需求空间。寡糖类药物结构均一，质量可控，作用机制明确，已经成为糖类药物的主攻方向之一。中科院海洋所张全斌等已报道甘露葡萄糖醛酸寡糖在制备治疗或预防帕金森病方面有较显著地作用；

中国海洋大学已发现还原端为羧基的寡聚甘露糖醛酸HS971具有显著的改善记忆和抗老年痴呆效果。

本专利报道了一种硫酸化半乳寡糖在细胞和动物实验中对帕金森病具有显著的治疗作用，可以应用于帕金森病预防和治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种硫酸化半乳寡糖在预防和治疗帕金森疾病中的应用，硫酸化半乳寡糖可用于保护神经细胞、预防和治疗帕金森疾病的药物或者制品中。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种硫酸化半乳寡糖在治疗帕金森疾病中的应用，所述的寡糖是是指聚合度为2-10，由3-连接的β-D-半乳糖和4-连接的α-L-半乳糖-6-硫酸基交替连接的硫酸化半乳寡糖。

所述药物为包含硫酸化半乳寡糖以及其它药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。

载体包括海藻酸钠微球、脂质体等。

赋形剂：如甘露醇、硬脂酸镁、淀粉、环糊精等。

所述药物的剂型为注射剂、口服制剂或局部给药制剂。

本发明在硫酸化半乳寡糖的抗凋亡及调节PI3K/Akt信号通路方面进行了深入而全面的研究，发现硫酸化半乳寡糖对MPTP诱导的神经损伤有保护作用，即硫酸化半乳寡糖可在制备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用。

所述硫酸化半乳寡糖作为活性成份可应用在制备预防和/或治疗帕金森疾病的药物、保健食品、或特殊医学用途配方食品、或功能性食品中本发明的优点：

1、与现有的抗神经退行性疾病的药物相比，硫酸化半乳寡糖具有良好的生物相容性，可以长期服用，且在药用剂量范围内无明显毒副作用。

2、本发明产品具有毒副作用小、安全有效等诸多优点，在防治帕金森病方面具有广阔的开发应用前景。

附图说明

图1硫酸化半乳寡糖的HPLC分析谱图。

图2硫酸化半乳寡糖对PC12神经细胞活性的影响。

图3硫酸化半乳寡糖对PD小鼠小鼠行为学的影响。

图4硫酸化半乳寡糖对PD小鼠DA，5-HT及其代谢产物的影响。

图5硫酸化半乳寡糖对PD小鼠细胞凋亡的影响。

图6硫酸化半乳寡糖对PD小鼠PI3K/Akt信号通路的影响。

图7硫酸化半乳寡糖对PD小鼠NGF/TrkA表达的影响。

图8硫酸化半乳寡糖对PD小鼠TH，DAT及DRD2的影响。

图9硫酸化半乳寡糖对PD小鼠MAO-B及α-synuclein的影响。

图10硫酸化半乳寡糖对PD小鼠TNF-α，IL-1β及GFAP的影响。

图11硫酸化半乳寡糖对PD小鼠多巴胺能神经元的影响。

具体实施方式

下面本发明将通过实施例进行具体说明。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方

式限制本发明的范围。

实施例1：硫酸化半乳寡糖的制备

将100g伊谷草加其40倍质量的水，120℃提取4h，过滤后用90℃热水冲洗两次，合并滤液，浓缩至原体积的1/6后透析，透析后的液体再次浓缩至原体积的1/12。然后加入体积浓度90％的乙醇，使乙醇终体积浓度为75％。静置过夜后离心，下层沉淀以水溶出后，冷冻干燥，即为半乳聚糖粗提物。将上述多糖溶于水配制成质量浓度2.5％的溶液加4mol/L硫酸溶液终浓度为0.5mol/L，于80℃搅拌反应3h，然后加入饱和氢氧化钡中和至中性，离心得上清，上清液采用截留分子量为2000道尔顿的透析袋进行透析，收集透析透过液，浓缩干燥后得硫酸化半乳寡糖，附图1为样品的聚合度分析谱图，可以看出硫酸化半乳寡糖主要包括9个聚合度的寡糖洗脱峰，其聚合度为2-10，对样品进行ESI-MS分析，可以看出硫酸化半乳寡糖为3-连接的β-D-半乳糖和4-连接的α-L-半乳糖-6-硫酸基交替连接的硫酸化半乳寡糖，其聚合度为2-10。

