这个专利申请要求cormedixinc.和robertdiluccio于01/11/2016提交的关于nanoparticlesystemforthetreatmentofneuroblastoma的未决在先美国临时专利申请序列号62/277,243(代理人案卷号cormedix-14prov)的权益，所述专利申请在此引入本文作为参考。
发明领域
本发明一般涉及治疗组合物，且更具体地涉及用于治疗神经母细胞瘤及其他癌症的治疗组合物。
发明背景
神经母细胞瘤(nb)是儿童期最常见的颅外实体癌以及婴儿期最常见的癌症，其中美国的发病率为每年约650例，并且英国的发病率为每年100例。所有神经母细胞瘤病例中近一半在2岁以下的儿童中发生。神经母细胞瘤引起神经内分泌肿瘤，起于交感神经系统(sns)的任何神经嵴单元。神经内分泌肿瘤最常在肾上腺之一中起源，但它也可以在颈部、胸部、腹部或骨盆的神经组织中发展。
神经母细胞瘤是已知展示从未分化状态到完全良性细胞外观的自发性消退的少数人恶性肿瘤之一。神经母细胞瘤是显示出极端异质性的疾病，并且分层为三个风险类别：低、中和高风险。低风险神经母细胞瘤疾病在婴儿中最常见，并且“良好结果”对于仅观察或手术是常见的，而高风险神经母细胞瘤疾病，即使用可获得的最强化的多模式肿瘤学疗法也难以成功治疗。
成感觉神经母细胞瘤，也称为嗅神经母细胞瘤，被认为起于嗅上皮，并且其分类仍存在争议。然而，因为它不是交感神经系统恶性肿瘤，所以成感觉神经母细胞瘤是独特的临床实体，并且不应与神经母细胞瘤相混淆。
体征和症状
神经母细胞瘤的第一个症状通常是模糊的，使诊断变得困难。疲劳、食欲不振、发烧和关节疼痛是常见的。症状取决于原发性肿瘤位置和转移(如果存在的话)。
•在腹部，肿瘤可能导致膨胀腹和便秘。
•胸部中的肿瘤可能引起呼吸问题。
•压迫脊髓的肿瘤可能导致虚弱以及无法站立、爬行或行走。
•腿部和臀部中的骨骼损伤可能导致疼痛和跛行。
•眼睛或眼眶周围的骨骼中的肿瘤可能导致明显的瘀伤和肿胀。
•骨髓浸润可能导致来自贫血的苍白。
在任何症状显而易见之前，神经母细胞瘤经常扩散到身体的其他部分，并且所有神经母细胞瘤病例中的50-60%呈现转移。
神经母细胞瘤起源的最常见位置(即原发性肿瘤的位置)位于肾上腺。这在40%的局限性肿瘤和60%的广泛性神经母细胞瘤疾病的病例中发生。神经母细胞瘤也可以沿着从颈部到骨盆的交感神经系统链的任何地方发展。不同位置中的频率包括：颈部(1%)、胸部(19%)、腹部(30%非肾上腺)或骨盆(1%)。在罕见情况下，无法分辨出原发性肿瘤。
罕见但特征性的呈现包括横贯性脊髓病(肿瘤脊髓压迫，5%的病例)、治疗抗性腹泻(肿瘤血管活性肠肽分泌，4%的病例)、homer综合征(宫颈肿瘤，2.4%的病例)、眼阵挛-肌阵挛综合征(opsocinusmyoclonussyndrome)和共济失调(疑似副肿瘤原因，1.3%的病例)、以及高血压(儿茶酚胺分泌或肾动脉压迫，1.3%的病例)。
原因
神经母细胞瘤的病因并未充分理解。绝大多数的病例是散发性和非家族性的。约1-2%的病例在家庭中发生，并且已与特定的基因突变关联。在某些情况下，家族性神经母细胞瘤由间变性淋巴瘤激酶(alk)基因中的罕见种系突变引起。phox2a或kif1b基因中的种系突变也已牵涉家族性神经母细胞瘤。神经母细胞瘤也是1型神经纤维瘤病(nf1)的特征，也称为冯-雷克林霍森病和伯-韦综合征。
肿瘤内的mycn癌基因扩增是神经母细胞瘤中的常见发现。扩增程度显示双峰分布：3至10倍、或100至300倍。这种突变的存在与晚期疾病高度相关(参考文献1)。
神经母细胞瘤肿瘤细胞内的lmo1基因的重复区段已显示增加发展侵袭性癌症形式的风险(参考文献2)。
神经母细胞瘤已与nbpf10基因内的拷贝数变异关联，其导致lq21.1缺失综合征或lq21.1重复综合征(参考文献3)。
已提出了神经母细胞瘤的几种危险因素，并且这些因素是正在进行的研究的主题。由于神经母细胞瘤的特征性早期发作，许多研究已集中于与受孕和妊娠有关的父母因素。调查的因素已包括职业(即特定产业中对化学品的暴露)、吸烟、饮酒、在妊娠期间使用医学药物和生育因素，然而结果尚无定论(参考文献4)。
其他研究已检查了与特应性和生命早期暴露于感染(参考文献5)，激素和生育药物的使用(参考文献6)，以及染发剂的母体使用的可能联系(参考文献7)。
生物化学
在约90%的神经母细胞瘤病例中，在尿或血液中发现儿茶酚胺或其代谢产物的水平升高。儿茶酚胺及其代谢产物包括多巴胺、高香草酸(hva)和/或香草扁桃酸(vma)(参考文献8)。
治疗
当神经母细胞瘤病变是局限性的时，它一般是可治愈的。然而，即使使用激进的多模式肿瘤学疗法，例如加强化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植、分化剂异维a酸(也称为13-顺式维甲酸)的使用、用抗gd2的免疫疗法、用抗gd2单克隆抗体疗法的免疫疗法等，18月龄以上的患有晚期疾病的儿童的长期存活很差。
已鉴定了生物学和遗传学特征，当加入经典临床分期时，所述特征已允许患者分配至风险组，用于规划治疗强度。这些标准包括患者的年龄、疾病传播的程度、显微镜外观和遗传特征，包括dna倍性和n-myc癌基因扩增(n-myc调节微rna)，并且用于将患者分类成低风险、中等风险和高风险疾病状态。最近的生物学研究(coganbl00b1)分析了2687名神经母细胞瘤患者，并且确定了风险分配谱：37%的神经母细胞瘤病例风险是低风险的，18%是中等风险的，并且45%是高风险的。存在一些证据，证明高风险和低风险类型由不同的机制引起，并且不仅仅是相同机制的两种不同的表达程度(参考文献9)。
