化合物MLN4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用的制作方法

本发明涉及化合物MLN4924的新用途，特别是涉及化合物MLN4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用。

背景技术：

近年来，由于全球气候变化等因素，我国曾经发生过几起对人类健康造成极大危害传染性疾病，如手足口病、禽流感、SARS、猪链球菌病等。这些高传染性疾病对我国的社会、经济和国家安全提出了严峻挑战，对这些高危病原体的科学研究有效预防手段具有一定的重要性和紧迫性。新发传染性病特异性治疗药物和疫苗的研究对我国传染病的预防和控制至关重要。

2009年以来，各大媒体连接报道河南等多地发生蜱咬引发以发热为主要临床特征的疾病流行，引发社会各界的广泛关注。卫生部专家在各地开展病原分离与现场调查工作，2008年目标被锁定为人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmisis,HGA)。2011年，中国疾病预防控制中心病毒所在《The New England Journal of Medicine》发表了相关最新研究成果，鉴定了自2009年以来在我国中部蜱咬病的真正“元凶”，即引起发热伴血小板减少征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)的新型布尼亚病毒，并命名为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTS virus，SFTSV),发病初期病死率高达30％。

布尼亚病毒通常为具有包膜的球形负链RNA病毒，直径约为80-120nm，表面具有糖蛋白突起。布尼亚病毒科具有350多个病毒成员，是虫媒病毒中数最多的一科，分为5个属，其中4个能感染人和动物，包括白蛉病毒属(Phlebovirus)、布尼亚病毒属(Bunyavirus)汉坦病毒属(Hantavirus)和内罗病毒属(Nairovirus),以及一个至今仅发现感染植物的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。除了汉坦病毒属的病毒通过啮齿类与食虫类动物传播外，其他4个属的病毒均由蚊、白蛉、蜱、蠓、蓟马等节肢动物传播。

SFTSV主要传播途径为蜱虫叮咬，最近的一些病例表明接触可能为其传播途径之一。SFTS的发病机理尚不明确，该病毒具有泛嗜性，对血液系统内脏消化道等都有侵犯，主要表现为发热，血小板显著减少，白细胞减少，严重者出现多脏器衰竭而死亡。然而，该新型布尼亚病毒SFTSV感染引起的疾病具有病程进展快速、疾病后果危重，并且能通过动物媒介和接触传播的特点，极可能引起局部地区的爆发流行，而造成突发的公共卫生事件。由于对新型布尼亚病毒SFTSV感染的致病机制认识有限，缺乏成熟的治疗手段，而且目前该类病毒在国内部分地区和日本、韩国乃至美国仍不断涌现。因此，对于新型布尼亚病毒SFTSV特效治疗药物或疫苗的研究迫在眉睫。

化合物MLN4924(Pevonedistat)是选择性NEDD8活化酶(NAE)的小分子抑制剂，它是AMP类似物，主要通过形成NAE-MLN4924复合物抑制NAE活性，从而抑制部分依赖于Cullin-Ring E3 ligase(CRL)酶的蛋白质泛素化降解途径。此前，关于MLN4924的研究报道多集中于其通过阻滞细胞周期或引起细胞凋亡而发挥其抗肿瘤特性，关于其抗病毒作用极其机制目前尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供化合物MLN4924(Pevonedistat)在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用。

本发明的技术方案概述如下：

化合物MLN4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用,所述化合物MLN4924为式(I)所示结构：

所述布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)或西西里白蛉热病毒(SFSV)。

本发明的优点：

实验证明，化合物MLN4924能抑制布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒中的发热伴血小板减少综合征病毒或西西里白蛉热病毒。本发明发现SFTSV非结构蛋白NSs特异性结合宿主细胞干扰素途径中关键蛋白-视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I(RIG-I)，并通过泛素化途径降解RIG-I。此特异性结合和降解，抑制宿主β干扰素启动子的活性，阻断宿主β干扰素的产生，使SFTSV逃逸宿主干扰素相关的天然免疫防御机制。MLN4924，抑制部分依赖于Cullin-Ring E3 ligase(CRL)酶的蛋白质泛素化降解途径，可通过抑制SFTSV NSs介导的RIG-I泛素化降解，从而使宿主细胞在病毒感染时激活干扰素抗病毒途径，明显抑制病毒的复制和增殖。

附图说明

图1为发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)和西西里白蛉热病毒(SFSV)非结构蛋白NSs抑制β干扰素启动子活性。

图2：SFTSV和SFSV的NSs降解宿主天然免疫关键蛋白视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I(RIG-I)。

图3:MLN4924抑制SFTSV SFSV NSs介导的RIG-I降解。

图4：MLN4924抑制细胞内SFTSV复制。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1、质粒构建