表1硫酸化半乳寡糖组成分析

实施例2：硫酸化半乳寡糖对6-OHDA诱导PC12细胞的影响

本实施例采用实施例1所得的硫酸化半乳寡糖。寡糖以水剂形式处理，药液配置的具体操作如下：(1)准确称取40.0mg寡糖，溶于1mL 0.01M磷酸盐缓冲液中(PH7.2-7.4)；(2)用孔径0.22μm的针式滤器对前述药液进行过滤处理，得到为无菌的寡糖贮存液；(3)将上述贮存液分装后，于-80℃保存，用于以下实施例中。

主要操作如下：

本发明以细胞存活率为指标，研究了硫酸化半乳寡糖对6-OHDA损伤的神经细胞PC12细胞的保护作用。

材料：大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞，采用含5％胎牛血清、10％马血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM高糖培养液，置于37℃、含5％CO2的培养箱中培养。

方法：试验分为对照组、6-OHDA损伤组、硫酸化半乳寡糖阳性对照组和硫酸化半乳寡糖给药组，寡糖样品处理浓度分别采用50、100和200μg/mL，每组6孔，37℃、含5％CO2培养箱中孵育24h贴壁后，硫酸化半乳寡糖给药处理12h，然后75μM 6-OHDA处理24h，加入10μL CKK-8溶液，37℃孵育40min，用酶标仪(Diagnostic Pasteur LP400)测定490nm处光密度值(OD)。

图2为硫酸化半乳寡糖对6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用的结果。上述测定结果提示，6-OHDA对细胞的损伤率为(48.54±4.43)％。测试的硫酸化半乳寡糖均对6-OHDA诱导的神经细胞损伤具有明显的修复作用，细胞活力有均有明显改善，体系出良好的神经保护作用。

实施例3：硫酸化半乳寡糖对MPTP诱导PD小鼠的影响

本实施例采用实施例1所得的硫酸化半乳寡糖。MPTP是一种脂溶性的神经毒素，可以穿过血脑屏障经B型单胺氧化酶(MAO-B)转化为MPP+，经DA转运体摄取后抑制线粒体呼吸链复合体I进而损伤DA能神经元，是目前应用较为广泛的帕金森模型。

主要操作如下：

寡糖以水剂形式给药，药液配置的具体操作如下：(1)准确称取40.0mg寡糖，溶于150ml生理盐水中；(2)用孔径0.22μm的针式滤器对前述药液进行过滤处理，得到为无菌的寡糖贮存液；(3)将上述贮存液分装后，于-80℃保存，用于以下实施例中。

C57BL/6小鼠(体重：20±2g，8周龄左右)：SPF级小鼠适应环境一周后，将其称重并随机分为5组，即对照组、模型组、硫酸化半乳寡糖低、高(25、50mg/kg)2个剂量组，阳性对照药美多巴(70mg/kg)组。除对照组外，小鼠腹腔注射(20mg/kg小鼠体重)连续7天，对照组给予同等剂量的生理盐水。随后，硫酸化半乳寡糖低、高(25、50mg/kg)组给予25、50mg/kg腹腔注射7天，美多巴组(70mg/kg)给予腹腔注射7天，模型组及对照组给予同等剂量的生理盐水。本实验分别于第14天及第21天进行行为学检测。

(1)行为学实验：

爬杆实验：爬杆实验：取一50厘米长、直径为1厘米的垂直木杆，顶端放置一圆形球状体，木杆缠以防滑胶带，将小鼠头朝上放置在圆球顶端，记录小鼠自球顶端至头完全向下所耗时间为潜伏期(T-turn)及至小鼠爬至杆底端后肢着地所用时间为总耗时间(T-total)。每只小鼠每次进行3次测定，取其平均值。