关于这些不同风险类别的疗法非常不同。
•低风险疾病经常可以接受观察而完全没有任何治疗，或用单独的手术治愈。
•中等风险疾病用手术和化学疗法进行治疗。
•高风险神经母细胞瘤用加强化学疗法、手术、放射疗法、骨髓/造血干细胞移植、用13-顺式维甲酸(异维a酸或异维甲酸)的基于生物制品的疗法、以及通常与细胞因子gm-csf和il-2细胞因子一起施用的抗体疗法进行治疗。
对于目前的治疗，患有低风险和中等风险神经母细胞瘤疾病的患者具有极佳的预后，其中治愈率对于低风险高于90%，且对于中等风险为70-90%。相比之下，经过过去的二十年，用于高风险神经母细胞瘤的疗法已得到仅约30%的治愈率。抗体疗法的加入已显著提高了关于高风险神经母细胞瘤病的存活率。在2009年3月，具有226名高风险患者的儿童肿瘤学组(children'soncologygroup,cog)研究的早期分析显示，在干细胞移植后两年，随机接受chl4.18抗体(伴随gm-csf和il-2)的组中的66%存活且无疾病，相比之下，未接受所述抗体的组中仅为46%。随机化停止，因此入选试验的所有患者都接受抗体疗法(参考文献10)。
已发现组合使用的化疗剂针对神经母细胞瘤有效。通常用于诱导和干细胞移植调理的试剂是铂化合物(顺铂、卡铂)、烷化剂(环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、拓扑异构酶ii抑制剂)和长春花生物碱(长春新碱)。一些较新的方案包括诱导中的拓扑异构酶i抑制剂(拓扑替康和伊立替康)，已发现其针对复发疾病有效。
最近的重点是减少用于低风险和中等风险神经母细胞瘤患者的治疗，同时将存活率维持在90%。从1997年到2005年的nih研究nct00499616的具有儿童肿瘤学组部分的临床试验a3961中入选的467个中等风险患者的研究证实了对于这一风险组可以成功减少治疗的假设。具有有利特征(肿瘤等级和应答)的那些患者接受四个周期的化学疗法，并且具有不利特征的那些患者接受八个周期，其中三年无事件存活和总体存活对于整个组稳定在90%。未来的计划是加强对于具有1p36或11q23染色体畸变的那些患者、以及对治疗缺乏早期治疗应答的那些患者的治疗(参考文献11、12)。
相比之下，过去20年或更长时间的重点是加强用于高风险神经母细胞瘤患者的治疗。持续检查化学疗法诱导变异、手术时机、干细胞移植方案、各种放射递送方案、以及使用单克隆抗体和类视黄醇治疗最小残留疾病。已进行具有随机化的最近iii期临床试验，以改善高风险疾病的存活：
•1982-1985：欧洲神经母细胞瘤研究组(ensg1)入选了167名儿童，并且随机化到美法仑自体骨髓移植或无进一步疗法(未给予任何儿童放射疗法)。移植组和非移植组各自具有65名患者，并且最近的长期随访报告揭示，在超过1岁的年龄中，关于4期神经母细胞瘤显著更佳的5年无事件存活，在美法仑移植组相对于无进一步治疗中：分别为33%相对于17%(参考文献13)。
•1990-1999：欧洲研究(eu-20592或cclgnb-1990-11)随机化1岁以上的262名高风险儿童，并且揭示关于快速顺序诱导(10天周期)相对于具有相同总剂量的标准诱导(21天周期)的更高存活率。10年无事件存活分别为27%和18%，对于两个组均使用非激进的手术方法、无放疗和仅美法仑的自体骨髓或干细胞移植(参考文献14)。
•1991-1996：通过儿童癌症组(ccg-3891)进行对于379个高风险神经母细胞瘤患者的两次序贯随机化的iii期试验，其证实使用清髓性疗法(使用全身照射)和13-顺式维甲酸(异维甲酸)的改善存活，其中在该研究的四个组中各自具有50个患者(参考文献15)。
•1996-2003：德国(gpoh)研究nb97比较了随机化用于干细胞移植或巩固化学疗法的295个高风险神经母细胞瘤患者的后果。结果显示使用干细胞移植的存活增加(参考文献16)。
•2000-2006：最近的研究(cog-a3973)质疑对于cem-li(卡铂、依托泊苷、美法仑、伴随局部照射)移植的清除干细胞的需要，并且在研究中积聚了486个患者。没有发现清除干细胞改善存活率(参考文献17)。
•2000-2012：同时进行的研究(cog-anbl0032)在早期审查中确定抗体chl4.18与白细胞介素2和gmcsf(在德国gpohnb90和nb97中以较低剂量且不含细胞因子回顾性研究)改善存活率，且具有总共423个患者。随后的iii期研究cog-anbl0931于2010年1月开放，以积聚105个患者，以收集进一步的安全和功效数据用于fda批准(参考文献18)。
•2002-2008：siop(国际儿科肿瘤学会(internationalsocietyofpaediatriconcology))在1994年成立了欧洲siop神经母细胞瘤组(siopen)，并且在2002年激活了iii期高风险神经母细胞瘤方案(siop-europe-hr-nbl-1)，其使用“快速”cojec(以10天间隔给予的8个周期的化学疗法)，随后移植随机化至cem(卡铂、依托泊苷、美法仑)或bumel(白消安、美法仑)，并且修正了该研究，以将儿童随机化至chl4.18抗体治疗，伴随或不伴随皮下il2(不含如cog中给予的gm-csf)。该研究报告了生长因子(gcsf)的益处，并且所有患者都接受了视黄酸。该试验涉及1000个患者(每年175个)(参考文献18)。