通过包括以下步骤的方法进行质粒构建

发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)、西西里白蛉热病毒(SFSV)非结构蛋白cDNA合成

根据GENBANK基因序列号SFTSV(GI:747024328)、SFSV(GI:334035)检索基因序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成SFTSV和SFSV非结构蛋白NSs的cDNA序列。

目的基因的扩增

根据SFTSV和SFSV非结构蛋白NSs基因序列，设计NSs特异引物，上游引物酶切位点为Sal1，下游引物酶切位点选择BamH1，在下游引物末端加入HA标签。以cDNA为模板，按PCR说明书体系进行目的基因的扩增。

PCR产物胶回收

将PCR产物加入10μL 6×DNA上样缓冲液，后进行核酸电泳。在紫外灯下小心切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶，将其预先称重的干净的EP管重，再次称量计算切下的琼脂糖的重量(约100mg)。加入三倍质量的Buffer QG，置于50℃金属浴中孵育10min，每隔2min中 轻轻震荡一次，待凝胶完全溶解。加入一倍体积的异丙醇于凝胶中混匀。将QIA快速吸附柱置于2ml离心管中。将凝胶溶液移入QIA快速吸附柱中，17,900×g离心1min，如果体积大于800μL，分两次移入并离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。将吸附柱中加入500μL Buffer QG，17,900×g离心1min，弃滤液。加入750μL Buffer PE离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。再次离心吸附柱17,900×g，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，将柱子于室温静置3min以彻底晾干。将吸附柱装入新的1.5ml离心管中。向吸附柱中间位置悬空滴加50μL Buffer EB，室温静置2min，17,900×g离心2min洗脱DNA溶液，-20℃保存用于后续酶切。

NSs目的基因片段与VR1012载体(武汉淼灵生物科技有限公司)的双酶切

酶切条件：37℃酶切90min，65℃灭活5min。加入6xDNA loading buffer 10μL于酶切产物中，混匀后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后用QIA快速琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。

NSs酶切产物与VR1012载体连接

将目的基因酶切产物与VR1012载体按摩尔比3:1轻轻混匀，室温连接2h，体系参照说明书。

连接产物的转化与阳性克隆的鉴定

将50μL DH5α感受态置于冰上10min，待其缓慢融化后，加入5μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。将EP管置于预先加温至42℃的金属浴中，热激90s，不要摇动管子。将管子快转移至冰上，静置2min，使细胞冷却。将每管中加入500μL无抗性的LB培养基，于37℃恒温摇床中孵育45min，使细菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。用涂布棒将菌液涂在带有卡那霉素抗性的固体培养板中，待菌液完全吸收后，倒放在37℃培养箱中过夜培养。取500μL含有卡那霉素抗性的LB培养基加入1.5mlEP管中，挑取平板上的单菌落，置于EP管中，于37℃恒温摇床中220rpm摇2～4h。然后进行菌液PCR鉴定。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。得到SFTSV、SFSV非结构蛋白NSs表达载体。

提取重组质粒

将鉴定出的阳性克隆对应的细菌培养液接种到含有5ml含有抗性的LB培养基中过夜培养。保藏菌种。取500μL过夜培养的菌液于1.5ml的EP管中，加入等体积的灭菌的50％甘油，混匀后，菌种保藏于-80℃冰箱留用。柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12,000rpm(～13,400×g)离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复操作步骤k。将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

去内毒素质粒大量制备

取100ml过夜培养的菌液，室温10,000rpm(～11,500×g)离心3min收集细菌。尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入10ml溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器悬浮细菌细胞沉淀使其充分冲悬。向离心管中加入10ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5min。向离心管中加入10ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。10,000rpm(～11,500×g)离心10min，使白色沉淀离至管底，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇和1/2倍异丙醇体积的5MNaCl，上下颠倒充分混匀。4℃，10,000rpm(～11,500×g)离心30min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。向管中加入6ml 70％乙醇充分漂洗沉淀，4℃，10,000rpm(～11,500×g)离心10min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。将离心管敞口室温放置20min，使乙醇充分挥发后加入1.5ml洗脱缓冲液TB，充分溶解沉淀。DNA产物--SFTSV和SFSV非结构蛋白NSs表达质粒保存在-20℃，留作后续转染使用。

实施例2、细胞培养，转染，干扰素启动子活性检测

细胞培养

1)293T细胞(CRL-3216^TM)的培养

293T细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养，待长满后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约2-3min后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心机1200rpm，3min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一种回培养瓶中，剩余传至24孔细胞培养板。