悬挂实验:取一粗糙电线将小鼠前爪横挂在上面,两后爪均能挂住记3分,一后爪能挂住记2分,两爪均不能挂住记1分。每只小鼠每次进行3次测定,取其平均值。

旷场实验：将小鼠放置在44*44cm的塑料箱内，上面放一个带有记录功能的摄像机，记录小鼠5min内的行为轨迹。

(2)高效液相-电化学法(HPLC-ECD)法对小鼠纹状体中DA、NE、5-HT及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)进行了计算及统计学分析。

(3)完成动物行为学观察后，各组取4只，10％水合氯醛进行麻醉，生理盐水+4％多聚甲醛灌流后取脑，并在4％多聚甲醛中固定24小时，依次转至20％、30％蔗糖溶液中脱水，做连续冠状冰冻切片，片厚16μm。参照常规免疫组化方法，检测Bcl-2、Bax、pPI3K、pAkt的变化情况。(4)取5只小鼠左侧纹状体，用蛋白裂解液提取蛋白，用Western blot蛋白免疫印迹法检测Bcl-2、Bax、Cytc、cleaved-caspase-3、PARP、TH、DRD2、TNF-、IL-1、pPI3K、PI3K、pAkt、Akt、β-actin蛋白表达量。

(5)取5只小鼠左侧纹状体，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定MAO-B及α-synuclein的表达。

图3结果表明，MPTP处理后小鼠开始出现静止震颤、运动减少，反应迟缓的PD样运动障碍表现，个别出现后肢张开、竖毛等改变，而硫酸化半乳寡糖在25mg/kg及50mg/kg时对MPTP诱导的行为障碍均有显著地改善作用。

图4结果表明，MPTP处理后小鼠DA含量降低，(DOPAC+HVA/DA)比值升高。DA代谢速率增快，代谢产物增多，多见于DA能神经元不完全损伤时。硫酸化半乳寡糖降低了(HVA+DOPAC)/DA的比值，说明其能降低DA代谢更新速率，保护DA能神经元。同时，硫酸化半乳寡糖也增加了5-HT及其代谢产物HIAA的含量，但对NE的含量无明显变化。

图5结果显示，MPTP处理导致促凋亡因子Bax升高，抑凋亡因子Bcl-2降低，同时激活了caspase-3及PARP。硫酸化半乳寡糖作用后，抑制了Bax/Bcl-2的比值，同时下调了caspase-3及PARP的表达，表明硫酸化半乳寡糖能显著抑制MPTP小鼠的细胞凋亡的发生。

图6结果显示，MPTP小鼠磷酸化PI3K，Akt及GSK3β表达量降低，且与对照小鼠呈显著性统计学差异。硫酸化半乳寡糖处理后，显著提高了磷酸化PI3K，Akt及GSK3β的表达量，表明硫酸化半乳寡糖调节PI3K/Akt信号通路，对多巴胺神经元有保护作用。

图7结果显示，MPTP小鼠NGF和TrkA磷酸化水平降低，且与对照小鼠呈显著性统计学差异。硫酸化半乳寡糖处理后，显著提高了NGF和TrkA磷酸化，表明硫酸化半乳寡糖调节PI3K/Akt信号通路，对多巴胺神经元有保护作用。

图8结果表明，腹腔注射MPTP后，小鼠纹状体TH及DAT蛋白表达较对照组明显减少，连续给药7天后，硫酸化半乳寡糖给药组TH及DAT表达量比MPTP模型组动物明显增多，经统计差异有显著意义。同样，硫酸化半乳寡糖显著提高了DRD2的表达量。

己有研究表明MPTP可以导致MAO-B水平的升高及α-synuclein蛋白的聚集，从而发挥细胞毒性作用。图9结果表明，硫酸化半乳寡糖能明显抑制MPTP引起的α-synuclein积累和MAO-B的过度表达。

图10结果显示，MPTP小鼠纹状体中TNF-α,IL-1β及GFAP与生理盐水对照组相比显著升高，而25mg/kg和50mg/kg硫酸化半乳寡糖腹腔注射可以显著抑制MPTP小鼠炎症因子的释放，结果具有统计学意义。

图11结果表明，腹腔注射MPTP后，Nissl神经元细胞大量减少，与生理盐水对照组相比呈显著性统计学差异。硫酸化半乳寡糖组细胞形态趋于正常，结构完整，数目明显多于MPTP组。