•2005-2010：德国nb2004随机化包括在前期治疗中的mibg疗法和拓扑替康使用，并且涉及对于所有风险组的总共642个患者(大致一半为高风险的)。移植后，高风险方案涉及6个月的顺式维甲酸、3个月的中间休息、以及另外3个月的视黄酸(参考文献19)。
•2007年：cogiii期anbl0532试验在2007年12月开放，以积聚495个患者，并且与单次相对于串联移植相比，并且诱导用拓扑替康的两个周期开始(参考文献20)。
除这些iii期研究之外，一些研究机构还提供了试验性治疗方案。例如，st.jude完成了(2007年)在23个儿童中测试新的前期化学疗法方案，其包括伊立替康和吉非替尼，其中在干细胞移植后具有16个月的维持化学疗法，使用交替的经口13-顺式维甲酸和拓扑替康。纽约的memorialsloan-ketteringcancercenter提供了包括自20世纪80年代中期以来用于方案中的小鼠衍生的单克隆抗体3f8的治疗。该抗体用于治疗最小残留疾病或巩固而不是干细胞移植。在几个儿童肿瘤学组(cog)中心可用于新近诊断(高风险)儿童的新的试验性方案cog-anbl09p1提供了用于移植方案的mibg放疗和化学疗法(参考文献21)。
一些儿童(特别是在高风险病例中)完全不响应一线治疗(具有完全应答或非常良好的部分应答)，并且标记为难治性的。这些“难治性”儿童从一线疗法(临床试验)中去除，并且对于使用新疗法的临床试验是合格的。许多高风险儿童对一线疗法具有良好应答并且达到缓解，但后来疾病再发(复发)。这些儿童对于在临床试验中测试的新疗法也是合格的。
具有拓扑替康和环磷酰胺的化学疗法经常用于难治性环境和复发后。具有119名患者(比较单独的拓扑替康与拓扑替康和环磷酰胺)的随机化研究(2004年)揭示，在拓扑替康和环磷酰胺组中31%的完全或部分应答率，其中两年无进展存活为36%。伊立替康(静脉内或经口)和经口替莫唑胺也用于难治性和再发性神经母细胞瘤(参考文献22)。
许多i期和ii期试验目前正在测试针对儿童中的神经母细胞瘤的新试剂，所述儿童已复发或对初始疗法具有抗性。调查者目前正在研究单独的和新组合中的新试剂，使用小分子靶向疗法、131-imibg放射疗法、血管生成剂、新的单克隆抗体、疫苗、溶瘤病毒、以及新的清髓方案。
美国的16家儿童医院组，称为神经母细胞瘤治疗新进展(newadvancesinneuroblastomatherapy)(nant)联盟，协调i-131mibg放射疗法试验。nant联盟还提供了使用芬维a胺的经口粉末制剂、静脉内芬维a胺、双膦酸盐(zometa)和其他试剂，并且将i-131mibg与抑制剂伏立诺他组合的试验(参考文献23)。
其他研究组如神经母细胞瘤和髓母细胞瘤转化性研究联盟(theneuroblastomaandmedulloblastomatranslationalresearchconsortium)(nmtrc)也进行临床试验，以治疗复发性神经母细胞瘤。欧洲的机构正在研究治疗复发的新疗法，包括半相合干细胞移植。许多医院也进行了它们自己的机构研究。
认为蛋白质p53在对化学疗法的抗性的发展中起作用。2009年11月的小鼠研究显示，用新药nutlin-3激活肿瘤抑制因子p53可能减缓肿瘤生长。在这项研究中，比利时的ghentuniversityhospital的医生tomvanmaerken及其同事使用nutlin-3来中和mdm2，其为与p53蛋白结合并阻碍p53触发程序性细胞死亡的能力的蛋白质。早期的研究已显示nutlin-3可以特异性地预防mdm2使p53失去能力。
发明目的
已观察到药物牛磺罗定具有增强许多肿瘤药物活性的能力。
因此，本发明的一个目的是利用牛磺罗定对这些肿瘤药物的协同作用，以便允许与肿瘤药物相关的更高效率和减少毒性。
本发明的另一个目的是产生包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)的纳米颗粒，由此提供一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的同时递送，从而利用牛磺罗定对这些肿瘤药物的协同作用。
本发明的另外一个目的是产生包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣的纳米颗粒，所述包衣配置为将一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定局部释放到癌症部位例如肿瘤。在本发明的一种优选形式中，包衣配置为防止一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定在递送到癌症部位例如肿瘤之前过早暴露于身体。这对于防止来自一种或多种肿瘤药物的不期望的副作用、牛磺罗定的过早水解等是重要的。在本发明的一种优选形式中，包衣包含可吸收的聚合物或脂质。
本发明的再一个目的是提供包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣的纳米颗粒，其中所述包衣配置为将纳米颗粒靶向癌症(例如，肿瘤)的部位，以便改善肿瘤药物和牛磺罗定用于治疗癌症的功效。在本发明的一种优选形式中，所述包衣包含结合分子，其配置为靶向将纳米颗粒递送至特定组织。
另外，本发明的另一个目的是提供特别配置用于治疗神经母细胞瘤和/或其他特定癌症的纳米颗粒。
一般而言的牛磺罗定