2)HeLa细胞(CCL-2^TM)的培养

HeLa细胞培养于含有10％FBS，1％青-链霉素的DMEM液体培养基，置于37℃，含5％C02的培养箱中孵育培养。约2～3天后，用含0.25％EDTA的胰酶消化，约3-5inin后，加入10％FBS的新鲜培养基终止，室温离心机1200rpm，3min，弃上清，取适量新鲜培养基重悬后，三分之一置于培养瓶中继续培养，剩余传至24孔细胞培养板。。

仙台病毒(VR-907^TM)培养

1)鸡胚的准备

选择SPF级10日龄的鸡胚(梅地亚维通实验动物技术有限公司)，用照蛋器标记出气室， 在气室下方血管明显的区域中，两血管之间的间隙做好标记，作为接种部位；用75％酒精擦两遍，并擦干后进行消毒，在接种部位处打孔，气室朝上竖放于蛋架上。

2)病毒接种材料的准备。无菌注射器，弯头镊子高压湿热灭菌处理。

3)尿囊腔内注射接种：用6号针头的1ml注射器吸取仙台病毒，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5-1cm，注入200μL，用胶布贴封小孔，再加融化的固体石蜡封口，放回孵化箱中进行孵育，每天翻蛋两次，观察一次，24小时内死亡的舍去。

4)收获病毒。仙台病毒材料，在接种48小时后收获。收获前应将鸡胚放置4℃冰箱冷藏过夜，以免解剖时血管破裂，75％酒精消毒蛋壳，用镊子剥去卵壳和尿囊膜，用移液器小心吸尿囊液于离心管内，可收集8ml，3000rpm离心30min，除去杂质，分装后置于-80℃保存。

细胞转染及双报告基因检测

293T细胞接种到24孔板中，培养细胞12h左右待细胞长至70％～80％汇合度后进行转染。使用TransLipid HL转染试剂将SFTSV、SFSV NSs表达质粒或对照载体VR1012分别与0.5μg pIFN-β-luc质粒(系将人IFN-β全长启动子插入至pGL3-Luc(Promega)载体构建而成)和0.5ng pRL-TK(武汉淼灵生物科技有限公司)质粒混合，稀释于50μL，Opti-MEM培养基中；将3μLTransLipid HL稀释于50μLOpti-MEM培养基中，室温静置5min。将上述两者和轻轻混合，室温静置20min。将质粒-TransLipid HL混合物加入24孔板中的293T细胞中，共同转染293T细胞，转染24h后，加入仙台病毒(SEV，20HA/ml)刺激，病毒刺激18h后收集细胞。离心并弃上清培养液，用PBS轻轻漂洗两次，每孔加入100μL 1×passive lysis buffer(取1ml 5×passive lysis buffer加入4ml去离子水中，混匀)，置于室温旋转摇床中室温裂解30min，使其充分裂解。将细胞完全裂解液用移液器移入EP管，8.000rpm离心5min。取40μL上清液加入96孔板。按照Dual-luciferase-assay(Promeg,Cat No:E1910)标准操作步骤，使用LB960多功能检测仪检测报告基因数值，分析通过firefly luciferase/renilla luciferase处理后数据，即为报告基因活化值。

免疫印迹(Western-Blot)

样品制备

转染后48h的24孔板细胞，弃掉上清培养液，用1ml PBS(取8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，Tween-20 1ml，加水至1L，保存于室温)将293T细胞吹起，收集细胞到1.5mlEP管中。8000rpm离心5min，弃上清。加入80μLRAPI，20μL 5×SDS上样缓冲液，用移液枪反复吹打，使细胞裂解完全。95℃加热30min，涡旋震荡后8000rpm离心5min。-40℃保存备用。

Western-Blot

将已经制备好的变性蛋白样品按顺序加入12％聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，每孔10μL，在不用的样品孔中加入1×SDS凝胶上样缓冲液。将电泳装置与电源连接，90V跑30min，待样品跑至积层胶与分离胶界面处加大电压至120V继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。电泳结束后，取出玻璃板，撬开玻璃板，切去上层积层胶。将预先裁剪好的NC膜、转膜滤纸放在盛有1×半干转膜缓冲液的培养皿中浸泡。将转膜滤纸置于底层，NC膜置于转 膜滤纸上，蛋白胶放在NC膜之上，最后于NC膜上加盖一层转膜滤纸。将滤纸和NC膜组成的三明治放入半干转膜仪中，注意NC膜靠近正极，蛋白胶在上靠近负极。转膜条件为18V，25min。转膜结束后，取出NC膜，用5％牛奶封闭液封闭60min。抗HA标签(Sigma)或抗Tublin(Sigma)抗体作为一抗孵育，4℃过夜孵育。过夜孵育后，用PBST洗膜三次，每次10min。然后，连接相应辣根过氧化物酶标记二抗(Abcam)，孵育一小时。之后用PBST洗膜三次，每次10min。将ECL显色液按1:1混合均匀后，滴加到NC膜上，避光反应3min，放入、Chemi Doc TM XRS+凝胶成像仪中显色。