牛磺罗定(双(1,1-二氧代全氢-1,2,4-噻二嗪基-4)-甲烷)具有抗微生物和抗脂多糖性质。它衍生自氨基酸牛磺酸。据报道，它的免疫调节作用通过巨噬细胞和多形核白细胞的引发和活化介导。
牛磺罗定已用于治疗患有腹膜炎的患者，并且作为患有全身炎症反应综合征的患者中的抗内毒素试剂。它是对于严重的腹部败血症和腹膜炎的救命抗微生物剂。牛磺罗定针对广泛范围的微生物是活性的，所述微生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、分枝杆菌(mycobateria)以及对各种抗生素抗性的细菌，如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)、万古霉素中度敏感的金黄色葡萄球菌(visa)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(vrsa)、苯唑西林抗性金黄色葡萄球菌(orsa)和万古霉素抗性肠球菌(vre)。另外，牛磺罗定展示一些抗肿瘤性质，其中在使用该药物治疗胃肠道恶性肿瘤和中枢神经系统肿瘤的早期临床研究中见到阳性结果。
牛磺罗定是用于预防和治疗导管相关血流感染(crbsi)的抗微生物封管液的活性成分，并且适用于所有基于导管的血管通路装置。在各种研究中从未观察到针对牛磺罗定的细菌抗性。
牛磺罗定通过非选择性化学反应起作用。在水溶液中，母体分子牛磺罗定与氧氢噻二嗪(taurultam)和n-羟基甲基氧氢噻二嗪形成平衡，并且牛磺酰胺(taurinamide)是下游衍生物。牛磺罗定的活性基团是氧氢噻二嗪和牛磺酰胺的n-羟甲基衍生物，其与细菌细胞壁、细胞膜和蛋白质以及内毒素和外毒素的伯氨基反应。微生物被杀死，并且所产生的毒素被灭活；破坏时间在体外为30分钟。当牛磺罗定用作封管液时，促炎细胞因子和增强的肿瘤坏死因子(tnf)水平减少。
牛磺罗定通过破坏菌毛和鞭毛来降低细菌和真菌对宿主细胞的粘附，并且因此防止生物膜形成。
每4小时，经2小时静脉内给予5g牛磺罗定的剂量，进行至少48小时，用于治疗各种败血症状况。
在涉及使用肿瘤药物的下述应用中已观察到牛磺罗定的协同活性
karlisch等人(参考文献24)观察到tnf相关的凋亡诱导配体(trail)和牛磺罗定对人横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤和上皮样细胞肉瘤中的凋亡和增殖的作用。软组织肉瘤(sts)是一组异质的恶性肿瘤，代表成人中所有恶性肿瘤的1%。用于sts的疗法应该是个体化和多模式的，但具有明显边缘的完整手术切除仍然是治疗的支柱。播散性软组织肉瘤仍代表治疗困境。常用的化学治疗剂如多柔比星和异环磷酰胺已被证明在这些病例中的少于30%中是有效的。因此，karlisch等人测试了tnf相关的凋亡诱导配体(trail)和牛磺罗定对横纹肌肉瘤(a-204)、平滑肌肉瘤(sk-lms-1)和上皮样细胞肉瘤(va-es-bj)细胞系的凋亡和抗增殖体外作用。通过facs分析(碘化丙啶/膜联蛋白v染色)定量活力、凋亡和坏死。通过dna微阵列分析基因表达，并且通过rtpcr对于所选基因验证结果。通过蛋白质印迹分析记录蛋白质水平变化。通过溴脱氧尿苷(brdu)elisa测定分析细胞增殖。单一物质trail和牛磺罗定显著诱导横纹肌肉瘤和上皮样细胞肉瘤细胞中的凋亡细胞死亡和增殖降低。trail和牛磺罗定的组合使用导致所有三种细胞系中的协同凋亡效应，尤其是在横纹肌肉瘤细胞中，在温育48小时后留下18%的活细胞(p<0.05)。差异调节基因的分析揭示牛磺罗定和trail影响凋亡途径，包括tnf-受体相关的线粒体途径。微阵列分析揭示各种基因中的显著表达变化，所述基因涉及不同的凋亡途径并且在多个水平下与其他途径串扰。该体外研究证实trail和牛磺罗定在不同的人sts细胞系中协同诱导凋亡和抑制增殖。对基因表达的作用在肉瘤实体相应地不同。这些结果提供了用于评价trail和牛磺罗定在sts中的效应的体内试验的实验支持，并且维持个体化治疗的方法。
harati等人(参考文献25)观察到trail和牛磺罗定增强多柔比星、曲贝替定和马磷酰胺在ht1080人纤维肉瘤细胞中的抗癌活性。由于缺乏有效的细胞抑制剂，播散性纤维肉瘤仍代表治疗困境。因此，观察到与关于人纤维肉瘤(ht1080)确认的和新的化学治疗剂组合的、肿瘤坏死因子(tnf)相关凋亡诱导配体(trail)和牛磺罗定改善凋亡。
材料和方法：将人纤维肉瘤细胞(ht1080)与单独的以及与牛磺罗定和trail组合的多柔比星、马磷酰胺和曲贝替定一起温育。使用流式细胞术分析定量活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。使用溴脱氧尿苷(brdu)elisa测定分析细胞增殖。
结果：多柔比星和曲贝替定的单一应用诱导凋亡细胞死亡，并且显著减少ht1080细胞的增殖。在组合治疗中，当与单一治疗相比时，牛磺罗定和trail的添加导致细胞活力程度中的更强烈减少。曲贝替定和牛磺罗定展示比单独的多柔比星更大的用于抑制增殖的潜力。
结论：当与trail和牛磺罗定组合使用时，用多柔比星和牛磺罗定的治疗展示更强的凋亡诱导和抗增殖效应。
martinotti等人(参考文献26)研究了用于治疗恶性间皮瘤的协同抗坏血酸-药物组合的体外筛选。恶性间皮瘤(mme)是由于暴露于石棉而起于浆液腔的间皮的致死性肿瘤。目前的临床研究由组合治疗组成，但尚未建立有效的疗法，并且存在对于新治疗方法的迫切需要。抗坏血酸是同样已知作为癌症治疗中的药物的营养素。在该研究中，martinotti等人测试了与mme疗法中使用的药物(例如顺铂、依托泊苷、吉西他滨、伊马替尼、紫杉醇和雷替曲塞)，以及有希望的抗肿瘤化合物(如牛磺罗定、a-生育酚琥珀酸酯和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(egcg))组合的抗坏血酸盐对mme细胞的细胞毒性。通过对体外生长的mme细胞应用中性红摄取(nru)测定对于每种化合物获得的剂量-应答曲线，允许对于单独使用的每种化合物测量ic50值。其后，通过在ic50水平下的tallarida的等效线图(tallarida，2000)分析从每种抗坏血酸/药物组合获得的nru数据，揭示了关于抗坏血酸/吉西他滨和抗坏血酸/egcg的协同相互作用。通过使用chou和talalay的组合指数(chou和talalay，1984)，通过理论加和性ic50与从固定比率剂量-应答曲线观察到的ic50之间，以及遍及广泛范围的ic水平的比较，进一步证实了这些结果。通过分别使用半胱天冬酶3和乳酸脱氢酶测定检查凋亡和坏死率也显示协同相互作用。因此，数据指示抗坏血酸/吉西他滨和抗坏血酸/egcg展示对mme细胞活力的协同影响，并且提示它们在这种有问题的癌症的临床治疗中的可能用途。
daigeler等人(参考文献27)观察到牛磺罗定和trail对食管鳞状癌细胞的协同凋亡作用。用于食管癌的治疗选择是考虑手术切除，但治疗后20个月时的中值存活率是令人沮丧的。辅助或新辅助放疗或化学疗法的益处是有限的，并且迄今为止，仅确定了对于某些肿瘤阶段的益处。因此，需要新的治疗选项。作为替代的化疗药物，daigeler等人对kyse270人食管癌细胞测试了单独以及与rhtrail(重组人tnf相关的凋亡诱导配体)组合的抗生素牛磺罗定。通过tunel测定显现活力、凋亡和坏死，并且通过facs分析进行定量。通过rna微阵列分析基因表达。作为单一物质的牛磺罗定的最有效浓度(250mmol/l)在12小时剂量后诱导凋亡至40%的最大值，在48小时后留下4%的活细胞；相比之下，rhtrail没有显著效应。两种物质的组合使单独的牛磺罗定的效应加倍。基因表达概况分析揭示牛磺罗定下调内源性trail、tnfrsf1a、tradd、tnfrsf1b、tnfrsf21和fadd，以及map2k4、jak2和bcl2、bcl211、apafl和半胱天冬酶-3。tnfrsf25、细胞色素-c、半胱天冬酶-1、-8、-9、jun、gadd45a和nfkbia被上调。trail减少内源性trail、bcl211和半胱天冬酶-1表达。birc2、birc3、tnfaip3和nfkbia被上调。组合的物质上调内源性trail、nfkbia和jun，而dffa和traf3与作为单一物质的牛磺罗定相比是下调的。daigeler等人得出结论认为，牛磺罗定克服了kyse270细胞中的trail抗性。协同作用取决于相同的和不同的凋亡途径，其共同触发，导致扩增的应答。几种凋亡途径，包括tnf-受体相关和线粒体途径，通过所述物质在基因表达水平下差异调节。另外的转录因子看起来受到影响，特别是nfkb。所述物质的组合增加内源性trail表达，而每种单一物质则使其减少。考虑到无毒的牛磺罗定能够减少rhtrail的毒性和剂量，具有牛磺罗定和rhtrail的组合疗法可提供用于食管癌中的治疗的新选项。
chromik等人(参考文献28)观察到牛磺罗定和rhtrail对于hct15结肠癌细胞中的凋亡诱导的协同作用。在肿瘤细胞中通过trail(tnf相关的凋亡诱导配体)诱导凋亡是肿瘤学中有希望的治疗选项，尽管毒性和针对trail的抗性是限制因素。牛磺罗定是具有低毒性的抗肿瘤剂，并且因此是用于与trail的组合疗法的潜在候选物。chromik等人研究的目标是评估trail和牛磺罗定在hct15人结肠癌细胞系中的组合治疗。将hct15细胞培养且与渐增浓度的重组人trail(50至500ng/ml)或牛磺罗定(50至1000mmol/l)一起温育，以评估两种物质关于凋亡和坏死的剂量依赖性效应。其后，在第二个实验中，将细胞与单独的trail(50和250ng/ml)或牛磺罗定(100和1000mmol/l)以及以不同浓度的两种试剂的组合一起温育。在不同的时间点(3至36小时)，通过用碘化丙锭和膜联蛋白v染色的facs分析来定量细胞活力、凋亡和坏死。结果以平均值表示，通过anova进行统计分析，通过tukey检验进行配对比较。p值<0.05视为统计学显著的。与牛磺罗定一起温育导致剂量依赖性细胞死亡诱导，其中100mmol/l和1000mmol/l在24小时和36小时后具有最大效应，导致活细胞从60%减少到17-33%。250ng/ml和500ng/mltrail在早至6小时导致活细胞从70%降低到6-7%，并且在36小时后活细胞部分恢复至13%。牛磺罗定(100mmol/l)和trail(50ng/ml)的组合治疗在24小时和36小时后引起凋亡的持续诱导，显示两种物质的显著协同效应，明显超过简单的相加效应。与关于单独的牛磺罗定100mmol/1的43.9%和trail50ng/m的17.7%相比，与牛磺罗定(100mmol/l)和trail(50ng/ml)一起温育24小时后，仅2.1%的细胞是活的。在36小时后获得类似的结果。chromik等人首次显示了重组人trail和牛磺罗定在体外对人结肠癌细胞的凋亡诱导的协同作用。使用trail和牛磺罗定的组合治疗导致持续的细胞死亡，这优于单一试剂应用。trail与无毒牛磺罗定的组合在肿瘤治疗中提供了新的治疗原理。