统计学分析

数据平均值和标准误差通过GraphPad Prism(5.01版本)分析处理得到。所有实验至少重复3次，所有数据都通过T检验计算P值，P值小于0.05时认为有统计学意义。

实施例3、SFTSV SFSV NSs抑制IFN-β启动子活性

按指定步骤进行细胞转染、荧光双报告分析及蛋白质印迹等实验(方法同实施例2)

将200ng RIG-I-Flag质粒(Addgene)与200ng VR1012载体、50ng SFTSV NSs和500ng SFSV或NSs分别共转染293T细胞，同时转染500ng IFN-β-Luc以及50ng pRL-TK质粒。转染后48小时，用双报告基因检测方法检测报告基因的表达。NSs蛋白表达水平通过Western-Blot结果如图1显示。双报告基因检测结果显示病毒的NSs蛋白明显抑制了RIG-I诱导的β干扰素启动子的活化，该结果也说明NSs蛋白抑制宿主I型干扰素的产生。

实施例4、SFTSV SFSV NSs诱导RIG-I-Flag降解

按指定步骤进行细胞转染、荧光双报告分析及蛋白质印迹等实验(方法同实施例2)

将200ng RIG-I-Flag质粒(Addgene)与200ng VR1012载体、50ng SFTSV NSs和500ng SFSV NSs分别共转染293T细胞，同时转染500ng IFN-β-Luc以及50ng pRL-TK质粒。转染后48小时，用双报告基因检测方法检测报告基因的表达。NSs蛋白表达水平通过Western-Blot结果如图2显示。双报告基因检测结果显示病毒的NSs蛋白明显抑制了RIG-I诱导的β干扰素启动子的活化，在SFTSV、SFSV NSs表达时，细胞内RIG-I-Flag水平明显降低，提示SFTSV、SFSV NSs诱导RIG-I降解。

实施例5：MLN4924抑制SFTSV SFSV NSs介导的RIG-I降解

按指定步骤进行细胞转染、荧光双报告分析及蛋白质印迹等实验(方法同实施例2)

为了探究RIG-I降解是否依赖于Cullin-Ring E3 ligase(CRL)酶的蛋白质泛素化降解途径，我们分析在加入MLN4924，NSs对细胞水平的RIG-I的表达的影响。200ng RIG-I-Flag质粒分别与VR1012,50ng SFTSV NSs或500ng SFSV NSs共转染293T细胞。转染后36小时，培养液中补加MLN4924至终浓度为200nM。12小时后，Western-blot检测细胞RIG-I和NSs蛋白表达。结果如图3所示：经MLN4924处理后，相比于未经处理(图3，左)，MLN4924明显稳定了RIG-I在细胞中的积累(图3，右)。可以看到无论有无NSs蛋白，细胞内RIG-I-Flag水平基本一致。结果提示：NSs介导的RIG-I降解被NLM4924有效抑制。

实施例6、MLN4924抑制细胞内SFTSV复制

293T细胞或HeLa细胞于24孔细胞培养板培养。待细胞密度达到70-80％时，细胞计数。SFTSV HB29株以1MOI感染上述细胞。第一组细胞中作为空白对照，第二组细胞染毒同时培养液中补加MLN4924至终浓度50nM；第三组染毒前1小时，培养液中补加MLN4924至终浓度200nM(图4)。上述三组细胞继续培养24小时或48小时，取培养上清100μl，用QiAamp Viral RNA Mini Kit,按其说明书，提取病毒RNA；一步法Real-time PCR检测培养上清中病毒含量。一步法Real-time PCR检测培养上清中病毒含量。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所检测。所用试剂：TaqMan Real-Time PCR Master Mixes(ThermoFisher,Cat No:4444557)，根据说明书操作；所用引物探针：

Real-time PCR所用引物探针见下表：

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 化合物MLN4924在制备布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒抑制剂的应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acgcgtcgac accatgtcgc tgagcaaatg ctcc 34

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgggatccct acgcgtaatc tgggacgtcg taagggtaga cctccttcgg gaggtcacc 59

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acgcgtcgac accatgatga acagccgata catgtttg 38

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgggatccct acgcgtaatc tgggacgtcg taagggtaaa agtcagaatc agacgagctc

60

tc 62

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acgcgtcgac accatgtctt acttcactat ccagaacgag 40

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgggatccct acgcgtaatc tgggacgtcg taagggtaca gtgatcctac gactggcc 58

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gggtccctga aggagttgta aa 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tgccttcacc aagactatca atgt 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ttctgtcttg ctggctccgc gc 22