braumann等人(参考文献29)观察了在经历剖腹手术的带结肠癌大鼠中使用牛磺罗定和牛磺罗定/肝素的局部和全身化学疗法。在恶性腹部肿瘤的治疗中的实验研究已显示，不同的细胞毒性剂压制腹膜内(i.p.)肿瘤生长。然而，不存在预防肿瘤再发的普遍接受的方法。在104个结肠腺癌细胞(dhd/k12/trb)的皮下(s.c.)和i.p.注射后，在经历正中线剖腹手术的105只大鼠中调查了牛磺罗定或牛磺罗定/肝素两者对i.p.和s.c.肿瘤生长的影响。将动物随机分成7组，并且在30分钟内进行手术。为了调查牛磺罗定或肝素对肿瘤生长的i.p.(局部)影响，应用所述物质。在i.v.注射所述物质后评估i.p.全身和i.p.效应。两种应用形式也组合以分析协同效应。在干预后4周测定肿瘤重量以及腹部伤口转移的发生率。为了评估试剂的效应，采集血液以确定外周白细胞计数。当与对照组(中值185mg)相比时，接受牛磺罗定(中值7.0mg，p=0.05)和牛磺罗定/肝素(中值0mg，p=0.02)的i.p.应用的大鼠中的i.p.肿瘤生长显著减少。两种试剂的同时滴注也减少了i.p.肿瘤生长(中值4mg，p=0.04)，而所述物质的i.v.注射没有造成局部效应。相比之下，s.c.肿瘤生长在所有组中并无不同。在所有组中，腹部伤口再发是罕见的且并无不同。不依赖于试剂和应用形式，手术本身引起在手术后不久的轻微白细胞减少，以及在随后的过程中的白细胞增多。牛磺罗定或与肝素组合的i.p.疗法抑制经历正中线剖腹手术的大鼠中的局部肿瘤生长和腹部伤口再发。i.p.或i.v.应用或两种试剂的组合都不影响s.c.肿瘤生长。这些物质不改变外周血白细胞的变化。
stendel等人(参考文献30)观察到牛磺罗定增强fas配体介导的程序性细胞死亡。发现牛磺罗定对脑肿瘤细胞具有直接和选择性的抗肿瘤作用。调查了牛磺罗定在不同的恶性神经胶质瘤细胞系中通过增强fas介导的凋亡发挥抗肿瘤作用的能力。
材料和方法：培养人来源的u373细胞，并且与牛磺罗定一起温育，且计算中值抑制浓度(ic50)。执行流式细胞术分析，以评价dna含量中的变化。使用光学显微镜检查和电子显微镜检查，对细胞进行定性和定量检查。在fas配体、牛磺罗定或其各自组合的不存在或存在下，温育ln-18和ln-229细胞。通过添加双倍浓缩的wst-1试剂测定细胞活力。在elisa读数器中测量线粒体琥珀酸还原酶的活性。
结果：0373细胞暴露于牛磺罗定导致浓度依赖性(ic5035.8+2.2mg/ml)的细胞活力丧失。流式细胞术分析证实在亚g0/g1区域内的dna碎片的浓度依赖性出现。在6.25体积%的fas配体的存在下，ln-18细胞展示多于90%的细胞活力丧失，而ln-229细胞的活力仅在较高浓度的fas配体下减少。在所调查的浓度范围内，单独的牛磺罗定并不明显影响ln-18细胞的活力，但能够增强fas配体对ln-18细胞的作用。在测试的最高浓度下，ln-229细胞暴露于单独的牛磺罗定造成约70%的细胞活力的可观丧失。在牛磺罗定的存在下，通过fas配体(10体积%)的细胞破坏得到增强。
结论：牛磺罗定的抗肿瘤活性看起来部分基于fas配体诱导的凋亡的增强。另外，牛磺罗定证实为具有不依赖于fas配体的抗肿瘤效应。可能牛磺罗定基于不同的机制发挥抗肿瘤活性。
在另一项研究中，braumann等人(参考文献31)评价了在腹腔镜检查期间牛磺罗定和牛磺罗定/肝素的腹膜内和全身应用对大鼠中的腹膜内(i.p.)和皮下(s.c.)肿瘤生长的影响。研究人员调查了在恶性肿瘤的腹腔镜切除后，门部位转移的问题和可能的病理机制。迄今为止不存在预防这些肿瘤植入的普遍接受的方法。在104个结肠腺癌细胞(dhd/k12/trb)的s.c.和i.p.注射后，在经历用二氧化碳的腹腔镜检查的105只大鼠中调查了牛磺罗定或牛磺罗定/肝素两者对i.p.和s.c.肿瘤生长的影响。然后将动物随机分成七组。使用二氧化碳建立气腹30分钟(8mmhg)。使用三个切口：用于吹气针的中线，以及用于套管针的下腹部的右和左入口。为了调查牛磺罗定和肝素对肿瘤生长的i.p.(局部)影响，将这些物质i.p.滴注。当所述物质i.v.应用时，预期全身效应。当两种应用形式组合时，测试协同影响。在干预后4周确定肿瘤的数目和重量，以及腹壁和门部位转移的发生率。采集血液以评估牛磺罗定和肝素对全身免疫反应的影响：腹腔镜检查前7天、术后2小时、2天、7天和4周，并且测定外周淋巴细胞。当与对照组(52mg)相比时，i.p.接受牛磺罗定(中值7mg)和牛磺罗定/肝素(0mg)的大鼠中的i.p.肿瘤重量显著降低(p=0.001)。组之间的s.c.肿瘤生长没有区别(p=0.4)。与对照组(10/15)相比，当牛磺罗定i.p.(3/15)、i.p.i.v.(4/15)以及与肝素组合i.p.(4/15)应用时，套管针再发率降低。干预后不久，治疗组和未治疗组显示外周淋巴细胞减少。用牛磺罗定以及与肝素的组合的i.p.治疗抑制i.p.肿瘤生长和套管针再发。i.p.或全身应用或牛磺罗定和肝素的组合都不减少s.c.肿瘤生长。干预引起淋巴细胞减少，其在第二天得到补偿。
monson等人(参考文献32)观察到牛磺罗定抑制肿瘤坏死因子(tnf)毒性，以及tnf和内毒素协同作用的证据。重组肿瘤坏死因子(tnf)在实体瘤治疗中的使用已受到危及生命的毒性限制。另外，tnf可能是内毒素效应的主要介质。最近的证据提示内毒素(在皮克水平下)和tnf之间的协同作用可以促成这种毒性。抗内毒素牛磺罗定的使用可以通过干扰这种协同作用来减少tnf毒性。c57/bl6小鼠(n=140)接受毒性剂量(12微克/小鼠iv)的tnf。研究了四个组。a组在tnf前30分钟接受牛磺罗定(200mg/kgiv)，b组接受tnf，随后在30分钟后接受牛磺罗定(200mg/kgiv)，c组在tnf前30分钟接受相同体积(0.5ml)的生理盐水，并且d组在tnf前45分钟接受牛磺罗定(200mg/kgip)。在tnf前30分钟接受静脉内牛磺罗定的那些小鼠的死亡率为8.8%。这显著低于(p<0.005)b组、c组和d组中实现的死亡率(33%相对于39.4%相对于50%)。采用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑基-2-微升)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)测定的进一步实验显示，这不是由于牛磺罗定与tnf的直接相互作用，而可能是由于干扰内毒素和tnf的协同效应。
在鼠模型的联合疗法研究中也证实了牛磺罗定并未减少tnf针对tnf敏感性小鼠纤维肉瘤细胞系meth-a肉瘤的抗肿瘤功效。
牛磺罗定与用于治疗神经母细胞瘤的药物的协同活性
eschenburg等人(参考文献33)观察到牛磺罗定与抗肿瘤药物在神经母细胞瘤细胞中协作。在神经母细胞瘤中，第4阶段疾病的后果仍然很差，并且因此迫切需要开发新型治疗方法。已知抑制导管感染的牛磺罗定已在各种癌症中显示出抗肿瘤活性。如最近证实的，神经母细胞瘤细胞系的生长被牛磺罗定抑制。进一步分析公开了牛磺罗定对四种神经母细胞瘤细胞系sh-eptet21n、sk-n-as、sk-n-be(2)-m17和sk-n-sh的显著负生长作用。检测到的ic50(51-274mm；48小时)是有价值的，并且对应于临床上可实现的血浆水平。通过内部和外部途径的同时激活介导的时间依赖性方式诱导凋亡(76-86%；48小时)。这通过半胱天冬酶-3、-8和-9的切割以及通过泛半胱天冬酶抑制的凋亡取消而得到证实。牛磺罗定的应用导致细胞毒性药物长春新碱/多柔比星的显著增强(4种细胞系中的2/3)，使得牛磺罗定成为将来待包括在神经母细胞瘤治疗方案中的有希望的候选者。
eschenburg等人(参考文献33)还观察到牛磺罗定在体外特异性地抑制神经母细胞瘤细胞系的生长。牛磺罗定的抗肿瘤性质已在各种人癌细胞上得到证实。然而，缺乏关于神经母细胞瘤的数据。因此，eschenburg等人试图评估牛磺罗定对神经母细胞瘤细胞系生长的作用。
材料和方法：神经母细胞瘤sk-n-be(2)-m17和sk-nsh细胞以及非恶性人脐静脉内皮细胞(作为对照)与渐增浓度的牛磺罗定(100、250、500mm)一起温育。在暴露12、24和48小时后检查细胞生长。
结果：在两种恶性细胞系中均观察到通过牛磺罗定的细胞生长抑制。当与人脐静脉内皮细胞相比时，神经母细胞瘤细胞系对牛磺罗定明显更敏感。
结论：在sk-n-be(2)-m17和sk-n-sh中观察到的高度独特的对细胞生长的负面影响，说明了牛磺罗定特异性作用模式，其看起来取决于在细胞和分子水平下的差异。进一步调查是有根据的，以评估其机制和可能的临床用途。
发明概述
本发明利用了牛磺罗定与各种肿瘤药物的协同性质。更具体地，本发明包括纳米颗粒的提供和使用，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)的纳米颗粒，由此提供所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的同时递送，从而利用牛磺罗定对这些肿瘤药物的协同作用。
在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣，所述包衣配置为将所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定局部释放到癌症部位，例如肿瘤。在本发明的一种优选形式中，所述包衣配置为防止所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定在递送到癌症部位(例如肿瘤)之前过早暴露于身体。这对于防止来自所述一种或多种肿瘤药物的不期望的副作用、牛磺罗定的过早水解等是重要的。在本发明的一种优选形式中，包衣包含可吸收的聚合物或脂质。
另外，在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣，其中所述包衣配置为将所述纳米颗粒靶向癌症(例如，肿瘤)的部位，以便改善所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定用于治疗癌症的功效。在本发明的一种优选形式中，所述包衣包含结合分子，其配置为将所述纳米颗粒靶向递送至特定组织。
另外，在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒特别配置用于治疗神经母细胞瘤和/或其他特定癌症。
在本发明的一种优选形式中，提供了治疗性纳米颗粒，其包含：
至少一种肿瘤药物；和牛磺罗定，
由此提供了所述至少一种肿瘤药物和牛磺罗定的同时递送，从而利用牛磺罗定对所述至少一种肿瘤药物的协同作用。
在本发明的另一种优选形式中，提供了用于治疗癌症的方法，该方法包括：
提供治疗性纳米颗粒，其包含：
至少一种肿瘤药物；和牛磺罗定；并且
将治疗性纳米颗粒递送至身体，以便提供所述至少一种肿瘤药物和牛磺罗定的同时递送，从而利用牛磺罗定对所述至少一种肿瘤药物的协同作用。
优选实施方案的详细描述
本发明利用了牛磺罗定与各种肿瘤药物的协同性质。更具体地，本发明包括纳米颗粒的提供和使用，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)的纳米颗粒，由此提供所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的同时递送，从而利用牛磺罗定对这些肿瘤药物的协同作用。
在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣，所述包衣配置为将所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定局部释放到癌症部位，例如肿瘤。在本发明的一种优选形式中，所述包衣配置为防止所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定在递送到癌症部位(例如肿瘤)之前过早暴露于身体。这对于防止来自所述一种或多种肿瘤药物的不期望的副作用、牛磺罗定的过早水解等是重要的。在本发明的一种优选形式中，所述包衣包含可吸收的聚合物或脂质。
另外，在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒包含一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定，连同或不连同另外的赋形剂(例如缓冲液，以便提供牛磺罗定和/或所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性)，并且进一步包含包衣，其中所述包衣配置为将所述纳米颗粒靶向癌症(例如，肿瘤)的部位，以便改善所述一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定用于治疗癌症的功效。在本发明的一种优选形式中，所述包衣包含结合分子，其配置为将所述纳米颗粒靶向递送至特定组织。
另外，在本发明的一种优选形式中，所述纳米颗粒特别配置用于治疗神经母细胞瘤和/或其他特定癌症。
更具体地，本发明通过将牛磺罗定和各种肿瘤药物包封在特定的纳米颗粒系统中，利用牛磺罗定与各种肿瘤药物的协同性质，所述纳米颗粒系统设计为将所述肿瘤药物和牛磺罗定局部释放到癌症部位，例如肿瘤。
许多可吸收的聚合物系统可以用于优化肿瘤药物和牛磺罗定的释放性质，尤其是由衍生自聚合物的共聚物和多聚体的组合产生的那些，所述聚合物由l-丙交酯、乙交酯、e-己内酯、对二氧环己酮和三亚甲基碳酸酯构造。这些也可以与二醇如聚乙二醇(peg)结合，所述聚乙二醇可以是线性或多臂结构。
含有纳米颗粒中的牛磺罗定、肿瘤药物和聚合物的系统的优化得到用于一般而言的癌症且特别是神经母细胞瘤的改善治疗。
另外，研究已显示大麻素对神经母细胞瘤n型钙通道、甘氨酸受体通道和电压门控钾通道的活性。认为这些中的每一种对于神经组织都是特异性的，并且不认为其存在于网状内皮系统(res)细胞中。因此，提供具有结合分子的纳米颗粒以靶向神经组织(例如，神经母细胞瘤n型钙通道、甘氨酸受体通道和电压门控钾通道)增强了纳米颗粒对神经组织的靶向递送，并且因此增强了肿瘤药物的有效性(其通过协同性牛磺罗定的存在得到进一步增强)。
通常，重要的是纳米颗粒的结合分子没有其他显著的生物活性。为了实现特异性结合而无其他显著生物活性，利用单克隆抗体的片段抗原结合(fab)片段(其是抗体上与抗原结合的区域)。然而，因为最近描述了起因于抗电压门控钾通道抗体的严重自身免疫性脑炎的综合征，所以优选不使用抗电压门控钾通道抗体(例如，kvr)作为靶。其他靶也报告了自身免疫性脑炎作为副肿瘤综合征的病因的病例。迄今为止，这些靶中无一像kvr疾病一样严重，但这可能是由于随机机率。因此，必须小心选择用于靶向神经组织的结合分子。
在本发明的一种优选形式中，用于纳米颗粒的包衣包含针对n型钙通道的单克隆抗体(例如，抗n型钙通道外面fab片段)，用于使纳米颗粒与神经组织(例如，神经母细胞瘤肿瘤)结合，使得一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定(经由靶向纳米颗粒)同时递送至神经组织，其中牛磺罗定对于所述一种或多种肿瘤药物提供协同效应，由此提供所述一种或多种肿瘤药物针对靶向神经组织的增强功效。
在本发明的一个特别优选的形式中，掺入用于纳米颗粒的包衣中的抗n型钙通道外面fab片段包含cav2.2或其结合等价物。
因此，在本发明的一种形式中，提供了在适当的缓冲液中含有细胞毒性化学治疗药物和协同性牛磺罗定的纳米颗粒，以便提供牛磺罗定和/或一种或多种肿瘤药物和牛磺罗定的增强的水解稳定性。所述纳米颗粒的表面是脂质包膜或聚合物，其调节所述化学治疗药物和协同性牛磺罗定的释放性质。所述纳米颗粒的表面优选包括结合分子以靶向神经组织。
应了解，本发明提供了可以用于治疗患者中的神经母细胞瘤的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含化学治疗药物和协同数量的牛磺罗定，其中所述化学治疗药物和牛磺罗定包封在调节所述化学治疗药物和牛磺罗定的释放性质的聚合物中。
优选实施方案的修改
应当理解，本领域技术人员可以对本文中为了解释本发明的本质而描述且示出的细节、材料、步骤和部件布置进行许多另外改变，同时仍保留在本发明的原理和范围内。
参考文献